酶聯(lián)免疫吸附分析法應(yīng)用于戰(zhàn)場水環(huán)境TNT檢測的可行性研究

劉婧婷++譙華++馮孝杰++陳志莉

摘要：為了快速檢測戰(zhàn)場水環(huán)境中TNT含量以判斷水源可用性，提出了建立關(guān)于TNT的酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）。分析ELISA的建立要點：根據(jù)TNT分子結(jié)構(gòu)官能團(tuán)的可改造性提出了合成半抗原的3種方法；對應(yīng)3類半抗原采用不同蛋白偶聯(lián)方法合成3種人工抗原；分析動物體對TNT人工抗原可產(chǎn)生有效免疫應(yīng)答并可獲得滿足ELISA要求的抗血清；樣品前處理方法可滿足快速檢測要求。從理論證明建立TNT的ELISA并滿足檢測要求的可行性；同時，提出了利用此法檢測待解決和優(yōu)化的問題。

關(guān)鍵詞：TNT；水環(huán)境；酶聯(lián)免疫吸附分析法；半抗原；抗血清

中圖分類號：TJ41；X832 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）01-0125-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.01.032

Feasible Analysis about Detection of TNT Concentration in Battlefield Water Environment by Enzyme-linked Immunosorbent Assay

LIU Jing-ting，QIAO Hua，F(xiàn)ENG Xiao-jie，CHEN Zhi-li

（Dept. of National Defense Architecture Planning&Environmental Engineering，Logistic Engineering University of PLA，Chongqing 401311，China）

Abstract： To determine the availability of water sources by rapidly detecting the TNT concentration in battlefield water environment，the enzyme-linked immunosorbent assay of TNT was put forward. The key points of ELISA method were analyzed as below：three kinds of semi-antigen methods were proposed based on modification of TNT functional groups. Three artificial antigens were synthesized by employing different proteins coupling reactions corresponding to three kinds of semi-antigens. Artificial antigens of TNT stimulated animals to produce effective immune responses and produced antiserum to comply with requirements of ELISA. Sample pretreatment method was suitable for the rapid detection. Above research theoretically proved that the ELISA method was feasible and satisfactory for detecting TNT. Meanwhile，some problems urgently needed to be solved and optimized by the method were put forward.

Key words： trinitrotoluene； battlefield water environment； enzyme-linked immunosorbent assay； semi-antigen； antiserum

在現(xiàn)代化軍事行動中，為作戰(zhàn)部隊保質(zhì)保量提供生活用水是后勤保障系統(tǒng)職責(zé)所在。后勤工程學(xué)院于2002年自主研發(fā)的NJC2002-100/80凈水車是能滿足部隊執(zhí)行多樣化軍事任務(wù)時的應(yīng)急供水保障裝置。該凈水車可利用戰(zhàn)場環(huán)境中現(xiàn)有江河、湖泊水源就地取水，通過研發(fā)設(shè)計的水質(zhì)凈化程序使出水達(dá)到直飲水標(biāo)準(zhǔn)。但該凈化程序只可對未受污染水源進(jìn)行簡易的消毒凈化處理，而對于復(fù)雜戰(zhàn)場環(huán)境尤其是對于極可能受到彈藥污染水源則不能進(jìn)行有效的檢測判斷。因此，快速有效地檢測戰(zhàn)地水源水質(zhì)成為凈水車取用水與否的先決條件。

目前被廣泛用于各種軍隊裝置及軍事武器的爆炸性物質(zhì)主要有梯恩梯（TNT）、地恩梯（DNT）、黑索金（RDX）、奧克托今（HMX）等[1]，其中硝基芳烴類化合物TNT居彈藥用量首位，因此也是最為常見的戰(zhàn)場水源污染物質(zhì)[2]。TNT全稱為2，4，6-三硝基甲苯，又名對稱三硝基甲苯，是由甲苯經(jīng)過三段硝化而制成的，其分子式為C7H5N3O6，相對分子質(zhì)量227.13，結(jié)構(gòu)式見圖1。TNT屬高度危害毒物，水體濃度大于2 ng/mL時即可引起亞急性中毒、慢性中毒，給身體造成不可逆的損害。目前常用于TNT檢測的方法有質(zhì)譜[3]、離子遷移光譜[4-6]、表面等離子共振[7]、分子印跡聚合物[8，9]，熒光偏振法[10]，但大都存在前處理繁瑣，操作復(fù)雜，檢測時間長且成本高的問題。因此快速高效的現(xiàn)場檢測方法對戰(zhàn)場水環(huán)境即時分析顯得尤為重要。酶聯(lián)免疫吸附分析（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）作為一種高效的生物分析技術(shù)，因其反應(yīng)靈敏、特異性強(qiáng)、可進(jìn)行現(xiàn)場測定等優(yōu)點[11，12]，成為快速檢測目標(biāo)污染物的重要手段。本研究通過分析TNT的ELISA方法建立要點，討論該方法應(yīng)用于戰(zhàn)場水源環(huán)境中TNT檢測的可行性。

1 原理與方法

1.1 ELISA基本原理

ELISA作為常用的酶標(biāo)記免疫分析方法，是一種依賴抗原抗體特異性與酶高效催化反應(yīng)有機(jī)結(jié)合的綜合性檢測技術(shù)，原理是采用抗原與抗體的特異性反應(yīng)將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色的深淺進(jìn)行定量的測定[13]。因此利用目標(biāo)物質(zhì)TNT合成人工抗原后進(jìn)行動物免疫產(chǎn)生特異性抗血清是方法建立的關(guān)鍵，而后根據(jù)ELISA檢測步驟即可對經(jīng)過前處理的水環(huán)境樣品進(jìn)行檢測。

1.2 ELISA方法建立

1.2.1 半抗原合成 ELISA方法作為一種依賴抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)與酶高效催化反應(yīng)有機(jī)結(jié)合的綜合性檢測技術(shù)，關(guān)鍵在于制備出針對目標(biāo)物質(zhì)的抗血清。由于TNT半抗原屬于小分子物質(zhì)，不能引起動物免疫反應(yīng)，因此需要與載體蛋白質(zhì)偶聯(lián)以形成免疫原。另外TNT為對稱三硝基穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，不含與蛋白質(zhì)直接反應(yīng)的活潑官能團(tuán)，因此需先將其官能團(tuán)進(jìn)行氨基化、羥基化或羧基化，具體反應(yīng)可參考圖2，圖2中R代表TNT被取代硝基以外部分。

1.2.2 人工抗原合成 從上述TNT改造分子中選擇兩種或兩種以上分別作為ELISA方法的免疫原分子與包被原分子。結(jié)合TNT官能團(tuán)活化情況，分析采用活性酯法、戊二醛法、琥珀酸酐法等將其分別與不同的蛋白偶聯(lián)合成人工免疫原和包被原，如圖3所示，圖3中R代表TNT被取代硝基以外部分。目前常用的載體蛋白有牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）、兔血清白蛋白（Rabbit serum albumin，RSA）、鎖孔血藍(lán)蛋白（Keyhole limpet hemocyanin，KLH）及卵白蛋白（Ovalbumin，OVA）等。其中常用的KLH即血藍(lán)蛋白，具有很高的免疫性，蛋白本身會刺激動物體形成免疫應(yīng)答形成抗體，可能影響目標(biāo)物質(zhì)抗體純度；BSA與KLH相比較屬弱抗原化物的載體蛋白，它是最穩(wěn)定的可溶白蛋白，便于后期檢測偶聯(lián)效果；OVA可作為包被原蛋白以與免疫原蛋白進(jìn)行區(qū)別。趙晨等[10]在TNT的熒光偏振免疫檢測方法研究中，將TNT羧基化后采用活性酯法與BSA成功進(jìn)行偶聯(lián)合成人工抗原TNT-BSA。

1.2.3 抗血清制備 免疫原合成后按照表1流程進(jìn)行抗血清制備。選取新西蘭大白兔作為免疫主體，首次免疫后2周進(jìn)行加強(qiáng)免疫，而后每隔1周進(jìn)行1次加強(qiáng)免疫。有研究表明，采用該方法對動物體進(jìn)行關(guān)于2，2，4，4-四溴聯(lián)苯醚的人工抗原刺激免疫[14]，免疫效果良好，所得抗血清效價達(dá)到ELISA方法抗血清效價要求。為保證獲取高質(zhì)量抗血清，可將免疫原分子與不同載體蛋白質(zhì)偶聯(lián)合成數(shù)種免疫原進(jìn)行動物免疫，比較選取效價高、性質(zhì)穩(wěn)定的抗血清建立TNT的ELISA方法。趙晨等[10]制備的TNT-BSA抗血清達(dá)到工作濃度，證明動物體對TNT人工抗原具有免疫應(yīng)答性。

1.2.4 樣品前處理 由于ELISA方法所采用的抗血清是對目標(biāo)化合物進(jìn)行特異性識別，因此不需要富集分離等復(fù)雜的樣品前處理步驟。采集的水樣經(jīng)玻璃纖維濾紙過濾后，加入1∶1體積有機(jī)溶劑超聲后即可檢測。有研究表明采用此方法進(jìn)行多溴聯(lián)苯醚加標(biāo)環(huán)境樣品的前處理，回收率為66.20%～88.57%[14]。若環(huán)境樣品濃度過低，采用固相萃取小柱進(jìn)行萃取富集即可檢測[15]。

TNT作為目標(biāo)物質(zhì)具有可活化基團(tuán)，具備合成多種半抗原的基礎(chǔ)條件；TNT人工抗原可刺激動物形成免疫應(yīng)答，獲得抗血清效價可達(dá)到ELISA檢測要求；樣品前處理操作簡單快捷，目標(biāo)物質(zhì)回收率達(dá)到微量或痕量物質(zhì)檢測要求，滿足對戰(zhàn)場水環(huán)境快速準(zhǔn)確判斷要求。

2 待解決問題

所制備TNT抗血清除對TNT進(jìn)行特異性識別外，還可能與彈藥中常見的二硝基甲苯、硝基苯甲酸、多硝基甲酚、多硝基苯、多硝基酚等硝基芳烴類物質(zhì)結(jié)合，造成檢測結(jié)果偏高或是假陽性結(jié)果。因此，還需對上述物質(zhì)進(jìn)行交叉反應(yīng)率（CR）的檢測，計算公式為：交叉反應(yīng)率（CR）=（待測物IC50/類似物IC50）×100%。

ELISA方法根據(jù)酶催化產(chǎn)生的有色產(chǎn)物量形成的吸光度差異對待測物質(zhì)進(jìn)行定量分析，反應(yīng)的時間、孵育溫度等因素都會影響酶活性繼而導(dǎo)致顯色結(jié)果偏差[16]。因此，還需為適應(yīng)戰(zhàn)地復(fù)雜環(huán)境條件建立適應(yīng)性強(qiáng)、穩(wěn)定性高的檢測條件。

ELISA試劑盒是基于ELISA原理設(shè)計生產(chǎn)的小型成套分析裝置和試劑，可將TNT抗血清純化獲得TNT單克隆抗體用以研發(fā)便攜試劑盒，提高現(xiàn)場檢測能力。

3 小結(jié)

通過分析TNT的ELISA法建立原理與要點，分析得出利用該方法快速檢測戰(zhàn)地水源中TNT含量是可行的。但戰(zhàn)地環(huán)境復(fù)雜，仍需通過大量模擬測試進(jìn)行方法驗證，另外還有若干問題亟待解決和改進(jìn)，本研究僅為快速判斷戰(zhàn)場水源安全性提供一種新的檢測方法以供參考。

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