半抗原直接包被的四環(huán)素酶聯(lián)免疫吸附分析法的建立

張玉超，劉良禹，朱思潔，劉旭東*

（1.茅臺(tái)學(xué)院釀酒工程系，貴州仁懷 564507；2.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266071；3.茅臺(tái)學(xué)院食品科學(xué)與工程系，貴州仁懷 564507；4.貴州特色食品開發(fā)及綜合利用工程研究中心，貴州仁懷 564507）

四環(huán)素類（tetracyclines，TCs）抗生素主要包括四環(huán)素（tetracycline，TC）、金霉素（chlortetracycline，CTC）、土霉素（oxytetracycline，OTC）、環(huán)霉素（cyclamicin，DC）等類型，作為一種常見的廣譜類抗生素，TCs 常被應(yīng)用于人畜的各類疾病治療，也被加入飼料用于促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)[1]。TCs 在全球不同地區(qū)均有廣泛使用，在歐盟國(guó)家每年使用的抗生素中TCs 占有一半的份額；在美國(guó)TCs 也占據(jù)了抗生素市場(chǎng)1/5 左右的份額；我國(guó)是抗生素生成和使用的大國(guó)，每年TCs 的使用量可達(dá)6 000 t[2]。TCs 可以通過生產(chǎn)到消費(fèi)的各環(huán)節(jié)進(jìn)入環(huán)境水樣、土壤、動(dòng)物源性食品中，殘留的抗生素會(huì)導(dǎo)致耐藥基因的產(chǎn)生、改變微生物生態(tài)環(huán)境；同時(shí)由于食物鏈積累，也會(huì)對(duì)人體造成不可預(yù)計(jì)的危害[3?4]。因此歐盟標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)、美國(guó)食品與藥品管理局及我國(guó)農(nóng)業(yè)部對(duì)于TCs 的殘留量都作了一定的限制。以我國(guó)動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量（農(nóng)業(yè)部235 號(hào)公告）規(guī)定為例，TCs 在動(dòng)物奶、肌肉、肝臟、腎臟的殘留限量分別為100μg/L、100、300、600μg/kg[5?6]。因此，建立TCs 的檢測(cè)方法尤為重要。

目前對(duì)于TCs 的檢測(cè)方法主要有微生物法、儀器分析法、免疫分析法。微生物法可大批量的進(jìn)行樣本篩查，但耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低；儀器分析法準(zhǔn)確性好，但樣品前處理復(fù)雜、設(shè)備昂貴、需要專業(yè)人員進(jìn)行操作，并且難以做到高通量篩查[7?8]。免疫分析法利用抗原?抗體特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)，很好地彌補(bǔ)了其它兩種方法的不足，其中以酶聯(lián)免疫吸附分析法（enzyme?linked im?munosorbent assay，ELISA）為主導(dǎo)[9]。雖然對(duì)于TCs 的ELISA 檢測(cè)方法已有報(bào)道，但相關(guān)研究多采用TCs 多克隆抗體（polyclonal antibody，PAb）為檢測(cè)抗體，采用人工抗原作為包被抗原，通過疏水相互作用與酶標(biāo)板結(jié)合[10?11]。PAb 的均一性差、特異性較低；疏水相互作用可引起人工包被抗原的構(gòu)象改變，進(jìn)而影響半抗原的呈現(xiàn)和識(shí)別，這些均會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度下降、標(biāo)準(zhǔn)化難度增大[12?13]。因此建立均一性好、特異性高的TCs ELISA 檢測(cè)方法非常必要。

以TCs 最主要類型TC 為研究對(duì)象，制備TC 人工完全抗原，免疫BALB/c 小鼠，進(jìn)而制備抗TC 的單克隆抗體（monoclonal antibody，MAb），并采用酸性高錳酸鉀羧化酶標(biāo)板，將TC 直接包被在酶標(biāo)板上，并對(duì)ELISA 反應(yīng)體系條件進(jìn)行優(yōu)化，構(gòu)建一種半抗原直接包被的TC ELISA 檢測(cè)方法，以期為TC 的檢測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)6～8 周齡雌性BALB/c 小鼠：湖北省疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；SP2/0 細(xì)胞：武漢大學(xué)保藏中心。

TC、CTC、OTC、DC 標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）、血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）、卵清蛋白（ovalbumin，OVA）、福氏完全佐劑（freund′s complete adjuvant，F(xiàn)CA）、福氏不完全佐劑（freund′s incomplete adjuvant，F(xiàn)ICA）：美國(guó)Sigma?Aldrich 公司；二氧六環(huán)、HCl、NaNO2、H2SO4、明膠：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；脫脂奶粉：市售。0.01 mol/L pH7.4 磷酸鹽緩沖液（phosphate buff?ered saline，PBS）：南京建成生物工程研究所。其他試劑均為分析純。

DMEM（dulbecco′s modified eagle medium）培養(yǎng)基、HAT（hypoxanthine?aminopterin?thymidine medium）培養(yǎng)基、HT（hypoxanthine ?thymidine medium）培養(yǎng)基：美國(guó)Thermo 公司。

環(huán)境水樣隨機(jī)取自遵義市3 條河流近岸處；檢驗(yàn)合格的牛奶、雞肉樣品：市售；未經(jīng)合格檢驗(yàn)牛奶、雞肉樣品取自遵義市某養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

S?3100 紫外分光光度計(jì)：韓國(guó)Scinco 公司；ELX800 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀：美國(guó)Bio?tek 公司；5415R 低溫冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf 公司；Forma 311 型CO2恒溫培養(yǎng)箱：美國(guó)Thermo 公司；TS2 型倒置顯微鏡：日本Nikon 公司。

1.3 方法

1.3.1 ELISA 檢測(cè)相關(guān)試劑配制

利用1.1 中的PBS 溶液配制1%的BSA 溶液作為抗體稀釋液，配制0.05%的吐溫?20 溶液作為洗滌液；利用蒸餾水配制1%BSA、1%OVA、1%明膠、3%脫脂奶粉溶液作為封閉劑；配制2 mol/L H2SO4作為終止液。

1.3.2 TC 完全抗原的合成

TC 結(jié)構(gòu)中含有活性-NH2，可直接作為半抗原，利用TC 結(jié)構(gòu)中的-NH2將TC 與載體蛋白（BSA、OVA）連接即可形成大分子完全抗原。取444 mg TC 加入10 mL 二氧六環(huán)中，混合均勻后滴加10 mL 1mol/L HCl，待放熱完全冷卻后滴加1 mL 7%的NaNO2溶液，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)30 min，得溶液A；取0.2 mol/L pH9 的硼酸鹽緩沖液50 mL，加入300 mg BSA/OVA 制備蛋白質(zhì)溶液，得溶液B；將溶液B 加入溶液A 中，繼續(xù)攪拌反應(yīng)3 h 后，將反應(yīng)液6 000 r/min 離心5 min，將上清液置于透析袋中，于PBS（pH7.4，0.01 mol/L）中4 ℃透析72 h，每隔12 h 換液[14]。對(duì)所得的人工完全抗原（TC?BSA、TC?OVA）進(jìn)行紫外掃描，對(duì)蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 動(dòng)物免疫

取人工完全抗原100μg，溶于100μL PBS（pH7.4，0.01 mol/L）中，混合均勻后，加入等體積的FCA/FICA，混合均勻供免疫使用，參考文獻(xiàn)[15?16]對(duì)小鼠進(jìn)行多次頸背部皮下注射免疫。

1.3.4 抗血清效價(jià)和靈敏度的測(cè)定

免疫周期完成7 d 后，對(duì)小鼠斷尾取血，離心取抗血清，采用間接ELISA 對(duì)抗血清效價(jià)進(jìn)行測(cè)定，采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 對(duì)抗血清靈敏度進(jìn)行測(cè)定[17]，選擇抗血清效價(jià)和靈敏度最高的小鼠作為脾細(xì)胞供體進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞制備。

1.3.5 雜交瘤細(xì)胞的篩選及MAb 的制備

對(duì)小鼠進(jìn)行200 μg 的人工完全抗原腹腔注射免疫，3 d 后無菌條件下取小鼠脾細(xì)胞，利用聚乙二醇促進(jìn)脾細(xì)胞與SP2/0 細(xì)胞融合，融合后對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行HAT 培養(yǎng)基培養(yǎng)，隨后進(jìn)行特異性篩選，選取特異性最好的細(xì)胞孔進(jìn)行有限稀釋，再采用HT 培養(yǎng)基進(jìn)行克隆化，待陽性率達(dá)100%后用DMEM 培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)建立細(xì)胞株。收集長(zhǎng)勢(shì)良好的雜交瘤細(xì)胞注射進(jìn)入小鼠腹腔，12 d 后無菌操作收集小鼠腹水，對(duì)腹水進(jìn)行辛酸?硫酸銨法純化[17?18]。

1.3.6 TC 的包被

向酶標(biāo)板的孔中加入150 μL 5% 酸性KMnO4溶液，60 ℃放置1 h，對(duì)酶標(biāo)板進(jìn)行羧化；棄去孔內(nèi)溶液，加入200 μL 6 mol/L HCl，室溫振蕩清洗酶標(biāo)板5 min，重復(fù)3 次；最后再用純水洗板3 次；將TC 標(biāo)準(zhǔn)品用蒸餾水稀釋到一定濃度，每孔100 μL 4 ℃包被過夜[19]。

1.3.7 包被原的濃度和抗體稀釋倍數(shù)的確定

分別將濃度為1.000、0.500、0.250、0.125μg/mL 的TC 標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入羧化后的酶標(biāo)板中包被過夜。將MAb 用抗體稀釋液分別稀釋8 000、16 000、32 000、64 000、128 000、256 000、512 000 倍，進(jìn)行方陣滴定[20]。選取OD450值為1 左右的組合進(jìn)行靈敏度測(cè)定[17]，選取IC50值最小的組合為最佳組合。

1.3.8 ELISA 反應(yīng)條件優(yōu)化

在包被原濃度和抗體稀釋比已確定的條件下，對(duì)TC 檢測(cè)ELISA 競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系其他主要影響因素[反應(yīng)體系溫度（4、25、30、35、40 ℃）、反應(yīng)體系pH 值（6.4、7.4、8.4、9.4）、反應(yīng)體系封閉劑種類（1% BSA、1%OVA、1% 明膠、3% 脫脂奶粉）]進(jìn)行優(yōu)化，選取IC50值最小的條件作為TC 檢測(cè)ELISA 競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系的最佳條件。采用相同方法確定人工完全抗原包被ELISA競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系條件[17]。

1.3.9 ELISA 檢測(cè)TC 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將TC 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 ng/mL，采用構(gòu)建的半抗原包被和人工完全抗原包被的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系與TC MAb 進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，以競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)抑制率為縱坐標(biāo)，lg（10×TC 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度）為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.10 交叉反應(yīng)率的測(cè)定

利用TC 結(jié)構(gòu)類似物CTC、OTC、DC 標(biāo)準(zhǔn)品與TC MAb 進(jìn)行半抗原包被的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，進(jìn)行IC50值的測(cè)定，交叉反應(yīng)率（R，%）的計(jì)算公式如下。

R=（A/B）× 100

式中：A為TC 與TC MAb 進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)的IC50值，ng/mL；B為TC 結(jié)構(gòu)類似物與TC MAb 進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)的IC50值，ng/mL。

1.3.11 加標(biāo)回收率的測(cè)定

制作TC 含量為2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 ng/mL的加標(biāo)水樣，利用已構(gòu)建的半抗原包被和人工完全抗原包被的ELISA 檢測(cè)方法測(cè)定加標(biāo)樣品中TC 含量；將牛奶樣品8 000 r/min 離心10 min，去除上層脂肪層，再利用PBS 稀釋5 倍，消除基質(zhì)干擾后再添加TC[21]，制備TC 含量為2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 ng/mL 的加標(biāo)牛奶樣品，用已構(gòu)建的半抗原包被和人工完全抗原包被的ELISA 檢測(cè)方法測(cè)定加標(biāo)樣品中TC 含量，加標(biāo)回收率（M，%）的計(jì)算公式如下。

M=C1/C2× 100

式中：C1為TC 的檢測(cè)濃度，ng/mL；C2為TC 的加標(biāo)濃度，ng/mL。

1.3.12 實(shí)際樣品中TC 含量的測(cè)定

選擇不同環(huán)境水樣，檢驗(yàn)合格的市售不同品牌牛奶、雞肉樣品，未經(jīng)合格檢驗(yàn)的牛奶、雞肉樣品；牛奶樣品的前處理按照1.3.10 進(jìn)行，雞肉樣品前處理參照文獻(xiàn)[22]進(jìn)行，對(duì)所有樣品按所建立的半抗原包被的ELISA 法進(jìn)行TC 含量的檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用單因素方差分析結(jié)合Duncan 檢驗(yàn)分析差異性，差異顯著水平為P＜0.05，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)圖使用Graph?Pad Prism 8.0 生成。

2 結(jié)果與分析

2.1 TC 人工完全抗原紫外掃描鑒定

TC、BSA、OVA、TC?BSA、TC?OVA 紫外掃描圖見圖1。

圖1 TC、BSA、OVA、TC?BSA、TC?OVA 紫外掃描圖Fig.1 Ultraviolet absorbance spectra of TC，BSA，OVA，TC?BSA and TC?OVA

由圖1 可知，TC 的最大吸收峰位于275 nm 處，BSA 在225 nm 和280 nm 處有特征吸收峰，TC?BSA 的特征吸收峰處于240 nm 和285 nm 處，可見TC?BSA同時(shí)具有了TC 和BSA 類似的光吸收特性，同時(shí)最大吸收峰又有一定的偏移，出現(xiàn)了一定自身特性；OVA 在220 nm 和275 nm 處有特征吸收峰，TC?OVA 的特征吸收峰處于235 nm 和285 nm 處，偶聯(lián)情況與TC?BSA 類似，因此可判斷TC 與BSA、OVA 偶聯(lián)成功。

2.2 TC 抗血清效價(jià)和靈敏度的測(cè)定結(jié)果

不同小鼠抗血清效價(jià)和靈敏度見表1。

表1 TC 抗血清效價(jià)及靈敏度Table 1 Titers and sensitivity of antisera

由表1 可知，免疫周期完成后各只小鼠均產(chǎn)生了對(duì)TC 有一定特異性的抗血清，且以TC?BSA 作為免疫原、TC?OVA 作為包被原時(shí)，抗血清的效價(jià)和靈敏度普遍優(yōu)于TC?OVA 作為免疫原、TC?BSA 作為包被原的情況。其中5 號(hào)小鼠的TC 抗血清效價(jià)可達(dá)256 000，IC50值為128.24 ng/mL，相比于其它小鼠，該小鼠TC 抗血清的效價(jià)和靈敏度均為最優(yōu)，因此選擇該小鼠的脾細(xì)胞制備雜交瘤細(xì)胞。

2.3 雜交瘤細(xì)胞的選擇

通過初步篩選，選擇5 株陽性雜交瘤細(xì)胞（1D3、4C11、5H9、6B11、8A10）進(jìn)行ELISA 競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，結(jié)果見圖2。

圖2 雜交瘤細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)顯色變化Fig.2 Color changes in competitive reaction of hybridoma cells

由圖2 可知，隨TC 競(jìng)爭(zhēng)濃度的不斷提高，6B11 細(xì)胞株的OD450顯色下降變化最為明顯，說明該細(xì)胞株產(chǎn)生的MAb 對(duì)TC 的特異性最高。所以選擇該細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后用于小鼠腹水的制備。

2.4 包被原濃度和抗體稀釋倍數(shù)篩選

通過方陣滴定選擇出的包被原濃度和抗體稀釋倍數(shù)組合分別為0.125μg/mL、64 000，0.25μg/mL、128 000，0.250μg/mL、256 000，0.500μg/mL、128 000，1.000μg/mL、128 000，1.000μg/mL、256 000。以上述6 個(gè)組合作為待篩選的組合進(jìn)行ELISA 競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，測(cè)定各組合條件下的IC50。包被原濃度和抗體稀釋倍數(shù)篩選結(jié)果見圖3。

圖3 包被原濃度和抗體稀釋倍數(shù)篩選Fig.3 Screening of hapten coating concentration and antibody di?lution ratio

由圖3 可知，在半抗原包被濃度為1.000 μg/mL，抗體稀釋比256 000 時(shí)進(jìn)行ELISA 競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)的IC50值最低，說明在此組合條件下的ELISA 反應(yīng)體系靈敏度最高，因此選擇該組合條件作為競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系的最適包被原濃度和抗體稀釋倍數(shù)。

2.5 競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系條件優(yōu)化

競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系最適反應(yīng)溫度、pH 值、封閉劑的篩選結(jié)果見圖4、圖5、圖6。

圖4 最適反應(yīng)溫度篩選Fig.4 Screening of optimum reaction temperature

圖5 最適反應(yīng)pH 值篩選Fig.5 Screening of optimum reaction pH

圖6 最適反應(yīng)封閉劑篩選Fig.6 Screening of optimum reaction blocking agents

由圖4 可知，當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)溫度為30 ℃時(shí)進(jìn)行反應(yīng)體系的IC50值最低，說明在此反應(yīng)溫度下競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系靈敏度最高，因此選擇30 ℃作為競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系的最佳反應(yīng)溫度。同理可得，pH7.4、1% OVA 溶液作為封閉劑為競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系最適pH 值及最優(yōu)封閉劑（圖5、圖6）。因此綜合以上試驗(yàn)結(jié)果可知，半抗原包被的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系條件為包被原濃度1.000μg/mL、抗體稀釋倍數(shù)256 000、競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)溫度為30 ℃、pH7.4、以1%OVA 溶液作為封閉劑。

人工完全抗原包被構(gòu)建競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系可能會(huì)存在導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度下降的可能。因此，為了對(duì)比TC 半抗原直接包被與TC 人工完全抗原包被對(duì)檢測(cè)靈敏度的影響，本文利用所制備的TC MAb，采用同樣的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系構(gòu)建方法，確定TC 人工完全抗原TC?OVA包被的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系條件為人工完全抗原包被濃度為1.000μg/mL、抗體稀釋倍數(shù)256 000、競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系溫度25 ℃、pH7.4、以3%脫脂奶粉溶液作為封閉劑。

2.6 競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建

按照2.5 中所構(gòu)建的半抗原包被和人工完全抗原包被的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系，利用不同濃度TC 標(biāo)準(zhǔn)品與TC MAb 進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2。

表2 競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 2 Standard curve of competitive reaction

由表2 可知，兩種競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系均顯示出了良好的線性效果，半抗原包被和人工完全抗原包被的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系IC50值分別為9.26、28.24 ng/mL，檢測(cè)下限IC10值分別為0.306、0.624 ng/mL。在TC ELISA 檢測(cè)方法構(gòu)建研究中，雖然利用TC 直接進(jìn)行包被的研究還鮮有報(bào)道，但是在其它小分子化合物的檢測(cè)研究中，采用半抗原直接包被構(gòu)建競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系可以提高競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)靈敏度的情況已被逐漸證實(shí)[13，15，23?24]。本研究的結(jié)果同樣表明，在檢測(cè)抗體完全相同的情況下，TC 包被的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系與TC?OVA 包被的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系相比檢測(cè)靈敏度有了明顯的提高。

2.7 TC 結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)率測(cè)定

按照2.5 中所構(gòu)建的半抗原包被競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系，利用CTC、OTC、DC 標(biāo)準(zhǔn)品代替TC 標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，測(cè)定交叉反應(yīng)率，結(jié)果見表3。

表3 交叉反應(yīng)率測(cè)定Table 3 Cross?reaction rate

由表3 可知，所制備的TC MAb 與3 種TC 結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率均較小，說明本研究所制備的MAb對(duì)TC 特異性良好。

2.8 水和牛奶中加標(biāo)回收率測(cè)定

TC 殘留問題常出現(xiàn)在環(huán)境水樣和動(dòng)物源食品中，因此本文選擇水和牛奶進(jìn)行TC 加標(biāo)回收率測(cè)定，結(jié)果見表4 和表5。

表4 水和牛奶中加標(biāo)回收率（半抗原包被）Table 4 Recovery of tetracycline in water and milk（hapten coated）

表5 水和牛奶中加標(biāo)回收率（人工完全抗原包被）Table 5 Recovery of tetracycline in water and milk（artificial complete antigen coated）

由表4 和表5 可知，半抗原包被競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系水中TC 加標(biāo)回收率范圍為96.84%～102.50%，牛奶中TC加標(biāo)回收率范圍為96.46%～101.89%。人工完全抗原包被競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系水中TC 加標(biāo)回收率范圍為94.04%～105.56%，牛奶中TC 加標(biāo)回收率范圍為93.86%～105.12%。結(jié)果表明，半抗原包被競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系加標(biāo)回收率范圍窄于人工完全抗原包被競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系，說明TC 包被的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系檢測(cè)靈敏度高于TC?OVA 包被的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系。

2.9 實(shí)際樣品中TC 含量檢測(cè)

利用構(gòu)建的半抗原競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系對(duì)環(huán)境水樣、牛奶、雞肉中TC 含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表6。

由表6 可知，環(huán)境水樣樣品3、未檢驗(yàn)牛奶樣品1和未檢驗(yàn)雞肉樣品3 中有TC 檢出，其它樣品均未檢出TC，說明本方法可以用于實(shí)際樣品中TC 的檢測(cè)。

3 結(jié)論

為建立一種基于MAb 的半抗原直接包被的TC ELISA 檢測(cè)方法，本研究合成TC 完全人工抗原，并制備抗TC 的MAb，該MAb 對(duì)TC 特異性良好，與TC 結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)率低；并將TC 直接包被于修飾后的酶標(biāo)板上，進(jìn)行半抗原的直接包被，對(duì)ELISA 檢測(cè)體系反應(yīng)溫度、pH 值、封閉劑種類進(jìn)行優(yōu)化，建立的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系條件為半抗原包被濃度為1.000μg/mL，抗體稀釋比256 000，競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系溫度為30 ℃，pH7.4，以1%OVA 溶液作為封閉劑。該檢測(cè)方法最低檢測(cè)限IC10值為0.306 ng/mL，半數(shù)抑制率IC50值為9.26 ng/mL，牛奶和水中加標(biāo)回收率分別為96.46%～101.89%、96.84%～102.50%。與同等條件下建立的人工抗原包被的檢測(cè)方法（IC10值：0.624 ng/mL，IC50值：28.24 ng/mL，牛奶和水中加標(biāo)回收率分別為93.86%～105.12%、94.04%～105.56%）相比，檢測(cè)靈敏度有明顯的提高，并可用于實(shí)際樣品中TC 含量的檢測(cè)。