陜北花馬鹽湖1株產(chǎn)纖維素酶真菌的鑒定及產(chǎn)酶條件研究

張　波，劉開輝,2，陳文強(qiáng),2，楊方玉，丁小維,2，鄧百萬,2

(1 陜西理工學(xué)院 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000；2 陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心，陜西 漢中 723000)

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陜北花馬鹽湖1株產(chǎn)纖維素酶真菌的鑒定及產(chǎn)酶條件研究

張波1，劉開輝1,2，陳文強(qiáng)1,2，楊方玉1，丁小維1,2，鄧百萬1,2

(1 陜西理工學(xué)院 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000；2 陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心，陜西 漢中 723000)

[摘要]【目的】 對(duì)從陜北花馬鹽湖嗜鹽真菌中篩選出的1株產(chǎn)纖維素酶菌株進(jìn)行鑒定，研究該菌株的產(chǎn)酶條件，為嗜鹽纖維素酶資源的利用提供理論依據(jù)。【方法】 利用剛果紅培養(yǎng)基從陜北花馬鹽湖嗜鹽真菌中篩選產(chǎn)纖維素酶菌株，并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)和ITS序列鑒定，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交試驗(yàn)，優(yōu)化該產(chǎn)酶菌株的最佳培養(yǎng)基配方和最佳發(fā)酵條件，并研究該產(chǎn)酶菌株的NaCl耐受性?！窘Y(jié)果】 從陜北花馬鹽湖嗜鹽真菌中篩選出1株高產(chǎn)纖維素酶菌株6MA1，根據(jù)形態(tài)學(xué)和ITS序列系統(tǒng)發(fā)育分析，將該菌鑒定為黑曲霉(Aspergillus niger)。菌株產(chǎn)纖維素酶的最佳培養(yǎng)基配方是，玉米芯粉22.0 g/L，蛋白胨6.0 g/L， NaCl 4.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.55 g/L，K2HPO4 0.5 g/L；最佳發(fā)酵條件是,發(fā)酵溫度28 ℃，發(fā)酵時(shí)間6 d，起始pH 6.0，種子液接種量18%(體積分?jǐn)?shù))，在此條件下菌株6MA1的CMCase活力為47.8 U/mL。此外，該菌株在含0～15.0%(體積分?jǐn)?shù))NaCl的培養(yǎng)基中仍具有產(chǎn)纖維素酶活力。【結(jié)論】 從陜北花馬鹽湖篩選出1株產(chǎn)纖維素酶菌株6MA1，并得到了該菌株產(chǎn)酶的最佳條件。

[關(guān)鍵詞]陜西花馬鹽湖；纖維素酶；嗜鹽真菌；產(chǎn)酶條件

纖維素酶是生物降解含β-1,4 糖苷鍵纖維素生成葡萄糖的一類復(fù)合酶的總稱[1]，廣泛用于能源化工、食品、紡織、飼料、釀酒、石油勘探、中藥成分提取等眾多領(lǐng)域，特別是在生物能源、紡織業(yè)、造紙業(yè)和洗滌業(yè)等工業(yè)領(lǐng)域中具有重要的應(yīng)用價(jià)值[2]。其作用底物——纖維素類物質(zhì)是地球上最豐富的可再生資源之一[3]。據(jù)報(bào)道，全世界每年通過陸地生物合成的再生纖維素總量為560～1 200億t[4]，占植物界碳含量的50%以上，但是這些資源并未被人類所充分利用，而大多數(shù)是被燃燒處理，造成了大氣污染及黑碳?xì)馊苣z嚴(yán)重超標(biāo)[5]，并破壞了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、改變了土壤理化性質(zhì)及有機(jī)成分[6]。因此，有效利用纖維素資源對(duì)于解決當(dāng)前能源危機(jī)及環(huán)境污染等問題有重要作用。

纖維素酶廣泛存在于自然界的生物體中，細(xì)菌、真菌及動(dòng)物體內(nèi)都能產(chǎn)生纖維素酶，一般用于生產(chǎn)的纖維素酶多來自于真菌。目前報(bào)道能夠降解天然纖維的微生物主要是木霉、青霉、曲霉和白腐菌等真菌[7-9]，而且大多數(shù)菌分離自低鹽環(huán)境中，關(guān)于鹽湖微生物產(chǎn)纖維素酶的研究報(bào)道較少[10]，在鹽湖高鹽環(huán)境中，真菌在長(zhǎng)期適應(yīng)性進(jìn)化過程中常會(huì)形成功能獨(dú)特、多樣的酶系，這類耐(嗜)鹽酶系在高鹽條件下一般仍具有較好的活力，因此在工業(yè)高鹽環(huán)境中仍能發(fā)揮作用；此外，這類真菌發(fā)酵所需的高濃度NaCl可抑制大多數(shù)微生物生長(zhǎng)繁殖，防止纖維素酶生產(chǎn)過程中的雜菌污染[11]。本研究從陜北花馬鹽湖菌株中篩選得到1株產(chǎn)纖維素酶的菌株，對(duì)該菌株的產(chǎn)酶條件進(jìn)行了探究，以期為嗜鹽纖維素酶資源的利用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌種陜北花馬鹽湖嗜鹽真菌菌株(37株)分離自陜北花馬鹽湖水澤沉積物。

1.1.2培養(yǎng)基剛果紅培養(yǎng)基[12](g/L)：(NH4)2SO42.0，MgSO4·7H2O 0.5，K2HPO41.0，NaCl 0.5，纖維素粉2.0，剛果紅0.4，瓊脂 22.0，pH自然；查氏培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖30.0，NaNO32.0，K2HPO41.0，KCl 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO40.01，瓊脂12.0，pH自然；種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖10.0，麥秸 10.0，(NH4)2SO41.5，pH 5.5～6.0；基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L)：玉米芯粉20.0，蛋白胨6.0，K2HPO40.5，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 5.0，pH 5.5。

1.2方法

1.2.1菌株篩選將37株待試菌株接種于剛果紅培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，待菌落長(zhǎng)成后，測(cè)量透明圈直徑與菌落直徑差，可初步判斷產(chǎn)酶活性大小，從中篩選出產(chǎn)酶活性最高的菌株。

1.2.2菌株鑒定將篩選出的產(chǎn)纖維素酶活性最高的菌株接種到查氏培養(yǎng)基上，并在接種位點(diǎn)旁斜插入無菌蓋玻片，28 ℃倒置培養(yǎng)7～14 d，觀察菌落形態(tài)，待菌絲爬滿蓋玻片后，取出蓋玻片并在尼康高級(jí)光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲的形態(tài)特征及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，參照《真菌鑒定手冊(cè)》[13]進(jìn)行初步鑒定。

利用CTAB法提取真菌基因組DNA，用真菌ITS1和ITS4[14]擴(kuò)增ITS基因。PCR反應(yīng)體系(25 μL)為：10×buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，模板DNA 1.0 μL(約20 ng)，上下游引物(10 mmol/L)各1.0 μL，Taq酶0.3 μL，加去離子水至 25 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性 30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，36個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收并送上海生工進(jìn)行測(cè)序。所得序列在GenBank中比對(duì)并下載相似度高的序列，組成數(shù)據(jù)集，利用Bio-Edit和Mega5軟件構(gòu)建NJ樹[15]。

1.2.3產(chǎn)酶菌株培養(yǎng)基組分的優(yōu)化(1)種子培養(yǎng)。取活化的斜面菌株約0.5 cm2的小塊，接種于種子培養(yǎng)基中，28 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)1 d，作為種子液。

(2)碳源的篩選。將種齡為1 d的種子液按搖瓶裝液量10%(體積分?jǐn)?shù))接入含2%(體積分?jǐn)?shù))供試碳源(玉米芯粉、木屑、麥秸、纖維素粉、米糠)及0.6%(體積分?jǐn)?shù))蛋白胨的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，28 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)72 h，測(cè)定羧甲基纖維素酶(CMCase)活力，篩選最佳碳源。

(3)氮源的篩選。將種齡為1 d的種子液按搖瓶裝液量10%(體積分?jǐn)?shù))接入含2%(體積分?jǐn)?shù))最佳碳源及0.6%(體積分?jǐn)?shù))供試氮源(蛋白胨、牛肉膏、黃豆粉、酵母粉、(NH4)2SO4)的培養(yǎng)基中，28 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)72 h，測(cè)定CMCase活力，篩選最佳氮源。

(4)正交法優(yōu)化培養(yǎng)基組分。在培養(yǎng)基單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取基礎(chǔ)培養(yǎng)基碳源(玉米芯粉)、氮源(蛋白胨)、NaCl、MgSO4·7H2O 4個(gè)因素作為影響篩選菌株產(chǎn)纖維素酶的培養(yǎng)基組分，設(shè)計(jì)四因素三水平的正交試驗(yàn)如表1所示。

表 1　產(chǎn)纖維素酶菌株培養(yǎng)基組分優(yōu)化的正交試驗(yàn)方案

1.2.4產(chǎn)酶菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化(1)發(fā)酵條件對(duì)CMCase活力的影響?？疾彀l(fā)酵時(shí)間(2，3，4，5，6，7，8 d)、發(fā)酵溫度(24，26，28，30，32 ℃)、起始pH(4.5，5.5，6.5，7.5，8.5)、種子液接種量(體積分?jǐn)?shù)5%，10%，15%，20%，25%)對(duì)菌株產(chǎn)CMCase活力的影響，初步確定發(fā)酵條件。

(2)正交法優(yōu)化發(fā)酵條件。在發(fā)酵條件單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、起始pH、接種量4個(gè)因素作為篩選產(chǎn)纖維素酶菌株過程中發(fā)酵條件優(yōu)化的因素，設(shè)計(jì)四因素三水平的正交試驗(yàn)如表2所示。

表 2　產(chǎn)纖維素酶菌株發(fā)酵條件優(yōu)化的正交試驗(yàn)方案

1.2.5NaCl體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌株產(chǎn)酶活力的影響在優(yōu)化培養(yǎng)基中分別添加0，2.5%，5.0%，7.5%，10.0%，12.5%，15.0%(體積分?jǐn)?shù))的NaCl，在優(yōu)化培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，測(cè)定菌株的CMCase活力，考察NaCl體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌株產(chǎn)酶活力的影響。

1.2.6纖維素酶活力的測(cè)定(1)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。葡萄糖質(zhì)量濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線參照文獻(xiàn)[16]的方法繪制，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=13.948 3X-0.067 4，r2=0.995(Y代表葡萄糖質(zhì)量濃度(mg/mL)；X代表酶解反應(yīng)產(chǎn)物顯色后的吸光度)。

(2)CMCase活性的測(cè)定。將1.0 mL粗酶液加入9.0 mL 0.05 mol/L檸檬酸緩沖液(pH 4.8)中，混勻獲得稀釋酶液。在試管中分別加入0.5 mL稀釋酶液(對(duì)照為滅活酶液)和1.5 mL體積分?jǐn)?shù) 0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC)溶液，50 ℃水浴30 min，加入3.0 mL DNS試劑終止反應(yīng)，沸水浴5 min，冷卻至室溫，定容后測(cè)OD540 nm吸光值[17]。以1 mL酶液1 min水解生成1 μg葡萄糖的酶量為1個(gè)活力單位(U/mL)。

2結(jié)果與分析

2.1陜北花馬鹽湖產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選

利用剛果紅培養(yǎng)基從37株嗜鹽真菌中篩選出2株產(chǎn)纖維素酶的菌株8MB15和6MA1。菌株8MB15透明圈直徑為12 mm，菌落直徑為10 mm。菌株6MA1透明圈直徑為20 mm，菌落直徑為16 mm(表3)。根據(jù)透明圈直徑與菌落圈直徑差，確定菌株6MA1為產(chǎn)纖維素酶活性高的菌株。

2.2菌株6MA1的鑒定

2.2.1菌株形態(tài)特征菌株6MA1在查氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d后(圖1A)，菌落正面絨毛狀，外側(cè)呈白色，中部呈灰黑色；菌落反面淡黃褐色，有褶皺。菌落產(chǎn)生放射狀向外延伸的白色菌絲，菌絲與培養(yǎng)基結(jié)合較牢，菌絲寬度為9.5～12.5 μm，在氣生菌絲頂端膨大形成大小均一的頂囊，并形成黑色分生孢子頭，孢子大小為2.5 μm×2.5 μm(圖1B)。根據(jù)其形態(tài)特征，初步鑒定該菌為曲霉屬(Aspergillus)真菌。

表 3　陜北花馬鹽湖產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選

圖 1　菌株6MA1的菌落形態(tài)(A)及顯微觀察(10×)(B)

2.2.2ITS序列系統(tǒng)發(fā)育分析構(gòu)建嗜鹽真菌6MA1 ITS序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果(圖2)表明，菌株6MA1 ITS序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中曲霉屬的Aspergillusniger(JF436883)、Aspergillusniger(KF496080)和Aspergillusniger(KC341970)等序列的相似性≥98%，6MA1與黑曲霉聚于同一分支上，其步長(zhǎng)值為100%。因此將該菌株鑒定為黑曲霉(Aspergillusniger)。

2.3菌株6MA1培養(yǎng)基組分優(yōu)化的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1碳源由圖3可知，纖維素粉、玉米芯粉、麥秸、木屑和米糠這5種碳源均能誘導(dǎo)菌株6MA1產(chǎn)生纖維素酶，且不同種類碳源對(duì)菌株產(chǎn)酶活性影響顯著。菌株6MA1對(duì)碳源利用程度的大小順序依次是玉米芯粉>麥秸>纖維素粉>木屑>米糠，對(duì)應(yīng)CMCase活力分別是25.1，18.7，14.5，13.4，11.8 U/mL，所以可確定玉米芯粉為最佳碳源。

2.3.2氮源由圖4可知，(NH4)2SO4、黃豆粉、牛肉膏、酵母粉和蛋白胨這5種氮源均能誘導(dǎo)菌株6MA1產(chǎn)生纖維素酶，且不同種類氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶活性影響差異較大。菌株6MA1對(duì)氮源利用程度的大小順序依次是蛋白胨>(NH4)2SO4>黃豆粉>酵母粉>牛肉膏，對(duì)應(yīng)CMCase活力分別是23.1，19.7，16.9，14.4，12.6 U/mL，所以可確定蛋白胨為最佳氮源。

2.4菌株6MA1產(chǎn)酶培養(yǎng)基組分的正交試驗(yàn)優(yōu)化

表4結(jié)果表明，玉米芯粉在3水平，蛋白胨在2水平，NaCl在1水平，MgSO4·7H2O在3水平時(shí)菌株產(chǎn)CMCase活力最高，其CMCase活力是38.7 U/mL。因此，各因子的最佳水平組合為：A3B2C1D3。極差分析結(jié)果表明：各因子對(duì)CMCase活力影響的大小順序?yàn)锳>B>D>C。所以，最終確定菌株6MA1產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基的最佳配方為：玉米芯粉22.0 g/L，蛋白胨6.0 g/L，NaCl 4.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.55 g/L，K2HPO40.5 g/L。

圖 2菌株6MA1的ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹

Fig.2ITS phylogenetic tree of 6MA1 strain

圖 3碳源對(duì)菌株6MA1產(chǎn)CMCase活力的影響

Fig.3Effects of carbon source on CMCase of 6MA1

圖 4氮源對(duì)菌株6MA1產(chǎn)CMCase活力的影響

Fig.4Effects of nitrogen source on CMCase of 6MA1

表 4　菌株6MA1產(chǎn)酶培養(yǎng)基組分優(yōu)化的正交試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表 4　Continued table 4

2.5菌株6MA1產(chǎn)酶發(fā)酵條件的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.5.1發(fā)酵溫度的影響由圖5可知，溫度對(duì)菌株6MA1產(chǎn)酶的影響較大，隨著溫度的逐漸升高，CMCase活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。24～28 ℃時(shí)CMCase活力保持升高狀態(tài)，28 ℃時(shí)達(dá)到最大值32.5 U/mL，之后CMCase活力開始呈現(xiàn)下降狀態(tài)。因此，發(fā)酵溫度初步確定為28 ℃。

2.5.2發(fā)酵時(shí)間的影響由圖6可知，發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株6MA1產(chǎn)酶影響較大，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，CMCase活力呈現(xiàn)先保持平穩(wěn)后迅速上升再急劇下降并趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)。在2～5 d時(shí)CMCase活力基本保持平穩(wěn)緩慢上升狀態(tài)，6 d時(shí)，CMCase活力達(dá)到最大值28.7 U/mL，此后CMCase活力急劇下降后又保持平穩(wěn)。因此，發(fā)酵時(shí)間初步確定為6 d。

圖 5　發(fā)酵溫度對(duì)菌株6MA1產(chǎn)CMCase活力的影響

2.5.3起始pH的影響由圖7可知，不同起始pH對(duì)菌株6MA1產(chǎn)酶影響較大，隨著pH的增大，CMCase活力呈現(xiàn)先上升后急劇下降的趨勢(shì)，pH 4.5～5.5時(shí)，CMCase活力迅速升高，在pH為5.5時(shí)，CMCase活力達(dá)到最大值31.2 U/mL，pH 5.5～6.5時(shí)急劇下降，此后保持緩慢下降的趨勢(shì)。因此，起始pH初步確定為5.5。

2.5.4接種量的影響由圖8可知，不同接種量對(duì)菌株6MA1產(chǎn)酶影響較明顯，隨著接種量的增加，CMCase活力呈現(xiàn)先緩慢上升后下降的趨勢(shì)，在接種量為20%(體積分?jǐn)?shù))時(shí)，CMCase活力達(dá)到最大值28.9 U/mL。因此，接種量初步確定為20%。

圖 7　起始pH對(duì)菌株6MA1產(chǎn)CMCase活力的影響

2.6菌株6MA1產(chǎn)酶發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)優(yōu)化

表5結(jié)果表明，發(fā)酵溫度在2水平，發(fā)酵時(shí)間在2水平，起始pH在3水平，接種量在1水平時(shí)，菌株產(chǎn)CMCase活力最高，其CMCase活力可達(dá)47.8 U/mL。因此，各因子的最佳水平組合為：A2B2C3D1。極差分析結(jié)果表明，各因子對(duì)CMCase活力影響的大小順序?yàn)锳>C>B>D。所以，最終確定菌株6MA1產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵條件的最佳組合為：發(fā)酵溫度28 ℃，發(fā)酵時(shí)間6 d，起始pH 6.0，種子液接種量18%(體積分?jǐn)?shù))。

表 5　菌株6MA1產(chǎn)酶發(fā)酵條件優(yōu)化的正交試驗(yàn)結(jié)果

2.7NaCl體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌株6MA1產(chǎn)酶活力的影響

由圖9可知，在NaCl體積分?jǐn)?shù)為0～15.0%時(shí)，菌株6MA1均可產(chǎn)生纖維素酶，隨著NaCl的逐漸增大，CMCase活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)NaCl體積分?jǐn)?shù)為2.5%時(shí)，CMCase活力達(dá)到最大值55.2 U/mL。因此，在培養(yǎng)基中添加體積分?jǐn)?shù)2.5%的NaCl對(duì)菌株6MA1產(chǎn)纖維素酶具有促進(jìn)作用。

圖 9NaCl體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌株6MA1產(chǎn)CMCase活力的影響

Fig.9Effects of NaCl concentration on CMCase of 6MA1

3討論

本研究從陜北花馬鹽湖嗜鹽真菌中篩選出1株產(chǎn)纖維素酶活性較高的菌株6MA1，根據(jù)形態(tài)學(xué)和ITS序列分析將該菌株鑒定為黑曲霉(Aspergillusniger)。菌株6MA1產(chǎn)纖維素酶的最佳培養(yǎng)基配方是，玉米芯粉22.0 g/L，蛋白胨6.0 g/L，NaCl 4.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.55 g/L，K2HPO40.5 g/L。菌株6MA1產(chǎn)纖維素酶的最佳發(fā)酵條件是，發(fā)酵溫度28 ℃，發(fā)酵時(shí)間6 d，起始pH 6.0，種子液接種量18%(體積分?jǐn)?shù))，CMCase活力可達(dá)47.8 U/mL。

目前，產(chǎn)纖維素酶菌株的研究主要集中在一些常規(guī)環(huán)境的微生物上，對(duì)于極端環(huán)境微生物產(chǎn)纖維素酶的研究報(bào)道較少，極端鹽堿環(huán)境微生物所產(chǎn)酶系可在普通微生物無法生存的高鹽堿環(huán)境中仍保持酶活性。因此，這類極端微生物產(chǎn)纖維素酶的篩選、基因克隆及高效表達(dá)已成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。嚴(yán)芬等[18]從造紙廠污泥中篩選出1株產(chǎn)高溫纖維素酶的土曲霉菌株XM5，其最適反應(yīng)溫度為65 ℃，最適pH為4.0，CMCase活力為4.3 U/mL；李忠玲等[19]從造紙廠堿性土壤中分離出1株產(chǎn)堿性纖維素酶兼性厭氧菌株LZ-5，其最適反應(yīng)溫度為40 ℃，最適pH為9.0，CMCase活力為5.8 U/mL；穆春雷等[20]從秸稈還田土壤中分離出1株低溫分解纖維素酶的草酸青霉菌株M11，其最佳發(fā)酵時(shí)間為9 d，最適反應(yīng)溫度為20 ℃，最適pH為5.0，CMCase活力為33.08 U/mL。本研究從陜北花馬鹽湖嗜鹽真菌中篩選出的產(chǎn)纖維素酶菌株6MA1發(fā)酵周期短，發(fā)酵溫度與起始pH符合一般真菌培養(yǎng)條件，且CMCase活力高，可達(dá)47.8 U/mL，顯著高于草酸青霉菌株M11產(chǎn)CMCase活力，提高了44.5%[20]，且菌株6MA1可在含0～15.0% NaCl的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)并產(chǎn)生纖維素酶，具有較強(qiáng)的NaCl耐受力。這些特性表明該菌株產(chǎn)生的纖維素酶在工業(yè)高鹽環(huán)境中有一定的應(yīng)用前景，值得進(jìn)一步研究開發(fā)與利用。

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Identification and fermentation conditions of a cellulase-producing fungus from Huama Salt Lake in northern Shaanxi

ZHANG Bo1,LIU Kai-hui1,2,CHEN Wen-qiang1,2,YANG Fang-yu1,DING Xiao-wei1,2,DENG Bai-wan1,2

(1SchoolofBiologicalScience&Engineering,ShaanxiUniversityofTechnology,Hanzhong,Shaanxi723000,China;2ShaanxiProvincialEngineeringResearchCenterofEdibleandMedicinalFungi,Hanzhong,Shaanxi723000,China)

Abstract：【Objective】 One cellulase-producing fungus screened from fungi in Huama Salt Lake in northern Shaanxi was identified and its fermentation conditions were tested to provide theoretical basis for the utilization of halophilic cellulase resources.【Method】 First,Congo red medium was used to screen cellulase producing strain from halophilic fungi in Huama Salt Lake in northern Shaanxi and it was identified through morphology and ITS sequence.Then,the optimized medium and liquid-fermented conditions were obtained by L9(34) orthogonal design.The NaCl tolerance of obtained enzyme producing strain was studied as well.【Result】 The cellulose-producing strain,6MA1,was isolated from halophilic fungi in Huama Salt Lake in northern Shaanxi.This isolate was classified as Aspergillus niger.The optimal medium contained the following components (g/L):corncob powder 22.0,peptone 6.0,NaCl 4.0,MgSO4·7H2O 0.55,and K2HPO4 0.5.The optimal liquid-fermented conditions were:initial medium pH 6.0,inoculum 18%,at 28 ℃ for 6 days.Its CMCase activity reached 47.8 U/mL.In addtion,6MA1 still produced cellulase when submergerd in liquid media with 0-15.0% NaCl.【Conclusion】 The study screened out a cellulase-producing strain from Huama Salt Lake in northern Shaanxi and optimized its fermentation conditions.

Key words：Huama Salt Lake in northern Shaanxi;cellulase;fungi;enzyme production conditions

DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2016-03-1408:4510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.04.021

[收稿日期]2015-10-16

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(31100017)；陜西省青年科技新星科研計(jì)劃項(xiàng)目(2013KJXX-76)

[作者簡(jiǎn)介]張波(1989-)，女,陜西安康人，碩士，主要從事微生物資源保育及開發(fā)利用研究。 E-mail:13474315539@163.com[通信作者]劉開輝(1979-)，男，陜西旬陽人，副教授，主要從事特殊環(huán)境微生物資源開發(fā)與利用研究。

[中圖分類號(hào)]Q935

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1671-9387(2016)04-0149-08

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160314.0845.042.html

E-mail:kaihhui168@hotmail.com