天名精內(nèi)酯酮多克隆抗體的制備

何澤瑜，韓立榮，劉雪茹，馮俊濤，張　興

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 無(wú)公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心,陜西省生物農(nóng)藥工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100)

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天名精內(nèi)酯酮多克隆抗體的制備

何澤瑜，韓立榮，劉雪茹，馮俊濤，張興

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 無(wú)公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心,陜西省生物農(nóng)藥工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100)

[摘要]【目的】 合成并鑒定天名精內(nèi)酯酮人工抗原，制備天名精內(nèi)酯酮多克隆抗體，為天名精內(nèi)酯酮作用靶標(biāo)的免疫化學(xué)定位奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā?通過(guò)天名精內(nèi)酯酮4位羰基和鹽酸氨基脲氨基的親核加成反應(yīng)制備半抗原天名精內(nèi)酯酮縮氨基脲(CN)，使用MS和NMR對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定；采用戊二醛法將半抗原和載體蛋白牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)，合成天名精內(nèi)酯酮免疫原(CN-BSA)和包被原(CN-OVA)，采用紫外吸收掃描法、紅外光譜法對(duì)免疫原及包被原進(jìn)行鑒定；用制備好的免疫原免疫健康BALB/c小鼠獲得天名精內(nèi)酯酮多克隆抗體，通過(guò)間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定其效價(jià)?！窘Y(jié)果】 成功制備了天名精內(nèi)酯酮免疫原(CN-BSA)和包被原(CN-OVA)，獲得了效價(jià)為128 000的天名精內(nèi)酯酮多克隆抗體。【結(jié)論】 成功制備了天名精內(nèi)酯酮多克隆抗體。

[關(guān)鍵詞]天名精內(nèi)酯酮；半抗原；人工抗原；酶聯(lián)免疫吸附分析

天名精內(nèi)酯酮是卡拉布烷型倍半萜內(nèi)酯類化合物，最早于1964年從天名精屬植物天名精(Carpesiumabrotanoides)的果實(shí)中分離得到[1]，并表現(xiàn)出較好的醫(yī)用生物活性[2-4]。西北農(nóng)林科技大學(xué)無(wú)公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心前期對(duì)天名精內(nèi)酯酮農(nóng)用生物活性的研究工作表明，天名精內(nèi)酯酮是一種優(yōu)秀的廣譜抑菌活性物質(zhì)，對(duì)小麥全蝕病菌(Gaeumannomycesgraminisvar.tritici)、小麥紋枯病菌(Rhizoctoniacerealis)、辣椒疫霉病菌(PhytophthoracapsiciLeonian)和番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)等12種病原菌均具有較好的抑制活性[5]；以其為先導(dǎo)，通過(guò)結(jié)構(gòu)改造，衍生合成出酯類[6]、肟酯[7]和腙類[8]等一系列化合物，這些化合物中大部分均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性；對(duì)作用機(jī)理的初步探索發(fā)現(xiàn)，天名精內(nèi)酯酮可抑制病原菌線粒體呼吸電子傳遞鏈復(fù)合酶的活性，從而影響病原菌的生物氧化過(guò)程[9]，但其具體的作用靶標(biāo)仍不明確，這嚴(yán)重阻礙了天名精內(nèi)酯酮的開(kāi)發(fā)利用。

免疫分析作為作用機(jī)理研究的重要手段之一，已成功應(yīng)用于蘇云金桿菌(Bacillusthuringiensis)伴胞晶體蛋白作用靶標(biāo)的定位[10-12]。同時(shí)，農(nóng)藥免疫分析還應(yīng)用于一些除草劑和殺菌劑作用機(jī)理的研究，如Young等[13]利用免疫熒光顯微技術(shù)確定了苯酰菌胺對(duì)辣椒疫霉菌微管骨架的破壞作用，Tresch等[14]利用免疫化學(xué)定位技術(shù)證明高效麥草氟甲酯對(duì)微管組裝具有抑制作用。本研究以天名精內(nèi)酯酮為原料合成天名精內(nèi)酯酮人工抗原，通過(guò)免疫BALB/c小鼠獲得多克隆抗體，旨在為天名精內(nèi)酯酮作用機(jī)理的研究提供技術(shù)手段。

1材料與方法

1.1材料

儀器：核磁共振譜儀(Bruker Avance 500 MHz)、紅外光譜儀(Nicolet Avatar 330FT-IR)、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(HITACHI U3310)、酶標(biāo)儀(TECAN Sunrise)、高速冷凍離心機(jī)(MIKRO22R)、凍干機(jī)、超純水凈化儀(D8611 Branstead)、洗板機(jī)(Thermo WELLWASH PLUS)、液質(zhì)聯(lián)用儀(Thermo Fisher)。

試劑：天名精內(nèi)酯酮(由西北農(nóng)林科技大學(xué)無(wú)公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心提供)、牛血清蛋白(BSA，Sigma)、卵清蛋白(OVA，Sigma)、弗氏完全佐劑(FCA，Sigma)、弗氏不完全佐劑(FICA，Sigma)，四甲基聯(lián)苯胺(TMB，Sigma分裝進(jìn)口)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG(HRP-IgG，北京康維)、鹽酸氨基脲、無(wú)水乙酸鈉、無(wú)水乙醇、戊二醛、N、N-二甲基亞砜均為分析純。試驗(yàn)動(dòng)物為6周齡的BALB/c小鼠(購(gòu)于西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。

1.2方法

1.2.1天名精內(nèi)酯酮半抗原的合成參照李江華[15]的方法并做適當(dāng)?shù)母膭?dòng)，具體合成路線見(jiàn)圖1。

圖 1　天名精內(nèi)酯酮半抗原的合成路線

向1.2 mmol鹽酸氨基脲水溶液中加入1.4 mmol乙酸鈉，在攪拌條件下，向混合物中加入含有1 mmol天名精內(nèi)酯酮的甲醇溶液，60 ℃下水浴反應(yīng)。出現(xiàn)大量白色沉淀后(約4 h)終止反應(yīng)。靜置冷卻，抽濾。用甲醇和水混合溶劑重結(jié)晶，得白色固體物質(zhì)，并用NMR和MS進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

1.2.2天名精內(nèi)酯酮人工抗原的合成和鑒定采用戊二醛法將帶有游離氨基的天名精內(nèi)酯酮半抗原和載體蛋白BSA和OVA偶聯(lián)[16-17]，制備天名精內(nèi)酯酮人工抗原，具體如圖2所示。

將20 mg牛血清蛋白溶于2 mL pH=7.4的PBS(磷酸鹽緩沖溶液)中，緩慢滴加10 mg半抗原天名精內(nèi)酯酮縮氨基脲(CN)溶液和90 μL 25%戊二醛溶液。室溫下攪拌反應(yīng)4 h后，取出反應(yīng)物，用PB(磷酸緩沖溶液)于4 ℃下透析3 d。透析完畢后，冷凍干燥，-20 ℃保存，即得免疫原CN-BSA。用同樣的方法制備包被原CN-OVA。

使用紅外光譜法[18]和紫外吸收掃描法[19]鑒定人工抗原。

圖 2　天名精內(nèi)酯酮人工抗原的合成路線

1.2.3天名精內(nèi)酯酮多克隆抗體的制備參照張靜[20]的方法免疫BALB/c小鼠。用生理鹽水稀釋免疫原至400 μg/mL，用等體積的弗氏完全佐劑(CFA，首次免疫時(shí)使用)或弗氏不完全佐劑(FICA，加強(qiáng)免疫時(shí)使用)，采用渦旋振蕩法乳化制備免疫原乳劑。選取3只健康的6周齡BALB/c小鼠，用制備好的免疫原乳劑按照表1的方法免疫小鼠。取血前3 d，沖擊免疫。摘除眼球取血，并用硫酸銨/辛酸沉淀法[17]純化抗血清，向抗血清中加入終濃度為0.01%的疊氮鈉，分裝， -20 ℃保存。

表 1　小鼠免疫方案

注：“-”表示未加佐劑或未注射免疫原。

Note:“-” means no adjuvant or no immunization.

1.2.4抗血清效價(jià)的測(cè)定使用間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定抗血清效價(jià)[21]。用質(zhì)量濃度為5 μg/mL的包被原包被酶標(biāo)板，100 μL/孔，4 ℃過(guò)夜，用PBST(含0.05% Tween-20 PBS溶液)洗板3次；加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% OVA溶液封閉1 h，200 μL/孔，再次洗板；以4 000倍為起點(diǎn)，倍比稀釋抗血清，加入相應(yīng)酶標(biāo)板孔內(nèi)，100 μL/孔，每個(gè)質(zhì)量濃度2個(gè)平行孔，并設(shè)置空白孔和陰性對(duì)照孔，37 ℃孵育1 h，洗板；加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG(1∶3 000)，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h，洗板；加入TMB(四甲基聯(lián)苯胺，tetramethylbenzidine)底物溶液顯色10 min，100 μL/孔；加入2 mol/L的H2SO4終止反應(yīng)，50 μL/孔。于450 nm下用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。以待測(cè)孔OD值(P)/陰性對(duì)照孔OD值(N)≥ 2.1(即P/N≥ 2.1)的最大稀釋倍數(shù)作為抗血清的最終效價(jià)。

2結(jié)果與分析

2.1天名精內(nèi)酯酮半抗原結(jié)構(gòu)的鑒定

通過(guò)MS和NMR對(duì)天名精內(nèi)酯酮半抗原，即天名精內(nèi)酯酮縮氨基脲(CN)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，結(jié)果如下。

1H-NMR (500 MHz，CD3Cl) δ:6.27 (1H,d,J=2.6 Hz,H-13),5.59 (1H,d,J=2.4 Hz,H-13),4.79～4.84 (1H,m,H-8),3.16～3.22(1H,m,H-7),2.32～2.37(2H,m,H-3),2.25～2.28(2H,m,H-2),1.86(3H,s,H-15),1.48～1.55(2H,m,H-9),1.12(3H,s,H-14),0.91～0.98(2H,m,H-6),0.47～0.52(1H,m,H-5),0.37～0.41(1H,m,H-1)。

13C-NMR(125 MHz，CD3Cl)δ：170.45(C-12),157.85(C-4),149.97(C-16),139.03(C-11),122.61(C-13),75.59(C-8),38.76(C-3),37.68(C-7),37.31(C-9),34.40(C-1),30.75(C-6),25.93(C-2),23.02(C-5),18.38(C-15),17.14(C-10),15.41(C-14)。

ESI-MS:m/z：306.15 C16H23O3N3([M+H]+)。

2.2天名精內(nèi)酯酮人工抗原的鑒定

采用紫外吸收掃描法和紅外光譜法對(duì)半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖3～6所示。由圖3和4可知，載體蛋白BSA和OVA的最大紫外吸收波長(zhǎng)出現(xiàn)在278 nm處，半抗原在235～295 nm未發(fā)現(xiàn)明顯的特征吸收峰，而經(jīng)戊二醛法偶聯(lián)合成的人工抗原CN-BSA和CN-OVA的最大吸收波長(zhǎng)分別出現(xiàn)在269 nm和267 nm處。2種人工抗原CN-BSA和CN-OVA的紫外吸收光譜是半抗原天名精內(nèi)酯酮縮氨基脲與載體蛋白吸收光譜的整合，表明半抗原和載體蛋白偶聯(lián)成功。

國(guó)家體育場(chǎng)（鳥巢）是第29屆夏季奧運(yùn)會(huì)的主體育場(chǎng)。奧運(yùn)會(huì)后，國(guó)家體育場(chǎng)公司按照“政府主導(dǎo)、社會(huì)參與、企業(yè)運(yùn)作”的要求，充分利用奧運(yùn)場(chǎng)館遺產(chǎn)，打造鳥巢旅游新亮點(diǎn)，引進(jìn)頂級(jí)賽事演出活動(dòng)，創(chuàng)辦青少年公益賽事，培育鳥巢自主品牌項(xiàng)目，打造全新的商業(yè)產(chǎn)業(yè)鏈，探索場(chǎng)館多元化經(jīng)營(yíng)，實(shí)現(xiàn)了鳥巢賽后的可持續(xù)發(fā)展，獲得了社會(huì)各界的廣泛贊譽(yù)

由圖5可以看出，CN-BSA的紅外圖譜中包含了載體蛋白BSA的特征吸收譜帶，如1 655 cm-1處的BSA酰胺譜帶Ⅰ和1 543 cm-1處的酰胺譜帶Ⅱ，以及2 929 cm-1處較弱的-CH2-吸收。同時(shí)在CN-BSA的紅外光譜中還存在半抗原CN和BSA偶聯(lián)后的1 439 cm-1處的-CH2-的δCH吸收，以及1 720 cm-1處的半抗原分子的羰基吸收，由此可判斷免疫原CN-BSA合成成功。由圖6可以看出，包被原CN-OVA的紅外圖譜中包含了載體蛋白OVA的特征吸收譜帶，如1 653 cm-1處的酰胺譜帶Ⅰ和1 539 cm-1處的酰胺譜帶Ⅱ，以及偶聯(lián)后的1 439 cm-1處-CH2-的δCH吸收，1 724 cm-1處的半抗原分子的羰基吸收，由此表明包被原CN-OVA合成成功。

結(jié)合上述2種鑒定方法，可以確定半抗原和載體蛋白偶聯(lián)成功，合成出了免疫原CN-BSA和包被原CN-OVA。

圖 3　半抗原CN、免疫原CN-BSA和載體蛋白BSA的紫外光譜掃描圖

圖 5　載體蛋白BSA與免疫原CN-BSA的紅外光譜掃描圖

2.3抗血清效價(jià)的測(cè)定

使用免疫原CN-BSA沖擊免疫BALB/c小鼠后3 d，摘除眼球取血，純化后獲得抗血清，進(jìn)行適當(dāng)稀釋后用酶標(biāo)儀測(cè)定其在450 nm波長(zhǎng)處的OD值，確定抗血清效價(jià)，結(jié)果如表2所示。由表2可知，經(jīng)免疫原CN-BSA免疫后的BALB/c小鼠對(duì)半抗原CN產(chǎn)生了較好的免疫應(yīng)答，而當(dāng)抗血清稀釋至 128 000 倍時(shí)，P/N值為 2.729>2.1，即獲得的抗血清效價(jià)為128 000。較高效價(jià)抗血清的獲得表明人工抗原的成功合成和多克隆抗體的成功制備。

圖 6　載體蛋白OVA與包被原CN-OVA的紅外光譜掃描圖

血清稀釋倍數(shù)DilutionsofantiserumOD值ODvalue待測(cè)血清Testedantiserum陰性對(duì)照NegativeantiserumP/N40001.5440.2985.18180001.2170.2624.645160000.9440.2344.034320000.7170.2123.382640000.6320.1913.3081280000.4530.1592.7292560000.3010.1581.9055120000.2230.1581.141

3討論

3.1半抗原和載體蛋白偶聯(lián)位點(diǎn)的選擇

通常小分子半抗原不具有免疫原性，必須與載體蛋白偶聯(lián)形成人工抗原，借助載體蛋白的T細(xì)胞表位間接誘導(dǎo)B細(xì)胞激活、分化增殖，產(chǎn)生針對(duì)半抗原分子的特異性抗體[22]。研究表明，相同的半抗原分子，不同的偶聯(lián)位點(diǎn)所形成的人工抗原的空間結(jié)構(gòu)不同，即與載體結(jié)合后產(chǎn)生的人工抗原表面所暴露出的抗原決定簇不同，導(dǎo)致產(chǎn)生的抗體在效價(jià)、親和力和特異性上均存在差異[23]。根據(jù)免疫系統(tǒng)通常對(duì)載體遠(yuǎn)端結(jié)構(gòu)識(shí)別能力最強(qiáng)，而對(duì)連接位點(diǎn)部分特異性較弱的原則[24]，要制備高效價(jià)和高特異性的抗體，半抗原分子中的偶聯(lián)位點(diǎn)應(yīng)遠(yuǎn)離半抗原分子的特征結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)(如苯環(huán)或雜環(huán)等)，使半抗原分子特征結(jié)構(gòu)部分得以充分暴露，易于被動(dòng)物免疫系統(tǒng)識(shí)別，同時(shí)還可避免載體蛋白對(duì)半抗原分子特征結(jié)構(gòu)的屏蔽作用。在選擇偶聯(lián)位點(diǎn)時(shí)還應(yīng)避免對(duì)半抗原分子的電子分布的影響[23]。本試驗(yàn)以半抗原天名精內(nèi)酯酮縮氨基脲16位C作為偶聯(lián)位點(diǎn)，該偶聯(lián)位點(diǎn)的選擇遠(yuǎn)離了天名精內(nèi)酯酮特征結(jié)構(gòu)α-亞甲基-γ-丁內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)，對(duì)天名精內(nèi)酯酮的電子分布影響較小，易于免疫系統(tǒng)對(duì)該特征結(jié)構(gòu)的識(shí)別，從而產(chǎn)生高效價(jià)和高特異性的抗體，效價(jià)128 000抗血清的獲得，證明了該設(shè)計(jì)思路的合理性。

3.2免疫分析是鑒定人工抗原的必需步驟

人工抗原的制備是為了能夠引起動(dòng)物的免疫反應(yīng)，從而獲得能識(shí)別半抗原分子的高特異性和高效價(jià)的抗體，因而人工抗原是否合格的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該為是否有特異性抗體產(chǎn)生。然而，通常采用的人工抗原的鑒定方法有SDS-PAGE法、紅外光譜法、紫外吸收掃描法、同位素標(biāo)記法等[25]，但這些方法均僅能證明半抗原和載體蛋白是否成功偶聯(lián)，并不能最終確定所制備的人工抗原是否能夠引起動(dòng)物的免疫反應(yīng)從而獲得滿足要求的抗體。故除了要使用上述檢測(cè)方法確定偶聯(lián)是否成功外，還必須進(jìn)一步使用免疫檢測(cè)法對(duì)人工抗原的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。本試驗(yàn)采用紅外光譜法和紫外吸收掃描法2種方法對(duì)免疫原和包被原進(jìn)行鑒定，證明半抗原和載體蛋白偶聯(lián)成功，并使用間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定了抗血清的效價(jià)，高效價(jià)抗血清的獲得證明了人工抗原的成功制備。

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Preparation of polyclonal-antibody against carabrone

HE Ze-yu,HAN Li-rong,LIU Xue-ru,FENG Jun-tao,ZHANG Xing

(ResearchandDevelopmentCenterofBiorationalPesticide,TechnologyandEngineeringCenterofBiopesticide,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

Abstract:【Objective】 This study synthesized and identified artificial antigen of carabrone,and prepared polyclonal-antibody. 【Method】 Reaction of carabrone and semicarbazide hydrochloride was conducted to obtain hapten carabrone semicarbazone,which was characterized by MS and NMR spectrum.Then,the haptens were conjugated to bovine serum albumin (BSA) and ovalbumin (OVA) for generation of immunogen (CN-BSA) and coating antigen (CN-OVA),respectively.The structures of immunogen and coating antigen were identified by UV and IR spectrum.BALB/c mice were immunized with CN-BSA and polyclonal antisera were produced.The titer of antiserum was also detected by indirect non-competitive enzyme-linked immunosorbent assay.【Result】 Hapten was synthesized,and immunogen (CN-BSA) and coating antigen (CN-OVA) were obtained successfully.Polyclonal-antibody against carabrone was prepared and the titer of antiserum was 128 000.【Conclusion】 The artificial antigen and polyclonal-antibody against carabrone was prepared successfully.

Key words:carabrone;hapten;artificial antigen;ELISA

DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2016-03-1408:4510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.04.018

[收稿日期]2014-07-16

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31272074)；陜西省自然科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2012JQ3004)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(ZD2012004)

[作者簡(jiǎn)介]何澤瑜(1990-)，男，云南勐臘人，在讀碩士，主要從事農(nóng)藥毒理學(xué)研究。E-mail:skyhugh2012@gmail.com[通信作者]馮俊濤(1967-)，男，河南登封人，教授，博士，主要從事生物農(nóng)藥及植物保護(hù)研究。E-mail:jtfeng@126.com

[中圖分類號(hào)]R392.11

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1671-9387(2016)04-0129-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160314.0845.036.html