基于靶標誘導滾環(huán)擴增的無標記適配體生物傳感器快速檢測赭曲霉毒素A

方鵬，王帥，毛瑜，劉長虹

（合肥工業(yè)大學食品與生物工程學院，安徽合肥 230009）

赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）是由青霉素屬和曲霉素屬的某些真菌在適宜條件下代謝產(chǎn)生的有害真菌毒素，其在赭曲霉毒素中具有最大毒性[1]。OTA對動物具有致癌性、基因毒性和誘變作用[2]，國際癌癥研究機構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）將其指定為2B 類潛在致癌物[3]。OTA 廣泛存在于各種農(nóng)作物和加工類食品中，對食品安全產(chǎn)生了嚴重威脅[4]?；谏V的OTA 傳統(tǒng)檢測方法雖然具有精確和靈敏的特性，但其設備昂貴、樣品處理繁瑣和檢測時間長[5?7]。目前最常用的OTA 快速檢測方法是酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme?linked immunosorbent assay，ELISA）。該方法具有檢測速度快、可攜性強的特點[8?10]，但其使用的抗體容易受到環(huán)境因素的影響，難以儲存和運輸[11]，而且OTA 作為一種小分子毒素，具有較低的免疫原性，難以得到相應的優(yōu)異抗體[12]。在此基礎上，需要開發(fā)一種靈敏、實時、簡便的OTA 檢測方法。

適配體是一種新的識別元件，為OTA 的分析檢測提供了新的途徑，其原理是一條寡核苷酸單鏈（ssDNA或RNA）通過折疊形成特定的三維結(jié)構(gòu)并對靶標特異性識別[13?15]。適配體具有高親和力、高特異性和優(yōu)良的熱穩(wěn)定性，并且對靶標的識別能力與抗體相似。與抗體相比，適配體因具有成本較低、批量差異小、易于合成且穩(wěn)定性高的特性而被廣泛應用?；谶m配體的生物傳感器已經(jīng)逐漸應用于OTA 檢測，包括熒光、比色和電化學傳感器等[16?18]。相比其他傳感器，基于熒光的適配體生物傳感器具有操作簡單、成本低、高靈敏性等優(yōu)點[19?20]。但是許多基于熒光檢測的方法需要對適配體進行化學熒光修飾，這極大地影響了適配體對靶標的特異性識別，因此迫切需要開發(fā)一種特異性強、靈敏性高、成本低的無標記適配體檢測方法。

SYBR Gold 是一種具有良好生物相容性的核酸染料，可與適配體結(jié)合，增強檢測的熒光信號[21?23]。因此可以結(jié)合SYBR Gold 增強熒光信號的特點，構(gòu)建一種靈敏性高、特異性強的OTA 適配體生物傳感器。由于在各種擴增反應策略中，包括雜交鏈反應（hybridiza?tion chain reaction，HCR）、聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）、鏈置換擴增（strand displacement amplification，SDA）、解旋酶依賴性擴增（helicase?de?pendent amplification，HDA）和滾環(huán)擴增（rolling circle amplification，RCA），RCA 因其恒溫和簡單高效的酶促反應而突出[24?25]。故RCA 擴增產(chǎn)生一個相當長的單鏈序列，可以與SYBR Gold 結(jié)合，產(chǎn)生強烈的熒光信號[26?28]。

為了建立無復雜化學標記的基于適配體的OTA檢測方法，本研究利用無標記DNA 探針建立一種簡化的熒光“開啟”適配體生物傳感器，用于高靈敏性和強特異性的OTA 檢測。該DNA 探針由OTA 適配體與RCA 引物兩部分組成，以OTA 適配體作為識別元件，RCA 引物作為RCA 的啟動元件，在OTA 存在的特定環(huán)境中，適配體區(qū)域優(yōu)先與OTA 特異性結(jié)合，探針自身結(jié)構(gòu)被打開，RCA 引物區(qū)域與環(huán)狀DNA 模板（circu?lar DNA template，CT）堿基互補從而啟動RCA，產(chǎn)生一條長的ssDNA，可以與SYBR Gold 結(jié)合產(chǎn)生熒光信號，從而實現(xiàn)快速、無標記、高靈敏性和強特異性的OTA 檢測，在食品安全檢測中具有良好的應用前景。該傳感器為無化學標記適配體生物傳感器的進一步開發(fā)和探索提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

OTA、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）：美國Sigma?Aldrich 公司；黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）、MgCl2、1×磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、吐溫?20：生工生物工程（上海）股份有限公司；嘔吐毒素（deoxynivalenol，DON）、三（羥甲基）氨基甲烷鹽酸鹽[Tris（hydroxymethyl）aminomethane hydrochloride，Tris?HCl]：山東源野生物科技有限公司；T4 多核苷酸激酶（T4 polynucleotide kinase，T4 PNK）緩沖液、T4 DNA 連接酶、T4 PNK、腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine?triphos?phate，ATP）、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy?ribonucleo?side triphosphates，dNTPs）、10×RCA 反應緩沖液、phi29 DNA 聚合酶（phi29 DNA polymerase，phi29 DP）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）：新英格蘭生物實驗室；SYBR Gold：美國賽默飛世爾科技公司；黑色96 孔板：北京蘭杰柯科技有限公司；可拆卸式96 孔板：美國康寧公司。以上所有試劑均為分析純。稻谷：市售。

不同長度的探針、環(huán)狀模板和連接模板的序列見表1。探針3′端包含不同長度的線性RCA 引物，用于與CT 的堿基互補配對，5′端具有固定堿基（nucleo?tide，nt），能特異性識別OTA 的適配體。

表1 不同長度的探針、環(huán)狀模板和連接模板的序列Table 1 Sequences of probes with different lengths，circular tem?plate，and ligation template

1.2 儀器與設備

紫外可見分光光度計（GENESYS 10S）、全自動酶標儀（Multiskan FC）：美國賽默飛世爾科技公司；凝膠成像儀（Tanon MINI SPACE 2000）：合肥吉象生物技術有限公司；全波長多功能酶標儀（Varioskan Flash）：繼圣（上海）醫(yī)療器械有限公司；手提紫外分析儀（ZF?5）：上海嘉鵬科技有限公司；電泳儀（DYY?6C）：北京六一生物科技有限公司；干式恒溫器（MK2000?2E）：杭州奧盛儀器有限公司；臺式高速冷凍離心機（H1?16KR）：湖南可成儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 CT 的制備

將1.5 nmol/L 的ssDNA 與20 U T4 PNK、1 mmol/L ATP 和1×T4 PNK 緩沖液在37 ℃下孵育40 min，然后將孵育后的混合物在95 ℃下加熱5 min 進行滅酶。將上述反應混合物與2μL 的100μmol/L DNA 模板（DNA template，LT）混合后將混合物在90 ℃下加熱3 min，在室溫下冷卻15 min。加入40 μL 10×T4 DNA 連接酶緩沖液（400 mmol/L Tris?HCl，100 mmol/L MgCl2，100 mmol/L DTT，5 mmol/L ATP，25 ℃，pH7.8）和2 μL T4 DNA 連接酶（5 U/μL），在室溫下孵育反應2 h，在90 ℃下加熱5 min 使連接酶失活。用無水乙醇在?40 ℃下沉淀CT 并通過12%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（denaturing polyacrylamide gel electrophoresis，dPAGE）對CT 進行濃縮純化，最后采用紫外分光光度計測定純化后CT 的吸光度A260并計算得出其濃度。CT 的計算公式如下。

式中：C為CT 的純化濃度，mmol/L；A260為CT 在吸收波長260 nm 處的吸光度；MW為CT 的分子量，μg/μmol；c為在1 mL、1 cm 光程標準比色皿中，260 nm 波長下吸光度為1 的寡核苷酸單鏈溶液的核酸濃度，33μg/mL。

1.3.2 OTA 的檢測方法

將3μL 400 nmol/L 探針和2μL 400 nmol/L CT 與2.5 μL 不同濃度的OTA 在7.5 μL 1×結(jié)合緩沖液[1×PBS（pH7.2）、1 mmol/L MgCl2和0.05%吐溫?20]中室溫孵育30 min。加入2 μL dNTPs、2 μL 10×RCA 反應緩沖液和0.2μL phi29 DP 啟動RCA 反應。RCA 擴增反應在30 ℃下進行30 min，在95 ℃下加熱15 min 進行滅酶。將所得產(chǎn)物加入70μL 1×結(jié)合緩沖液和10μL 10×SYBR Gold 混合液中，測量熒光強度（λex/λem=498/540 nm）。對照組除未添加靶標外，其余反應步驟相同。OTA 的熒光信號強度百分比計算公式如下。

式中：W為相對熒光強度百分比，%；F1為有靶標樣品的熒光強度；F2為無靶標樣品的熒光強度。

1.3.3 探針長度優(yōu)化

探針由36 nt 的適配體區(qū)域與不同長度的RCA 引物區(qū)域共同組成，其長度會影響適配體區(qū)域?qū)Π袠说奶禺愋宰R別。分別將3 μL 400 nmol/L 不同長度的探針（探針1、探針2、探針3、探針4 和探針5）與2.5μL 50 nmol/L OTA 和2 μL 400 nmol/L CT 混合，在7.5 μL 1×結(jié)合緩沖液中室溫孵育30 min。余下步驟與1.3.2相同，選擇相對熒光強度百分比最大的探針作為檢測方法的探針。

1.3.4 探針濃度優(yōu)化

探針濃度的高低會影響檢測方法的靈敏性，合適的探針濃度有利于OTA 適配體對靶標的特異性識別，產(chǎn)生更強熒光信號。稀釋探針1（36+8 nt）濃度為0、400、600、800、1 000 nmol/L，分別將3 μL 不同濃度的探針1 與2.5μL 50 nmol/L OTA 和2μL 400 nmol/L CT混合，在7.5μL 1×結(jié)合緩沖液中室溫孵育30 min。余下步驟與1.3.2 相同，選擇相對熒光強度百分比最大的探針濃度作為檢測方法的探針濃度。

1.3.5 孵育時間優(yōu)化

將3μL 400 nmol/L 探針1 和2μL 400 nmol/L CT與2.5μL 50 nmol/L OTA 在7.5μL 1×結(jié)合緩沖液中室溫孵育不同時間（0、15、30、45、60 min）。余下步驟與1.3.2 相同，選擇相對熒光強度百分比最大的孵育時間作為檢測方法的孵育時間。

1.3.6 RCA 時間優(yōu)化

RCA 時間過短會導致熒光信號值不明顯，時間過長會導致產(chǎn)物鏈過多，容易增加空間位阻不利于產(chǎn)物鏈與核酸染料的結(jié)合。將RCA 時間分別設定為15、30、45、60、120 min，將3μL 400 nmol/L 探針1 和2μL 400 nmol/L CT 與2.5μL 50 nmol/L OTA 在7.5μL 1×結(jié)合緩沖液中室溫孵育30 min。余下步驟與1.3.2 相同，RCA 反應不同時間，測定熒光值，選擇相對熒光強度百分比最大的RCA 時間作為檢測方法的RCA 反應時間。

1.3.7 靈敏性驗證

將2.5μL 不同濃度的OTA（6.6×10-4～660 nmol/L）與3 μL 400 nmol/L 探針和2 μL 400 nmol/L CT 混合，在7.5 μL 1×結(jié)合緩沖液中室溫孵育30 min。余下步驟與1.3.2 相同。對數(shù)據(jù)進行處理分析，確定線性方程、檢測限度和線性范圍。

1.3.8 特異性驗證

在上述參數(shù)優(yōu)化條件下，對常見真菌毒素DON、AFB1和ZEN 進行檢測，驗證OTA 適配體的特異性。將3μL 400 nmol/L 探針1 和2μL 400 nmol/L CT 與2.5μL 100 nmol/L 不同真菌毒素（OTA、ZEM、DON、AFB1）在7.5μL 1×結(jié)合緩沖液中室溫孵育30 min。余下步驟與1.3.2 相同，比較檢測不同真菌毒素的相對熒光強度百分比，確定該無標記適配體生物傳感器的特異性。

1.3.9 實際樣品檢測

在檢驗熒光無標記適配體生物傳感器的準確性之前，對市售稻谷樣品進行預處理。稱取2 g 稻谷樣品并使用粉碎機粉碎至粉末狀即可，加入5 mL 的80%甲醇，在1 500 r/min 下振蕩1 h，之后在5 000 r/min 下離心8 min。移取450μL 上清液于1.5 mL 離心管中，將OTA 加入到用1×結(jié)合緩沖液稀釋20 倍的樣品溶液中使其濃度為0.5、50 nmol/L，振蕩2 h 完全混勻。通過1.3.2 無標記適配體檢測方法和1.3.7 確定的線性方程對OTA 進行定量檢測分析，驗證無標記適配體傳感器的實用性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示（n=3）；采用Excel、IBM SPSS Statistics 20 和Origin 2021 等軟件處理和分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測原理

OTA 檢測的適配體傳感原理如圖1所示。

圖1 熒光適配體生物傳感器原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of the working principle of the fluorescent aptamer biosensor

由圖1 可知，基于由OTA 適配體與RCA 引物兩部分組成的雙功能探針、RCA 擴增和SYBR Gold 核酸染料，設計一種熒光無標記適配體生物傳感器。探針5’端適配體區(qū)域與靶標特異性結(jié)合，3’端引物區(qū)域可與CT 堿基互補。在OTA 存在的結(jié)合緩沖液環(huán)境中，適配體區(qū)域優(yōu)先與靶標結(jié)合，探針自身結(jié)構(gòu)被打開，RCA 引物區(qū)域可以自由地與CT 結(jié)合，由phi29 DP 啟動RCA。隨著RCA 的進行，產(chǎn)生了一個長的ssDNA反應產(chǎn)物，該產(chǎn)物可以與核酸染料SYBR Gold 結(jié)合，產(chǎn)生高熒光值信號。在沒有OTA 的情況下，RCA 引物與OTA 適配體雜交從而使RCA 反應受到抑制，熒光值信號降低。因此，通過檢測有無靶標的熒光信號的變化，可以達到快速檢測OTA 的目的。

2.2 探針長度的優(yōu)化

不同長度引物檢測的相對熒光強度見圖2。

圖2 不同長度引物檢測的相對熒光強度Fig.2 Effect of primer length on the relative fluorescence intensity

探針由固定堿基的OTA 適配體區(qū)域與不同長度的RCA 引物區(qū)域共同組成，引物區(qū)域作為RCA 反應的啟動元件，與該熒光適配體生物傳感器的信號輸出密切相關。從圖2 可以看出，隨著引物長度的增加，引物與適配體之間的相互作用增加，增加了適配體與靶標之間的競爭效應。此外，引物長度越長，沒有靶標的背景熒光信號越強，相對熒光強度百分比整體隨著引物長度的增加而逐漸降低。因此選擇8 nt 引物的探針1 長度（36+8 nt）作為最佳探針長度。

2.3 試驗條件的優(yōu)化

為了提升該適配體傳感器檢測的準確性和靈敏性，同時盡可能縮短檢測所需時間，需要對1.3.2 步驟中的試驗條件（包括探針濃度、孵育時間和RCA 時間）進行優(yōu)化，從而得到較為理想的OTA 適配體檢測傳感器，具體優(yōu)化結(jié)果見圖3～圖5。

圖3 探針濃度Fig.3 Concentration of probe

雙功能探針5′端的OTA 適配體可以與靶標特異性結(jié)合，并且3′端的RCA 引物區(qū)域與CT 堿基互補配對會直接影響RCA 的反應效率，因此需要優(yōu)化探針的濃度。如圖3所示，隨著探針濃度的增加，相對熒光強度百分比逐漸增加，在600 nmol/L 時達到最大值，當探針濃度超過600 nmol/L 時，相對熒光強度百分比緩慢下降。說明較低的探針濃度有利于RCA 產(chǎn)物的形成，過高的探針濃度使RCA 反應的產(chǎn)物鏈發(fā)生纏繞，空間位阻增加，RCA 產(chǎn)物與核酸染料的結(jié)合無效，導致靈敏性降低。因此，優(yōu)化后的探針濃度選擇為600 nmol/L。

由于不同孵育時間可能會導致靶標與探針特異性結(jié)合的量有差距，因此需要優(yōu)化孵育時間。如圖4所示，隨著孵育時間的延長，相對熒光強度百分比逐漸增加，30 min 后趨于穩(wěn)定。因此，確定30 min 為最佳孵育時間。

圖4 探針孵育時間Fig.4 Incubation time of probe

如圖5所示，在15～30 min，相對熒光強度百分比明顯增加，在30 min 之后，相對熒光強度百分比降低。這可能是因為RCA 反應產(chǎn)物的增加導致在30 min 內(nèi)與核酸染料結(jié)合更多，導致熒光信號增強，而由于RCA 時間高于30 min，RCA 產(chǎn)物鏈過長，空間位阻增大，不利于與核酸染料結(jié)合導致熒光信號減弱，因此，RCA 最適時間為30 min。

圖5 RCA 時間Fig.5 Rolling circle amplification（RCA）time

2.4 OTA 檢測的靈敏性分析

在優(yōu)化條件下，通過檢測不同濃度的OTA，驗證基于雙功能探針和RCA 擴增信號放大方法的熒光適配體生物傳感器的靈敏性，結(jié)果見圖6。

圖6 加入不同濃度的OTA 后的相對熒光強度Fig.6 Relative fluorescence intensity after addition of different concentrations of ochratoxin A（OTA）

從圖6 可以看出，相對熒光強度信號增強與OTA濃度密切相關，說明其具有較好的信號傳感機制，并且當OTA 濃度從6.6×10-2nmol/L 變化到660 nmol/L 時，相對熒光強度信號逐漸增強，與OTA 濃度呈線性相關。線性方程為y=5.722 58x+28.085 95（R2=0.995），檢測限度為6.6×10-2nmol/L。表2 總結(jié)了其他熒光檢測法的檢測限度和線性范圍。

表2 不同適配體傳感器對OTA 的檢測分析性能的比較Table 2 Comparison on analytical performance among different aptamer sensors for OTA detection

由表2 可知，本研究的適配體生物傳感器具有更好的靈敏性。

2.5 OTA 檢測的特異性

為研究探針是否能特異性檢測OTA，按照1.3.8 所提出的檢測方法對其他一些真菌毒素（AFB1、ZEN、DON）進行檢測。測試不同真菌毒素在相同濃度（100 nmol/L）下的檢測情況，結(jié)果如圖7所示。

圖7 檢測各種真菌毒素的相對熒光強度Fig.7 Relative fluorescence intensity of mycotoxins

由圖7 可知，OTA 適配體很難識別非特異性靶標，因此探針處于雜交狀態(tài)，RCA 引物區(qū)域不能自由地與CT 結(jié)合并啟動RCA 反應。以上結(jié)果表明，用于OTA 檢測的熒光無標記適配體生物傳感器具有合理的特異性，足以供實際應用。

2.6 在稻谷樣品中的檢測應用

為了研究所開發(fā)的OTA 適配體生物傳感器在實際樣品中的檢測性能，按照1.3.9 步驟對市售的稻谷樣品處理后進行OTA 檢測，結(jié)果見表3。

表3 稻谷樣品中OTA 的檢測Table 3 Detection of OTA in paddy samples

如表3所示，在實際稻谷樣品溶液中，0.5 nmol/L OTA 的回收率約為84%，50 nmol/L OTA 的回收率約為84%（回收率用OTA 檢測值/OTA 添加值表示）。上述結(jié)果表明，該檢測方法準確，適用于實際的稻谷樣品檢測分析。

3 結(jié)論

本研究中雙功能探針由RCA 引物與OTA 適配體兩部分組成，在OTA 存在的環(huán)境中，雙功能探針中適配體區(qū)域優(yōu)先與靶標特異性結(jié)合，探針自身結(jié)構(gòu)被打開，引物區(qū)域可以自由地與CT 堿基互補啟動RCA，產(chǎn)物鏈可以與核酸染料SYBR Gold 結(jié)合產(chǎn)生熒光信號，建立基于靶標誘導RCA 放大熒光信號的一種無標記適配體快速檢測OTA 的生物傳感器。結(jié)果顯示，該生物傳感器具有較高的特異性，檢測限低至6.6×10-2nmol/L，線性動態(tài)響應范圍寬至4 個數(shù)量級，且成功應用于稻谷樣品的分析檢測。該生物傳感器無需復雜化學標記、操作簡單、成本低，為食品安全現(xiàn)場快速檢測提供參考。