分子標記輔助選育具抗稻瘟病Pi2基因的水稻新恢復系

余鍵++呂德安++郭承亮++王世才

摘要：通過分子標記輔助選擇，將早秈稻材料中的廣譜抗稻瘟病基因Pi2通過雜交轉(zhuǎn)入到中秈稻恢復系中，經(jīng)過多代自交以及田間農(nóng)藝性狀的選擇和自然誘發(fā)稻瘟病抗性鑒定，培育出了30個新的抗稻瘟病恢復系株系。通過對F6代抗性優(yōu)良的株系與優(yōu)良兩系不育系C815S的大量雜交組合測配，選擇出了3個高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的新雜交組合，均比對照品種豐兩優(yōu)香1號增產(chǎn)5%以上，且對稻瘟病的抗性均優(yōu)于對照品種，具有廣闊的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：水稻（Oryza sativa L.）；稻瘟病；恢復系；Pi2基因；分子標記輔助選擇

中圖分類號：S511；S336 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）01-0013-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.01.004

Developing New Restorer Lines with Pi2 Blast Resistance Gene by Molecular Marker Assistance Breeding in Rice

YU Jian1，2，L？譈 De-an1，2，GUO Cheng-liang1，2，WANG Shi-cai1，2，GENG Yue-ming1，2

（1.Hubei Provincial Seed Group Co. Ltd.， Wuhan 430206， China；

2.Key Laboratory of India Rice Breeding and Seed Technology， Ministry of Agriculture， Wuhan 430206， China）

Abstract： In this research， we used molecular marker assistance breeding （MAS） to translate broad spectrum blast resistance gene Pi2 from early indica rice into restorer lines of medium indica rice. Through inbreeding of many generations，selection of good agronomic characters and identifying of the blast resistance under blast natural incidence，30 new restorer lines with blast resistance were cultivated. 3 new combinations with high yield， good quality were obtained from combinations between good two-line C815S and F6 excellent resistance restorer lines，and yields of these 3 combinations were higher than Fengliangyouxiang No.1 by more 5%，the blast resistance was also superior than control，which had extensive application prospect.

Key words： rice （Oryza sativa L.）； blast； restorer lines； Pi2 Gene； molecular marker assistance breeding

水稻（Oryza sativa L.）稻瘟病是由子囊菌[Magnaporthe grisea （Hebert） Barrnov.]引起的真菌性病害，在全世界80多個國家和地區(qū)都有發(fā)生[1]。稻瘟病是限制水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的主要因素之一，給中國水稻的產(chǎn)量帶來巨大的影響。20世紀90年代以來，中國稻瘟病的年發(fā)生面積在380萬～400萬hm2，造成稻谷年損失量達數(shù)億千克，嚴重時高達10億kg[2]。稻瘟病的變異性強，一般具有一定抗性的品種大面積推廣3～5年后就會出現(xiàn)抗性下降或喪失，給生產(chǎn)帶來極大的損失。長期的實踐證明，發(fā)掘廣譜、持久和穩(wěn)定的抗稻瘟病新基因和培育新抗病性品種是亟待解決的問題，也是最經(jīng)濟有效的防治措施。

截至2013年8月，已至少報道了68個抗稻瘟病位點共83個主效基因。這些基因分布在除第3染色體以外的其他11條染色體上（2個隱性，其他顯性）[3]，其中第6、11、12號染色體上的抗性基因多且成簇分布[4]，是3個最大的稻瘟病抗性基因簇。廣譜抗稻瘟病基因Pi2位于第6染色體短臂近著絲粒附近[5]，對從中國收集的792個稻瘟小種中的絕大部分表現(xiàn)抗性[6]。通過分子標記輔助選擇已經(jīng)在很多材料中得到應(yīng)用[7-9]。本研究通過雜交將早秈稻材料Z219中的抗稻瘟病基因Pi2轉(zhuǎn)入湖北省種子集團有限公司選育的7個品質(zhì)優(yōu)、配合力強的恢復系中，然后通過自交、分子標記輔助選擇和田間自然誘發(fā)抗性鑒定，選擇抗性好、農(nóng)藝性狀穩(wěn)定的株系與不育系進行組合測配，擬在選育出含Pi2基因的新的抗稻瘟病優(yōu)質(zhì)恢復系材料。

1 材料與方法

1.1 植物材料與選育方法

供體親本：早秈稻抗稻瘟病材料Z219，含有廣譜抗稻瘟病的Pi2基因。受體親本：優(yōu)質(zhì)中秈稻材料R201、R202、R203、R204、R205、R206和R207，都為湖北省種子集團有限公司自主選育。

從F2代開始結(jié)合分子標記輔助選擇和表型鑒定，選擇農(nóng)藝性狀優(yōu)良、田間稻瘟病抗性良好的陽性單株，在F5～F6代進行稻瘟病自然誘發(fā)抗性鑒定、組合測配及組合抗性鑒定。

1.2 分子標記輔助選擇

DNA的提取采用CTAB法；導入片段鑒定使用Pi2基因SSR標記RM527的序列合成引物。PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL，其中模板2 μL，去離子水12 μL，Buffer（10×）2 μL，Mg2+（25 mmol/L）1.8 μL，dNTP（5 mmol/L）1.8 μL，正反引物各0.2 μL，Taq酶0.2 μL。

擴增程序：95 ℃變性4 min；95 ℃變性30 s， 55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳，銀染檢測。

1.3 稻瘟病田間抗性鑒定

稻瘟病田間抗性鑒定設(shè)于湖北省宜昌市遠安縣茍家埡鎮(zhèn)望家鄉(xiāng)以及恩施自治州白果鄉(xiāng)兩河村稻瘟病自然誘發(fā)鑒定圃，采用誘發(fā)品種和偏氮施肥及淹水保持高濕管理等措施輔助誘發(fā)。每份材料插2行，每行10株，單本插，株行距17 cm×17 cm。順序排列，無重復。每組材料設(shè)抗、感品種和生產(chǎn)主栽對照品種各1個，供試材料及鑒定圃周圍種植感病誘發(fā)品種。

葉瘟病于分蘗盛期對供試材料逐株調(diào)查發(fā)病病級，然后加權(quán)平均為發(fā)病等級；穗頸瘟病于收獲前1周內(nèi)分別調(diào)查發(fā)病率和損失率（統(tǒng)計穗數(shù)不少于100穗），分級標準參照湖北省水稻區(qū)域試驗方法，即國家稻品種試驗與審定規(guī)范《水稻抗主要病蟲鑒定及評價標準試行方案》。

1.4 選種、組合測配的田間種植及考種

選種種植：每個小區(qū)種植20苗，雙行區(qū)，每行10苗，單本插，密度16.7 cm×20.0 cm。記載生育期和整齊度。成熟時每個區(qū)選擇1個以上的優(yōu)良單株，收獲中選株的全部種子。

組合測配種植：每個小區(qū)3次重復，30株，單本插，每行10苗，密度16.7 cm×20.0 cm，設(shè)豐兩優(yōu)香1號為中稻對照，成熟時混收每個小區(qū)的種子，測定小區(qū)產(chǎn)量，并取中間縱向的3株進行考種，考察其農(nóng)藝性狀?？疾斓霓r(nóng)藝性狀主要包括播始歷期、株高、穗長、有效穗數(shù)、實粒數(shù)、空粒數(shù)、結(jié)實率、千粒重和小區(qū)產(chǎn)量等。

1.5 稻米品質(zhì)分析

根據(jù)國家優(yōu)質(zhì)稻谷標準（GB/T 17891-1999）的測定方法，對配制的雜交組合以及2個對照品種進行稻米品質(zhì)分析，包含的指標有糙米率、精米率、整精米率、長寬比、堊白粒率、堊白度、膠稠度和直鏈淀粉含量等8個性狀。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pi2基因的分子檢測

圖1為Pi2基因親本的分子檢測結(jié)果，所用引物為共顯性標記RM527。由圖1可知，供體親本和受體親本之間有顯著的多態(tài)性，可以用于Pi2基因的多態(tài)性檢驗。

圖2為R201/Z219的自交F2代分子標記檢測結(jié)果，可以看出有明顯的分離現(xiàn)象，而且3種帶型符合1∶2∶1的孟德爾遺傳規(guī)律，說明該引物可以對陽性純合、雜合和陰性純合個體進行準確的篩選。

2.2 親本及育成株系的稻瘟病抗性

2.2.1 親本的稻瘟病抗性 2012年和2013年在湖北省宜昌市遠安縣望家鄉(xiāng)、2013年在恩施兩河鄉(xiāng)對8個親本株系進行了2年3點的稻瘟病田間自然誘發(fā)抗性鑒定。由表1可知，供體親本Z219的葉瘟病病級、穗頸瘟發(fā)病率和穗頸瘟損失率在2012年遠安和2013年恩施點的鑒定結(jié)果相同，達到R-MS-MR級別，都與2013年遠安的鑒定結(jié)果MR-HS-HS級別有顯著差異。其他受體親本除葉瘟病級在3點都有差異外，穗頸瘟發(fā)病率和穗頸瘟損失率與供體親本的鑒定結(jié)果有一致的差異性。因此，認為2012年遠安和2013年恩施的鑒定結(jié)果可靠，而且以穗頸瘟發(fā)病率和穗頸瘟損失率作為抗性鑒定的標準。

2.2.2 育成株系的稻瘟病抗性 通過2012年在遠安縣望家鄉(xiāng)對育成含Pi2基因的自交F5代恢復系株系進行自然誘發(fā)稻瘟病抗性的鑒定，共篩選了19個綜合抗性為1級、44個3級的抗性株系。2013年在遠安縣望家鄉(xiāng)對這63份稻瘟病綜合抗性3級及以上自交F6代恢復系株系進行重復抗性鑒定，同時在恩施兩河鄉(xiāng)進行異點的鑒定。

由表2穗頸瘟病發(fā)病率的抗病效果可知，2013年遠安和恩施的抗病效果比2012年遠安有明顯下降，其中恩施下降了9.52個百分點，遠安下降了20.63個百分點。2013年恩施出現(xiàn)了感（S）和高感（HS）的株系，占鑒定株系數(shù)的38.10%；2013年遠安出現(xiàn)的感（S）和高感（HS）的株系數(shù)達57.14%。2年3點的穗頸瘟發(fā)病率的抗病效果都低于30%，可能與供體親本的穗頸瘟發(fā)病率平均在感級別（S），受體親本在高感級別（HS）有關(guān)，也可能是由于部分株系未完全純合，從而出現(xiàn)分離，導致抗性差異。

表3為穗頸瘟損失率的抗病效果。由表3可知，2013年遠安和恩施的穗頸瘟損失率的抗病效果都比2012年遠安有明顯的降低，其中遠安下降了14.29個百分點，恩施下降了25.40個百分點。2013年遠安抗穗頸瘟病效果下降和出現(xiàn)感病株系可能與第二次重復鑒定有關(guān)，2013年恩施鑒定結(jié)果與2012年遠安的差異可能與兩地自然條件不同有關(guān)。

通過表4和表5的穗頸瘟發(fā)病率和穗頸瘟損失率之間的相關(guān)關(guān)系可知，2012年遠安和2013年遠安、2013年遠安和2013年恩施的穗頸瘟發(fā)病率之間和穗頸瘟損失率之間存在極顯著的相關(guān)關(guān)系，2012遠安和2013恩施的穗頸瘟發(fā)病率之間和穗頸瘟損失率之間沒有相關(guān)性。這可能與2012年和2013年遠安為同地點，環(huán)境相同，2013年恩施和遠安為同年，氣候相差不大有關(guān)；而2013年恩施和2012年遠安環(huán)境和氣候都不相同。

根據(jù)對2年3點的氣候和抗性結(jié)果分析，認為2012年遠安和2013年恩施的鑒定結(jié)果是比較可靠的。2013年遠安鑒定田，在水稻成熟期出現(xiàn)低溫，可能對鑒定結(jié)果的準確性具有一定的影響。表6是綜合分析2012年遠安和2013年恩施的鑒定結(jié)果，選出的抗性較好的株系。這30個株系的稻瘟病抗性明顯比原來的中稻親本有所提高，在今后雜交組合選育中，可能有較好的應(yīng)用價值。

2.3 育成株系所配雜交組合的稻瘟病抗性鑒定結(jié)果

于2013年在遠安縣望家鄉(xiāng)對2012年綜合抗性級別達到1（R）級的19個恢復系株系與C815S所配的雜交組合進行田間自然誘發(fā)稻瘟病抗性鑒定。表7為所配組合抗性鑒定穗頸瘟發(fā)病率和穗頸瘟損失率的級別。由表7可知，各組合的穗頸瘟發(fā)病率絕大部分都達到了高感（HS）；各組合的穗頸瘟損失率大部分都為中感（MS），少部分為中抗（MR），都明顯低于親本恢復系株系的抗性。這可能與雜交組合的抗性是由父母本共同的基因型決定有關(guān)，由于母本不具有稻瘟病抗性，甚至高感稻瘟病，從而導致了雜交組合的抗性顯著下降。但與不育系C815S所配組合的穗頸瘟損失率級別都優(yōu)于對照豐兩優(yōu)香1號，絕大部分都在中感（MS）及以上，說明這些組合具有一定的穗頸瘟損失率抗性。

2.4 育成株系所配增產(chǎn)雜交組合的生育期、產(chǎn)量和主要農(nóng)藝性狀表現(xiàn)

表8為4個高產(chǎn)中稻雜交組合的生育期、產(chǎn)量和主要農(nóng)藝性狀表現(xiàn)。由表8可知，播始歷期4個雜交組合都長于或與對照相當；株高都低于對照；單株有效穗數(shù)都高于對照；平均穗長都短于對照；每穗總粒數(shù)除C815S/Q191-3低于對照外，其他雜交組合都高于對照；結(jié)實率和千粒重所有雜交組合都低于對照。雜交組合C815S/Q221-2-2與對照豐兩優(yōu)香1號產(chǎn)量相當。

2.5 育成株系所配增產(chǎn)雜交組合稻米品質(zhì)表現(xiàn)

對由C815S所配的中稻雜交組合進行稻米品質(zhì)分析，結(jié)果（表9）表明，增產(chǎn)的4個中稻雜交組合中，糙米率除C815S/Q213-2為國標2級外，其他3個組合均為國標1級，與對照豐兩優(yōu)香1號相當；整精米率均低于對照，僅C815S/Q191-3達國標3級水平；堊白粒率和堊白度均高于對照；粒型所有雜交組合均與對照相當；直鏈淀粉含量僅C815S/Q213-1達國標3級，其他3個組合均與對照相當；膠稠度均與對照相當，達國標1級水平。

3 討論

本研究旨在創(chuàng)建抗稻瘟病的新恢復系，但是并沒有選擇雙親都具有抗性的親本進行雜交，從而聚合抗稻瘟病基因，獲得抗性更好的株系這種途徑，而是通過含有廣譜抗稻瘟病基因Pi2的早秈稻材料Z219與不含抗稻瘟病基因的優(yōu)良恢復系雜交，通過分子標記輔助選擇含有Pi2基因的株系自交，最后獲得穩(wěn)定的新的抗病恢復系。這樣做的目的有兩點：一是為了育種的需要，不需要改良某個特定的恢復系的抗性，而是創(chuàng)建新的恢復系，為育種提供新材料；二是育成的新株系可以直接用于組合測配，加快了抗病雜交育種的進程。

本研究育成的新株系分為3種類型：第一種是含有Pi2基因，但稻瘟病抗性卻差于供體親本Z219，可能原因是由于基因沒完全純合或基因的表達出現(xiàn)問題；第二種是含有Pi2基因，抗性與供體親本相當，可能是Pi2基因的結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生改變；第三種是含有Pi2基因，抗性優(yōu)于供體親本，可能是Pi2基因純合，然后經(jīng)過染色體的交換或重組，獲得新的未知抗稻瘟病基因或QTL位點。具體原因還需進一步驗證。

王久林等[10]認為雜種的稻瘟病抗性與不育系和恢復系都有關(guān)，且偏向于恢復系。鄭軼等[11]認為雜交組合的葉瘟病和穗頸瘟病抗性與母本葉瘟病均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，而與父本的相關(guān)性不顯著，母本的抗性越好，則配制的雜交組合抗性更好。本研究通過對C815S與育成的稻瘟病綜合抗性1級的恢復系配制的雜交組合進行自然誘發(fā)的稻瘟病抗性鑒定，結(jié)果表明雜交組合葉瘟病抗性處于抗-中抗級別，穗頸瘟發(fā)病率為感或高感級別，穗瘟損失率為中抗-中感級別，綜合抗性中抗-中感級別，優(yōu)于對照豐兩優(yōu)香1號（感）。

水稻葉瘟病與穗頸瘟病之間的關(guān)系一直存有爭論，一種認為它們之間存在著正相關(guān)關(guān)系[12-14]，另一種認為互相之間沒有相關(guān)性，甚至是由不同的基因決定。本研究分析了2012年遠安葉瘟發(fā)病率和穗頸瘟發(fā)病率之間的相關(guān)關(guān)系，結(jié)果表明葉瘟發(fā)病率和穗瘟發(fā)病率之間存在極顯著的正相關(guān)關(guān)系。但是本試驗中大部分葉瘟病鑒定表現(xiàn)為抗病級別的株系，但穗頸瘟發(fā)病率卻表現(xiàn)為感病級別，即李樺[12]所認為的“R，S”型，這是因為新育成的株系抽穗不整齊且呈分離特點導致的。因此，需要對育成的株系進一步選擇、純化，以提高新育成株系整體的稻瘟病抗性水平。

本研究對兩年同點和同年不同點的鑒定結(jié)果之間進行了相關(guān)性分析，結(jié)果表明，兩年同點的葉瘟病級別之間以及與其他的抗性之間沒有顯著的相關(guān)關(guān)系，同年不同點的結(jié)果與兩年同點的結(jié)果相似，說明葉瘟病在兩年同點和同年不同點之間都不具有重復性；而穗頸瘟發(fā)病率與損失率在同年不同點及兩年同點間都有顯著的相關(guān)關(guān)系，所以在品種和新株系的稻瘟病抗性鑒定時，應(yīng)以穗頸瘟發(fā)病率和損失率作為鑒定的標準，提高鑒定的準確性。

4 結(jié)論

本研究通過分子標記輔助選擇將抗稻瘟病Pi2基因轉(zhuǎn)入自育的恢復系中，育成了一批新的抗稻瘟病恢復系，通過2年3點的自然誘發(fā)田間抗性鑒定，獲得了30個稻瘟病抗性明顯優(yōu)于原始受體親本的新抗病恢復系，與不育系C815S測配雜交組合的抗性鑒定表明，雜交組合的稻瘟病抗性提升不明顯，但要優(yōu)于對照品種豐兩優(yōu)香1號，且產(chǎn)量、米質(zhì)方面都比對照有所提高，具有一定的應(yīng)用前景。

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