醬香型白酒用糯高粱種質遺傳多樣性分析

肖松+周棱波+張國兵+邵明波+乙引+張立異

摘要：醬香型白酒又稱茅香型白酒，其中最有名的代表就是國酒茅臺，主要原料為優(yōu)質糯高粱。由于其獨特的釀造工藝，對高粱品質有特殊的要求。目前，對醬香型酒用糯高粱種質資源遺傳多樣性缺乏全面的調查，已經(jīng)妨礙了酒用高粱品種的選育。因此，采用28對SSR分子引物對145個貴州酒用糯高粱種質進行全基因組掃描，共得到61個多態(tài)位點，引物位點的多態(tài)信息含量指數(shù)（polymorphism information content，PIC）值范圍為0.02～0.66，平均值為0.42，Jacard遺傳相似系數(shù)（genetics similarity，GS）變異范圍為 0.60～0.98，平均值為0.71。根據(jù)高粱資源親緣關系的遠近，非加權組平均法 （unweighted pair-group method with arithmetic mean，UPGMA）聚類分析結果顯示，在GS值為0.63 水平上主要聚集形成2個主要的類群（GⅠ、GⅡ）。進一步進行主坐標分析（principal coordinates analysis，PCOA）顯示，這批育種資源由大、小2個亞群組成。試驗結果表明，貴州白酒用糯高粱育種資源具有較高的遺傳相似性，遺傳多樣性水平較低，遺傳背景較為狹窄，研究結果對貴州省今后的醬香型白酒用糯高粱的選育具有一定的指導意義。

關鍵詞：糯高粱；SSR分子標記；遺傳多樣性；聚類分析；主坐標分析

中圖分類號： S514.03

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0045-05

高粱（Sorghum bicolor L.）是全世界種植的第五大禾谷類作物，作為C4植物的模式作物，因其光合效率高、耐高溫干旱、耐貧瘠等優(yōu)點而備受關注。高粱栽培品種根據(jù)用途不同一般可以分為3種類型：甜高粱、飼料高粱以及作為糧食的籽粒高粱，在籽粒高粱中又將直鏈淀粉含量在0～5%之間的稱為糯高粱[1]。釀造茅臺酒等醬香型高檔白酒的主要原料是優(yōu)質籽粒用糯高粱[2]。面對紅纓子等貴州省主栽糯高粱品種的產(chǎn)量無法滿足生產(chǎn)需求的現(xiàn)狀[3]，貴州省的酒用糯高粱育種工作開展已經(jīng)迫在眉睫。全面了解種質資源的遺傳多樣性信息是選擇雜交親本、建立雜種優(yōu)勢群的基礎，對于選育優(yōu)質、高產(chǎn)和抗病的糯高粱新品種具有指導意義，對于糯高粱遺傳多樣性的研究、遺傳資源的保存與利用有重要意義。

分子標記技術在遺傳多樣性分析的研究中有著重要地位，主要包括限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、隨機擴增多態(tài)性（rapid amplify polymorphism，RAPD）、簡單序列重復長度多態(tài)性（simple sequence repeats，SSR）和擴增酶切片段長度多態(tài)性（amplification fragment length polymorphism，AFLP）等分子標記技術。在高粱遺傳作圖、遺傳多樣性等研究中，分子標記技術有著豐富的理論基礎。Chittenden等于1994年利用276個RFLP位點完成第1個高粱連鎖圖[4]。Ayana等利用RAPD標記對埃塞俄比亞、厄立特里亞高粱的遺傳多樣性進行分析，發(fā)現(xiàn)來自不同地區(qū)的高粱遺傳多樣性并不豐富，在聚類中不能按照地域來進行類群劃分[5]。Boivin等用AFLP、RFLP分子標記，并結合形態(tài)學標記對飽和高粱完成了完整遺傳繪圖，并且得出了AFLPs以及基因組分布不均勻的結論[6]。在眾多分子標記中，由于SSR分子標記具有較高的多態(tài)性水平、遍布于整個基因組、檢測手段簡單快速等特點，自Brown等于1996年開發(fā)了49對擴增多態(tài)性良好的高粱SSR標記引物[7]以來，SSR標記在高粱的遺傳多樣性研究中得到更多的關注。余傳漲等利用52個SSR標記調查了我國41個高粱品種的遺傳多樣性，并通過聚類分析將這些高粱分為籽粒高粱、甜高粱2個類群[1]。張晗等利用SSR標記對國內外253份高粱品種進行遺傳多樣性分析，得出中國高粱與國外高粱之間遺傳分化明顯的結論[8]。趙香娜等利用24對SSR引物研究了206份國內外甜高粱種質資源的遺傳變異，利用遺傳相似系數(shù)矩陣，按UPGMA方法對206份甜高粱品種進行聚類分析，將其分為2個大的類群[9]。倪先林等利用25對SSR標記評價了29份糯高粱種質資源，共得到了59個等位基因，通過聚類得出糯高粱品種的親緣關系與地理來源關系不大的結論[10]。

近年來，由于貴州省種植的酒用糯高粱品種單一，紅纓子等主栽品種農(nóng)藝性狀較差，產(chǎn)量水平受到限制，不利于機械化生產(chǎn)，因此選育優(yōu)質高產(chǎn)、適合機械化生產(chǎn)的糯高粱新品種迫在眉睫。高粱種質資源作為其遺傳改良的重要來源，是培養(yǎng)高產(chǎn)、優(yōu)質高粱新品種的重要物質基礎。針對貴州省醬香型白酒用高粱的種質資源遺傳多樣性的研究較少。所以本研究對來自貴州、四川地區(qū)的145份醬香酒用高粱種質資源進行基因分型，以期了解酒用糯高粱的遺傳多樣性和群體結構，為拓寬群體遺傳基礎，組配選育優(yōu)質高產(chǎn)的抗病、抗蟲新品種提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

145份貴州省酒用糯高粱育種資源，均由貴州省農(nóng)業(yè)科學院旱糧研究所高粱研究課題組提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取 DNA的提取參照陳宏的CTAB法[11]，用核酸蛋白測定儀檢測DNA濃度，并用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測純度，存于-20 ℃冰箱中備用。

根據(jù)每個標記的等位基因出現(xiàn)與否，將標記轉換為0和1的二進制矩陣。將該矩陣作為輸入文件，利用NTSYSPC V2.0軟件[12]，計算Jacard遺傳相似性系數(shù)，進行PCoA分析、UPGMA聚類分析。

2 結果與分析

2.1 分子標記掃描

利用28對SSR引物對145份糯高粱育種資源進行掃描，一共獲得了61個多態(tài)性位點，最少擴增多態(tài)性片段為1條，最多擴增5條，平均擴增2.18條。引物txp75的多態(tài)性最高，擴增了5條多態(tài)性片段。PIC值計算結果（表2）顯示，PIC值范圍為0.02～0.66，平均值為0.42；較多引物的PIC值出現(xiàn)在0.21～0.30范圍，所占比例為20%；而較少的引物PIC值出現(xiàn)在0～0.10、0.41～0.50這2個范圍，其比例均為10%；PIC值在0.61～0.70之間引物對應有txp38、txp120、txp75、txp50、txp61。其中PIC值在0.21～0.30范圍內的引物最多，有6對，分別是txp69、txp217、txp38、txp12、txp47、txp17。

2.2 遺傳多樣性和群體結構分析

根據(jù)61個SSR標記的基因分型數(shù)據(jù)，計算了品種（系）間的Jacard遺傳相似系數(shù)（genetic similarity，GS），其變異范圍為 0.60～0.98，平均值0.71。利用非加權組平均法進行聚類分析，UPGMA結果顯示，這1批糯高粱育種根據(jù)親緣關系的遠近聚集在一起（圖2）。145份糯高粱資源在GS值0.63水平上主要聚集形成2個主要的類群：第1個群（GⅠ）由2個亞群組成，其中的1個亞群主要由貴州高粱主栽品種紅高粱的衍生品系所組成，而且穗型多呈側披散狀；第2個群（GⅡ）沒有清晰地劃分為幾個亞群，主要包含其他不同血緣關系的育種資源。

為了調查試驗材料的群體結構，利用61個多態(tài)性位點標記進行PCoA分析。如圖3所示，第1主坐標（PCo-1）、第2主坐標（PCo-2）分別解釋5.6%、3.7%的群體遺傳變異。145份高粱材料聚集形成了2個群：右上側的第1類群（group Ⅰ）包含大多數(shù)材料，在PCo-1、PCo-2軸的2個方向上都較為擴散。左下側的第2類群（group Ⅱ）只包括了16個高粱材料，聚集較為緊密，主要由血緣關系與紅纓子等貴州糯高粱品種較遠的外省高粱資源組成。

3 討論

以國酒茅臺為龍頭的釀酒業(yè)是貴州省的傳統(tǒng)支柱產(chǎn)業(yè)和特色優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)，也是貴州省財政收入的重要來源之一。雖然貴州省高粱主栽品種紅纓子等在產(chǎn)量方面與以往推廣品種相比有所提高，但仍不能滿足貴州省釀酒發(fā)展的迫切需求，且雜交高粱引種表現(xiàn)病蟲害嚴重、轉基因安全等問題[3，13-14]。因此，應全面了解貴州醬香型酒用高粱種質資源的遺傳多樣性信息，以期為培育優(yōu)質、高產(chǎn)和抗病的育種工作選出雜交親本，并為建立雜種優(yōu)勢群提供理論指導。

在本項研究中，利用SSR分子標記掃描了145份貴州省酒用糯高粱材料，初步了解貴州省糯高粱現(xiàn)有育種資源的遺傳多樣性水平。試驗結果表明，貴州省白酒用糯高粱具有較高的遺傳相似性，說明這批育種資源具有較低的遺傳多樣性。而UPGMA聚類不能將這些高粱育種資源清晰地劃分成不同的類群，只是在GS=0.68的位置大概將其劃分為2個類群。在其他的研究中也得到相似的結果。Ayana等對埃塞俄比亞和厄立特里亞高粱的遺傳多樣性研究中，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)的高粱遺傳多樣性并不豐富，在聚類中不能按照地域來進行劃分[5]。Ritter等在2007年利用277個AFLP標記對95份美國甜高粱、籽粒高粱進行掃描，通過聚類分析發(fā)現(xiàn)，并不能將2種高粱按照品種的分類而在遺傳學上將其分為2個類群[15]。余傳漲等在2010年利用52個SSR標記調查了41個高粱品種的遺傳多樣性，通過聚類分析將這些高粱分為籽粒高粱、甜高粱2個類群，但是卻不能清晰地劃分2類高粱之間的遺傳界限[1]。張晗等在2011年利用SSR標記，以69份國外品種為對照，對12個地區(qū)184份中國高粱地方品種進行的遺傳多樣性分析結果表明，中國高粱與國外高粱之間遺傳分化明顯，而中國高粱地方品種地區(qū)間和類型間分化極弱，不能將這些高粱按地區(qū)或類型分開[8]。目前出現(xiàn)的高粱遺傳多樣性分析不能明確劃分類群的原因，可能是由于栽培品種與自然品種高頻的異型雜交，這與頻繁的人類活動影響密不可分[5]。本研究的PCoA分析結果顯示，貴州省糯高粱育種資源多數(shù)具有紅纓子的血緣，表現(xiàn)為植株高大、無效分蘗較多、長穗側散披狀。只有少數(shù)外來資源與其血緣關系較遠，表現(xiàn)較大的表型差異，植株較矮，穗型直立緊湊。

本研究結果顯示，針對貴州省醬香型白酒用糯高粱育種資源具有較高的遺傳相似性，遺傳多樣性水平較低，從分子水平解釋了現(xiàn)有糯高粱種質資源貧乏、遺傳基礎狹窄、產(chǎn)量水平低下等問題。因此，在我們今后的高粱育種中，應該增加種質資源的遺傳多樣性，利用標記輔助育種等手段，選育優(yōu)質高產(chǎn)抗病、適合機械化生產(chǎn)、符合醬香型白酒釀造工藝的新品種，更好地為貴州特色優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)服務。

參考文獻：

[1]余傳漲，翟國偉，鄒桂花，等. 41個高粱品種遺傳多樣性的SSR標記檢測[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報，2010，26（2）：248-253.

[2]董懷玉，徐秀德，姜 鈺，等. 高粱糯質資源創(chuàng)新及其利用研究[J]. 植物遺傳資源學報，2007，8（3）：321-324.

[3]吳兆發(fā)，羅胡科，劉 黔，等. 應用灰色關聯(lián)分析法篩選優(yōu)質酒用糯高粱種質[J]. 種子，2012，31（6）：61-65.

[4]Chittenden L M，Schertz K F，Lin Y R，et al. A detailed RFLP map of Sorghum bicolor × S. propinquum，suitable for high-density mapping，suggests ancestral duplication of sorghum chromosomes or chromosomal segments[J]. Theoretical and Applied Genetics，1994，87（8）：925-933.

[5]Ayana A，Bryngelsson T，Bekele E. Genetic variation of Ethiopian and Eritrean sorghum [Sorghum bicolor （L.） Moench] germplasm assessed by random amplified polymorphic DNA （RAPD）[J]. Genetic Resources and Crop Evolution，2000，47（5）：471-482.

[6]Boivin K，Deu M，Rami J F，et al. Towards a saturated sorghum map using RFLP and AFLP markers[J]. Theoretical and Applied Genetics，1999，98（2）：320-328.

[7]Brown S M，HopkinsM S， Mitchell S E，et al. Multiple methods for the identification of polymorphic simple sequence repeats （SSRs） in sorghum [Sorghum bicolor （L.） Moench][J]. Theoretical & Applied Genetics，1996，93（1/2）：190-198.

[8]張 晗，王建成，王東建，等. 中國高粱地方品種遺傳多樣性評價及中、外高粱遺傳變異水平比較[J]. 作物學報，2011，37（2）：224-234.

[9]趙香娜，岳美琪，劉 洋，等. 國內外甜高梁種質遺傳多樣性的SSR分析[J]. 植物遺傳資源學報，2010，11（4）：407-412.

[10]倪先林，趙甘霖，劉天朋，等. SSR分子標記在糯高粱種質資源遺傳多樣性分析中的應用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報，2015，31（1）：16-22.

[11]陳 宏. 基因工程試驗技術[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2005.

[12]Rnhlf F J.NTSYS-pc：numerical taxonomy and multivariate analysis system version 2.1[M]. New York：Exeter Publications，2000.

[13]彭 秋. 貴州釀造高粱育種現(xiàn)狀、問題及對策[J]. 種子，2011，30（2）：68-68，71.

[14]彭忠華，吳盛黎. 灑用高粱生育特性及產(chǎn)量性狀研究[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學，1991（1）：29-34.

[15]Ritter K B，Mcintyre C L，Godwin I D，et al. An assessment of the genetic relationship between sweet and grain sorghums，within Sorghum bicolor ssp. bicolor （L.） Moench，using AFLP markers[J]. Euphytica，2007，157（1/2）：161-176.鄧志勇，曲芬霞，陳春嵐，等. 響應面法優(yōu)化雞血藤懸浮細胞產(chǎn)異黃酮的研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2016，44（4）：50-53.