酶法提取夏秋季次品綠茶茶多酚工藝優(yōu)化

黃德娜+李鋒+曾承露+張元彪+劉潔

摘要：以夏秋季產都勻毛尖為原料，利用響應面法對復合酶（纖維素酶和果膠酶）輔助提取毛尖茶中茶多酚的工藝進行優(yōu)化。首先采用單因素試驗分析pH值、料液比、提取溫度、提取時間、酶用量5個因素對茶多酚提取率的影響，篩選出影響茶多酚提取率顯著的因素，結合響應面法優(yōu)化提取工藝參數(shù)，并對各個因素的顯著性和交互性進行分析。結果顯示毛尖茶中茶多酚的提取最佳工藝條件為：在 60 ℃的水浴條件下，pH值為5.5，酶解時間為70 min時，茶多酚的提取率可達22.39%。

關鍵詞：都勻毛尖；綠茶；纖維素酶；果膠酶；茶多酚；響應面法

中圖分類號： R284.2

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0347-04

黔南地區(qū)茶葉資源豐富，都勻、貴定、甕安等都是產茶大縣，茶葉是該地區(qū)主導產業(yè)之一，但忽視夏秋茶生產的現(xiàn)象尤為突出。按照茶樹1年萌發(fā)4輪新梢的生長規(guī)律，夏秋茶產量要占全年總產量的60%以上，若能很好利用夏秋茶資源，對于提高茶葉生產整體效益，有效增加茶農收入，推動黔南州茶葉產業(yè)健康發(fā)展，將發(fā)揮重要作用。茶葉中主要活性成分有茶多酚、茶多糖、咖啡堿、茶氨酸等。茶多酚為茶葉中多酚類的總稱，其具有抗氧化、抗菌、抗癌等生理功能，對一些心血管、腫瘤等疾病有一定的預防作用[1-2]，被廣泛應用于藥品、食品及保健等行業(yè)[3-4]。據報道，當前國內外對茶多酚的需求為2 000 t/年左右[5]，其市場價值達到十幾億元，極具開發(fā)價值。目前對黔南地區(qū)夏秋低檔綠茶的相關研究較少，若能從中提取茶多酚并進行相關研究，對黔南夏秋茶葉的綜合利用具有極大意義。

目前，植物活性成分的提取方法種類較多（有機溶劑萃取法、微波法、超聲波法等），但各有優(yōu)缺點[6-8]。本研究采用酶技術提取茶多酚，酶具有專一性和高效性，只破壞細胞壁，從而有利于細胞壁內的有效成分溶出。此法提取條件溫和、簡單，克服活性成分結構被破壞的缺點，是一種安全、有效、無污染的提取方法[9]。本試驗擬采用復合酶法提取茶葉中茶多酚，以茶多酚提取率為評價目標，從酶用量、時間、溫度、pH值等方面考察復合酶法提取茶多酚的效果，并優(yōu)化提取工藝條件，以期為次品茶葉或茶老葉的綜合利用提供科學依據和技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

都勻毛尖茶（夏秋茶）購于貴州都勻，烘干粉碎后，過40目篩，裝袋，4 ℃保存?zhèn)溆谩＠w維素酶、果膠酶購自國藥集團化學試劑有限公司；95%乙醇、硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、十二水磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀等試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑公司；復合酶溶液為等體積1 mg/mL纖維素酶溶液和1 mg/mL 果膠酶溶液混合而成。

1.2 儀器

TU-1901 型雙光束紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；HH-S2 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（鄭州英峪予華儀器有限公司）；BS124S電子分析天平（賽多利斯）PH值S-2C數(shù)字式酸度計（上海理達儀器）；優(yōu)普超純水器（成都超純水有限公司）；中草藥高速粉碎機（北京科偉永興有限公司）

1.3 方法

1.3.1 茶多酚提取工藝流程 茶葉→干燥→粉碎→稱質量→酶法浸取→過濾→離心→上清液→定容檢測→分析茶多酚含量。

1.3.2 單因素試驗 稱取綠茶樣品粉末1.00 g，分別就不同溫度（35、40、45、50、55、65 ℃），不同浸取時間（15、30、45、60、75、90 min），不同酶用量（50、100、150、300 μL），不同pH值（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）和不同料液比（g ∶mL，1 ∶40、1 ∶60、1 ∶80、1 ∶100、1 ∶120、1 ∶140）進行單因素試驗，考察上述各因素對茶多酚提取率的影響，從中選取對提取率影響顯著的因素進行后續(xù)優(yōu)化試驗。

1.3.3 響應面分析試驗設計 在單因素試驗基礎上，選取pH值、提取時間、提取溫度3個因素為試驗因素，以茶多酚提取率為響應指標，采用Box-Behnken響應面法，利用Design-Expert V8.0.6軟件研究各因素間的交互作用及其對茶多酚提取率的影響。試驗設計見表1。

1.3.4 茶多酚提取率的測定 參考國家標準GB/T 8313—2002《茶 茶多酚測定》，采用酒石酸亞鐵比色法測定，具體如下：準確吸取茶多酚提取試液1 mL于25 mL容量瓶中，加入4 mL水和5 mL酒石酸亞鐵，充分混勻，用pH值為7.5的磷酸鹽緩沖液定容，放置約5 min，以試劑空白做參比，于波長540 nm測吸光度D；整個顯色過程在30 min內完成。茶多酚提取率以茶葉質量分數(shù)表示，按下式計算：

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酶用量對茶多酚提取率的影響 由圖1可知，隨著酶用量的增加，茶多酚提取率呈上升趨勢。在酶用量為100 μL時，提取率達到最高值，之后提取率略有上升呈平緩趨勢，即酶用量達到飽和后，底物被水解的速率不再增加。因此，選用酶用量為100 μL用于后續(xù)試驗。

2.1.2 提取時間對茶多酚提取率的影響 由圖2可知，隨著浸取時間的增加，毛尖茶的茶多酚提取率呈直線上升趨勢。在75 min之后茶多酚提取率減緩略有下降，說明通過增加時間無法增加茶多酚提取率；浸取時間過短導致茶多酚提取不完全，時間過長可能導致提取出的茶多酚被氧化；同時茶葉中的某些酚類、單寧及花色素是纖維素酶的天然抑制劑，如在溶液中濃度過度積累會對酶解反應造成抑制[10]，所以最佳提取時間為75 min，作為后續(xù)試驗參數(shù)。

2.1.3 提取溫度對茶多酚提取率的影響 由圖3可知，隨著浸取溫度的提高，毛尖茶中茶多酚的提取率呈上升趨勢。在浸取溫度達到55 ℃時，茶多酚提取率達到最大值，是該體系的最佳反應溫度。通過升高溫度可以促進酶解作用，所以茶多酚提取率在這一段時間內不斷提高；但55 ℃以后，提取率明顯開始下降，這是因為超過酶活性溫度后，部分或者全部酶失去活性，從而酶促反應受到抑制。

2.1.4 pH值對茶多酚提取率的影響 由圖4可知，隨著pH值的增大，茶多酚提取率呈上升趨勢。在pH值為5.5時，提取率達到最高值，之后茶多酚提取率開始下降。與溫度對茶多酚提取率類似，酶活性受pH值影響較大，每種酶都有最適pH值，當偏離最適值時，都會使酶蛋白活力降低或者變性。

2.1.5 料液比對茶多酚提取率的影響 由圖5可知，隨著料液比的增加，茶多酚提取率呈上升趨勢。這是因為提取溶劑量的增大，可以提高茶葉粉末與水溶液間的茶多酚濃度差，更有利于茶多酚向水溶液中擴散。在料液比為1 g ∶120 mL后茶多酚溶出速率明顯降低，繼續(xù)增加溶劑會給后期提取過程造成負擔，不易濃縮；因此選料液比為1 g ∶120 mL作為最佳值。

2.2 響應面分析法確定重要因素的最佳水平

2.2.1 試驗設計及結果 根據Box-Behnken試驗方案設計3因素3水平共17個試驗點進行響應面分析，試驗安排及結果見表2。

對模型方程進行方差分析得知（表3），P=0.000 2表明試驗所選的模型極度顯著；失擬項P= 0.762 1>0.05，表明失擬項差異不顯著，說明回歸模型與試驗數(shù)據擬合度較高；回歸模型決定系數(shù)R2=0.968 0，校正決定系數(shù)R2Adj=0.926 9，表明實測值與預測值高度相關，回歸模型與實測值能夠較好地擬合。模型方程的一次項C影響極顯著（P<0.01）；二次項A2、B2影響均顯著（P<0.05）；交互項AB、AC影響不顯著（P>0.05），交互項BC影響顯著（P<0.05）；此結果表明各因素對茶多酚提取率的影響不是簡單的線性關系。同時由表3可知，響應面優(yōu)化酶法提取茶多酚的工藝參數(shù)中，所選各因素水平范圍內，影響茶多酚提取率的因素按主次順序排列為：溫度>時間>pH值。

2.2.2 響應面圖分析 由圖6至圖8可知，每個因素在特定的取值范圍內，曲面圖和等高線圖都存在響應峰值；并且可以從圖中直觀地了解各因素的交互作用對茶多酚提取率的影響是否顯著。從3組圖中可知，三維曲面都為凸曲面，最高點落在所選區(qū)域內，說明選擇因素水平合理；茶多酚提取率隨pH值（A）、提取時間（B）和提取時間（C）的增加均呈現(xiàn)先增后降的二次關系，等高線的疏密及形狀反映提取時間（B）和提取溫度（C）交互作用對茶多酚提取率影響顯著，pH值（A）和提取時間（B）、pH值（A）和提取溫度（C）的交互作用對茶多酚提取率影響不顯著。

2.3 模型驗證

根據Design-Expert 8.0.6軟件的優(yōu)化功能得到最佳提取工藝條件為： pH值、提取時間和提取溫度分別為5.50、7088 min和60 ℃時，茶多酚提取率預測最大值達到24.623 4%。為更方便操作，最佳提取工藝參數(shù)修正為：pH值為5.50、提取時間為70 min和提取溫度為60 ℃；在此條件下進行3組平行試驗，測得實際茶多酚平均提取率為22.39%，說明此方程模型能夠真實反映所篩選因素對茶多酚提取率的影響。

3 結論

通過單因素試驗和響應面法對茶多酚提取工藝進行優(yōu)化，建立了pH值、提取時間和提取溫度3個因素對茶多酚提取率的二次回歸模型，經驗證此模型準確有效；優(yōu)化后的茶多酚提取工藝條件為pH值5.5、提取時間70 min和提取溫度 60 ℃，在此條件下茶多酚提取率為22.39%。

參考文獻：

[1]羅一帆，郭振飛，陳劍經.茶葉的有效成分及其抗癌作用[J]. 中草藥，2004，35（增刊1）：237-239.

[2]Macedo J A，Battestin V，Ribeiro M L，et al. Increasing the antioxidant power of tea extracts by biotransformation of polyphenols[J]. Food Chemistry，2011，126（2）：491-497.

[3]Cho Y S，Oh J J，Oh K H. Antimicrobial activity and biofilm formation inhibition of green tea polyphenols on human teeth[J]. Biotechnology and Bioprocess Engineering，2010，15（2）：359-364.

[4]陳鈴容. 茶多酚的結構特性及開發(fā)前景[J]. 茶葉科學技術，2005（2）：21.

[5]衛(wèi) 哲，肖 維，黎忠健，等. 應用轉盤塔逆流萃取器從夏秋季次品茶中制備茶多酚[J]. 食品科學，2013，34（14）：35-39.

[6]黃麗鳳，劉友平，黎代余. 茶多酚提取純化工藝研究進展[J]. 中國食品添加劑，2010，98（1）：69-72.

[7]王劍文，許云峰，周建芹，等. 酶法輔助強化中藥提取過程研究進展[J]. 生物加工過程，2008，6（6）：6-11.

[8]葉陳麗，賀 帥，曹偉靈，等. 中藥提取分離新技術的研究進展[J]. 中草藥，2015，46（3）：457-464.

[9]王蕓蕓，李 莉，李香玉，等. 復合酶法提取甘草渣中總黃酮[J]. 化學與生物工程，2008，25（8）：49-51.

[10]劉軍海，楊海濤，刁宇清.復合酶法提取茶多酚工藝條件研究[J]. 食品與機械，2008，24（3）：74-77，80.賈昌路，張銳利，張 宏，等. 新疆阿克蘇地區(qū)核桃品質分析[J]. 江蘇農業(yè)科學，2016，44（4）：351-354.