玉米Argoanute基因家族的全長cDNA克隆與表達分析

翟立紅+周蘭庭+韓鵬+騰峰

摘要：Argonaute（AGO）蛋白是小RNA分子誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC）的核心因子，以玉米自交系B73為材料，利用RLM-RACE技術(shù)，克隆得到玉米17個AGO基因的全長cDNA序列，發(fā)現(xiàn)6個成員具有5′非翻譯外顯子，可能其表達受此機制調(diào)控。同時，利用半定量RT-PCR對其在玉米幼苗不同根系組織（包括初生胚根、冠根、次生胚根和側(cè)根）進行表達分析，結(jié)果表明：未檢測到ZmAGO5b、ZmAGO18b表達，ZmAGO1a/b、ZmAGO2a、ZmAGO10在各類根系中高水平表達，其他11個ZmAGOs表達水平較低，因此揭示選擇性表達不同的ZmAGOs可能是不同類型的根系分化及其功能的精細調(diào)控所必需的。

關(guān)鍵詞：Argonaute基因；克?。?′非翻譯外顯子；表達

中圖分類號： S513.01；Q785

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0041-04

在真核生物中，小RNA（small RNA：sRNA）介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平以及染色質(zhì)水平的基因沉默。植物內(nèi)源 sRNA 包括microRNA （miRNA）和各類小干擾RNA（short interfering RNA，siRNA）[1]。在已知的由sRNA介導(dǎo)的基因表達調(diào)控途徑中，sRNA必須與Argonaute（AGO）蛋白形成沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex：RISC）引導(dǎo)sRNA通過序列互補與靶標（RNA或DNA）結(jié)合，進而降解mRNA、抑制翻譯或修飾染色質(zhì)[1]。由此可見，AGO蛋白是sRNA行使其功能的重要因子。Argonaute蛋白最初是在植物中發(fā)現(xiàn)的[2]，是一類分子量較大、含有可變的N端、PAZ、MID和PIWI結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)[3-4]，其中PAZ和PIWI屬于保守結(jié)構(gòu)域。在細菌和人類中的研究揭示了PAZ、MID、PIWI結(jié)構(gòu)域在小RNA調(diào)控途徑中的作用[5-6]。其中，MID結(jié)合小RNA的5′-磷酸端，使小RNA錨定在AGO蛋白上；PAZ識別小RNA突出的3′ 端[3-4]；PIWI會形成一種類似于RNase H酶的折疊結(jié)構(gòu)，具有內(nèi)源核酸酶的活性。有研究發(fā)現(xiàn)，PIWI內(nèi)存在保守的活性位點Asp-Asp-His（DDH motif）[7]，但DDH motif存在與否并不能完全代表AGO蛋白是否具有催化功能[8]。在擬南芥中，證實有催化功能的AGO蛋白有AtAGO1、AtAGO4、AtAGO7 和AtAGO10[9-13]。

不同物種中，AGO蛋白的數(shù)目不同。擬南芥基因組中注釋有10個AGO蛋白，水稻中有19個AGO蛋白，玉米中有17個AGO蛋白。擬南芥的AGO蛋白大致可分為三大類，AGO1、AGO5 和AGO10為第1類，AGO2、AGO3、AGO7為第2類，AGO4、AGO6、AGO8和AGO9為第3類[14]。Kapoor等把水稻和擬南芥AGO蛋白劃分為四大類，分別為AGO1、MEL1/AGO5、ZIPPY/AGO7和AGO4[15]。Zhai等將玉米中的AGO蛋白劃分為五大類，將與OsAGO18同源性較高的2個蛋白單獨劃為一類[16]。目前證實，植物中的AGO1主要參與miRNA通路，在植物的各個生長發(fā)育階段均起著重要的調(diào)控作用[9，17]。在擬南芥中，與AtAGO1親緣關(guān)系最近的AtAGO10突變后表現(xiàn)為莖尖分生組織發(fā)育異常，AtAGO1和AtAGO10競爭結(jié)合miR165/miR166，調(diào)節(jié)HD-ZIP Ⅲ 的表達，進而調(diào)節(jié)SAM發(fā)育和保持[18]。擬南芥中的AtAGO5僅在生殖組織中表達[19]，與水稻中的OsMEL1表達相似[15]。AGO7在反式作用的短干擾RNA（trans-acting short interfering RNAs，tasiRNA）的形成及其功能途徑中起重要作用[12]。AtAGO2與AtAGO3結(jié)構(gòu)高度相似且功能冗余，AGO2在植物逆境環(huán)境下高效表達[15]，暗示在抗逆過程中起重要作用。AGO4蛋白主要是圍繞RNA介導(dǎo)的DNA甲基化（RdDM）過程中的作用機制展開，在整個發(fā)育過程中均有較高水平表達[15]。AGO6、AGO4在DNA甲基化上存在部分功能冗余，最近的研究證實AtAGO6在擬南芥莖和根的分生組織中存在RNA介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄水平基因沉默的功能[20]。AtAGO8、AtAGO9序列相似度很高，其中，AtAGO8在擬南芥所有組織中表達量均較低，被認為是一個假基因[21]。最近的報道發(fā)現(xiàn)擬南芥中的 AtAGO9 在胚珠和花藥中的表達量非常高[22]。而與AtAGO9高度同源的玉米AGO104基因，控制玉米的無融合生殖，在性母細胞旁的體細胞大量富集[23]。截至目前，植物不同根系中AGO基因家族的表達模式還未見報道。

玉米（Zea mays L.）是當今世界最重要的糧、飼、能源、工業(yè)原料兼用的高產(chǎn)作物。根系是玉米重要的組織器官，在保持植株形態(tài)、水分和營養(yǎng)吸收與運輸、響應(yīng)植物對環(huán)境脅迫等方面起著重要的作用。本研究以玉米測序自交系B73為材料，選取玉米幼苗不同根系組織包括初生胚根、冠根、次生胚根和側(cè)根對17個AGO基因進行表達分析，為探索AGO基因在根系形態(tài)建成方面的調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)，與此同時，利用RACE技術(shù)對玉米17個AGO基因的全長cDNA進行克隆測序分析，以完善玉米AGO基因的序列信息，為全面解析玉米的AGO基因提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗選用的材料玉米自交系B73，為美國優(yōu)良自交系，配合力好，具有參考基因組序列。

選取大小均勻、籽粒飽滿的玉米B73種子用15%的H2O2浸泡30 min進行表面消毒處理后，滅菌蒸餾水沖洗3次，播種于沙缽中（沙子高壓滅菌），室內(nèi)培養(yǎng)。當初生胚根和次生胚根長出時，分別取樣，最后取側(cè)根、冠根，每種根系取樣不少于3株，液氮速凍，-80 ℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 全長cDNA克隆 使用FirstChoice RLM-RACE（Ambion公司）試劑盒（貨號：AM1700）對玉米中鑒定到的ZmAGO基因進行5′末端和3′ 末端的擴增，試驗步驟嚴格按照說明書執(zhí)行，5′-RACE和3′-RACE所用的巢式引物見Zhai等發(fā)表的文章[16]，最后一步擴增得到的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，將目的條帶切膠回收，連接至pGEM-T Easy載體（Promega公司），4 ℃連接過夜后進行轉(zhuǎn)化，篩選約10個陽性克隆送至Invitrogen公司進行菌液測序。

1.2.2 半定量RT-PCR 以Zhai等報道的17個玉米AGO基因家族[16]作為研究對象，利用NCBI網(wǎng)站上在線工具 Primer-Blast 進行基因特異引物設(shè)計（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov），擴增產(chǎn)物進行測序以確保擴增片段的特異性，所使用的引物信息見表1，以Actin（NM_001155179）作為內(nèi)參基因，進行玉米AGO基因家族成員的半定量RT-PCR。首先用內(nèi)參引物對4個組織的cDNA進行不同循環(huán)數(shù)目的PCR擴增，確定處于指數(shù)擴增期的循環(huán)數(shù)并調(diào)整模板加入體積使其在相同的循環(huán)數(shù)下亮度一致，然后利用內(nèi)參調(diào)好的模板體積進行基因擴增，此時同樣要進行指數(shù)擴增期循環(huán)數(shù)的確定，最終得出不同基因在不同組織中的相對表達水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 AGO家族基因的全長cDNA克隆及分析

基于所預(yù)測的基因序列設(shè)計基因特異性引物，使用RACE技術(shù)擴增所有17個基因的全長cDNA，我們共得到了11個ZmAGOs的5′末端和17個ZmAGOs的3′末端。大多數(shù)基因的轉(zhuǎn)錄本與B73 RefGen v2所預(yù)測的相似，但ZmAGO1b與B73 RefGen v2 所預(yù)測的基因結(jié)構(gòu)存在較大差異，實際擴增所得到的5′-UTR第1個184 bp長度的非編碼外顯子（untranslated exon）位于預(yù)測基因的第1內(nèi)含子區(qū)域，起始密碼子后移15 bp，說明該基因可能存在多個選擇性剪切轉(zhuǎn)錄本。通過序列分析發(fā)現(xiàn)，ZmAGO1a/b/f、ZmAGO5c、ZmAGO4、ZmAGO9存在5′非編碼外顯子，有可能這6個ZmAGO基因受該機制調(diào)控。

2.2 AGO家族基因在不同類型根組織中的表達分析

為詳細鑒定ZmAGOs基因在各類根系組織中的表達，將各類根組織細分為：冠根、初生胚根、次生胚根、側(cè)根并分別取樣（圖2）。圖3的RT-PCR結(jié)果表明：ZmAGO5b和 ZmAGO18b 在被測的玉米根系組織中未檢測到表達，15個ZmAGOs在玉米根系組織中表達，其中ZmAGO1a、ZmAGO1b、ZmAGO2a、ZmAGO10在各類根系都高水平表達，暗示這些基因在玉米根系發(fā)育中的重要作用；其他11個ZmAGOs基因的表達水平則相對較低。另外，有些ZmAGOs基因也顯示出其在不同類型根組織中表達的特異性，如ZmAGO2b、ZmAGO9在冠根、初生胚根和側(cè)根中表達，但在次生胚根中未檢測到其表達；ZmAGO5d、ZmAGO4則在冠根、次生胚根和側(cè)根中表達，但在初生胚根中未檢測到其表達。不同類型的根組織中大多數(shù)ZmAGOs基因具有相似的表達模式，說明這些ZmAGOs基因是各種根系組織生長發(fā)育共同需要的，以保持根系的基本組織特性；而不同類型的根組織表達不同的ZmAGOs基因，說明選擇性地表達不同的ZmAGOs基因可能是不同類型的根系分化及其功能的精細調(diào)控所必需的。

2.3 ZmAGOs與OsAGOs的微共線性分析

通過微共線性分析發(fā)現(xiàn)（圖4），玉米第10染色體的ZmAGO1c、ZmAGO2b，第2染色體的ZmAGO2a和ZmAGO1b與水稻第4染色體的OsAGO1b、OsAGO2的片段高度同源；玉米第9染色體的ZmAGO10a，第6染色體的ZmAGO10b與水稻第6染色體的OsPNH1高度同源；玉米第2染色體的ZmAGO18a，第1染色體的ZmAGO18b與水稻第7染色體的OsAGO18高度同源。由此推測玉米和水稻分化后，可能玉米的部分基因組序列發(fā)生了重復(fù)或加倍。

3 討論

小RNA介導(dǎo)的基因沉默在植物的生長發(fā)育和抗逆脅迫響應(yīng)等方面均發(fā)揮重要作用，RISC作為小RNA 行使功能的主要組分，AGO蛋白是核心元件，甚至有學(xué)者認為研究AGO蛋白所結(jié)合的小RNA的表達量比整體研究小RNA的表達量更能說明某種小RNA的功能[24]。近年來，在植物中開展關(guān)于AGO蛋白功能及其結(jié)合的小RNA類型的研究越來越多，使得AGO蛋白的研究成為小RNA調(diào)控途徑的熱點。目前，AGO基因的功能在模式植物擬南芥中的研究最為全面和透徹，而在玉米中的報道較少。Qian等利用B73 RefGen v1的基因組序列對玉米全基因組的AGO蛋白進行了預(yù)測和表達分析，結(jié)果顯示，玉米基因組存在18個AGO基因，并以玉米幼苗為材料對AGO基因家族在干旱和鹽脅迫下的表達模式進行了分析[25]。許鑫等以玉米自交系昌7-2為材料，研究了6個AGO基因在玉米幼苗第1葉、第2葉、第3葉、第4葉、總根、莖尖和胚芽鞘中的表達情況[26]。Zhai等利用B73 RefGen v2基因組序列發(fā)現(xiàn)了17個編碼AGO蛋白的基因，并選取了8個包含營養(yǎng)組織和生殖組織的材料進行了表達分析，結(jié)果顯示，所有AGO家族基因在生殖組織的表達遠高于營養(yǎng)組織[16]，這與水稻中OsAGOs的表達模式相似[15]，預(yù)示著小RNA在生殖生長階段發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

根系是玉米重要的組織器官，在保持植株形態(tài)、水分和營養(yǎng)吸收與運輸、響應(yīng)植物對環(huán)境脅迫等方面起著重要的作用。本研究以Zhai等報道的17個ZmAGO基因為研究對象，以玉米自交系B73為材料，對該基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)進行了解析，并將玉米幼苗的4種根系分別取材進行表達分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ZmAGOs有6個成員存在5′非翻譯外顯子，可能AGO基因家族受到此機制的調(diào)控[16]；對ZmAGOs在各類根系中的表

達分析表明，有些ZmAGOs基因顯示出其在不同類型根組織中表達的特異性，如ZmAGO2b、ZmAGO9在冠根、初生胚根和側(cè)根中表達，但在次生胚根中未檢測到其表達，ZmAGO5d、ZmAGO4則冠根、次生胚根和側(cè)根中表達，但在初生胚根中未檢測到其表達，說明選擇性地表達不同的ZmAGOs基因可能是不同類型的根系分化及其功能的精細調(diào)控所必需的。

參考文獻：

[1]Voinnet O. Origin，biogenesis，and activity of plant microRNAs[J]. Cell，2009，136（4）：669-687.

[2]Bohmert K，Camus I，Bellini C，et al. AGO1 defines a novel locus of Arabidopsis controlling leaf development[J]. The EMBO Journal，1998，17（1）：170-180.

[3]Tolia N H，Joshua-Tor L. Slicer and the argonautes[J]. Nature Chemical Biology，2007，3（1）：36-43.

[4]Hutvagner G，Simard M J. Argonaute proteins：key players in RNA silencing[J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology，2008，9（1）：22-32.

[5]Song J J，Smith S K，Hannon G J，et al. Crystal structure of argonaute and its implications for RISC slicer activity[J]. Science，2004，305（5689）：1434-1437.

[6]Liu J，Carmell M A，Rivas F V，et al. Argonaute2 is the catalytic engine of mammalian RNAi[J]. Science，2004，305（5689）：1437-1441.

[7]Rivas F V，Tolia N H，Song J J，et al. Purified argonaute2 and an siRNA form recombinant human RISC[J]. Nature Structural & Molecular Biology，2005，12（4）：340-349.

[8]Vaucheret H. Plant argonautes[J]. Trends in Plant Science，2008，13（7）：350-358.

[9]Qi Y，Denli A M，Hannon G J. Biochemical specialization within Arabidopsis RNA silencing pathways[J]. Molecular Cell，2005，19（3）：421-428.

[10]Qi Y，He X，Wang X J，et al. Distinct catalytic and non-catalytic roles of argonaute4 in RNA-directed DNA methylation[J]. Nature，2006，443（7114）：1008-1012.

[11]Baumberger N，Baulcombe D C. Arabidopsis argonaute1 is an RNA Slicer that selectively recruits microRNAs and short interfering RNAs[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2005，102（33）：11928-11933.

[12]Montgomery T A，Howell M D，Cuperus J T，et al. Specificity of argonaute7-miR390 interaction and dual functionality in TAS3 trans-acting siRNA formation[J]. Cell，2008，133（1）：128-141.

[13]Ji L J，Liu X G，Yan J，et al. Argonaute10 and argonaute1 regulate the termination of floral stem cells through two microRNAs in Arabidopsis[J]. PLoS Genetics，2011，7（3）：e1001358.

[14]Morel J B，Godon C，Mourrain P，et al. Fertile hypomorphic argonaute（ago1） mutants impaired in post-transcriptional gene silencing and virus resistance[J]. The Plant Cell，2002，14（3）：629-639.

[15]Kapoor M，Arora R，Lama T，et al. Genome-wide identification，organization and phylogenetic analysis of Dicer-like，argonaute and RNA-dependent RNA polymerase gene families and their expression analysis during reproductive development and stress in rice[J]. BMC Genomics，2008，9（1）：451.

[16]Zhai L，Sun W，Zhang K，et al. Identification and characterization of argonaute gene family and meiosis-enriched argonaute during sporogenesis in maize[J]. Journal of Integrative Plant Biology，2014，56（11）：1042-1052.

[17]Wu L，Zhang Q，Zhou H，et al. Rice MicroRNA effector complexes and targets[J]. The Plant Cell，2009，21（11）：3421-3435.

[18]Zhu H，Hu F，Wang R，et al. Arabidopsis argonaute10 specifically sequesters miR166/165 to regulate shoot apical meristem development[J]. Cell，2011，145（2）：242-256.

[19]Schmid M，Davison T S，Henz S R，et al. A gene expression map of Arabidopsis thaliana development[J]. Nature Genetics，2005，37（5）：501-506.

[20]Changho E，Lorkovic Z J，Ulf N，et al. AGO6 functions in RNA-mediated transcriptional gene silencing in shoot and root meristems in Arabidopsis thaliana[J]. PLoS One，2011，6（10）：e25730.

[21]Takeda A，Iwasaki S，Watanabe T，et al. The mechanism selecting the guide strand from small RNA duplexes is different among argonaute proteins[J]. Plant & Cell Physiology，2008，49（4）：493-500.

[22]Durán-Figueroa N，Vielle-Calzada J P. Argonaute9-dependent silencing of transposable elements in pericentromeric regions of Arabidopsis[J]. Plant Signaling & Behavior，2010，5（11）：1476-1479.

[23]Singh M，Goel S，Meeley R B，et al. Production of viable gametes without meiosis in maize deficient for an argonaute protein[J]. The Plant Cell，2011，23（2）：443-458.

[24]Thomson D W，Pillman K A，Anderson M L，et al. Assessing the gene regulatory properties of Argonaute-bound small RNAs of diverse genomic origin[J]. Nucleic Acids Research，2015，43（1）：470-481.

[25]Qian Y，Cheng Y，Cheng X，et al. Identification and characterization of Dicer-like，argonaute and RNA-dependent RNA polymerase gene families in maize[J]. Plant Cell Reports，2011，30（7）：1347-1363.

[26]許 鑫，李丹丹，李雙江，等. 玉米AGO基因的克隆與表達分析[J]. 西北植物學(xué)報，2014，34（3）：449-453.肖 松，周棱波，張國兵，等. 醬香型白酒用糯高粱種質(zhì)遺傳多樣性分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（4）：45-49.