菌糠中產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選、鑒定及增殖條件響應面法優(yōu)化

秦翠靜+陳寶江+忻龍祚

摘要：為了從菌糠中篩選高產(chǎn)纖維素酶的菌株，鑒定并優(yōu)化其培養(yǎng)條件，利用纖維素剛果紅篩選平板初篩，搖瓶復篩后得到菌株，鑒定后通過響應面法優(yōu)化培養(yǎng)條件。結(jié)果表明，分離篩選得到的高產(chǎn)纖維素酶的菌株，經(jīng)過形態(tài)觀察、生理生化鑒定以及16S rRNA序列分析，初步鑒定為芽孢桿菌屬枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），命名為S-4。采用響應面法對菌株S-4進行增殖條件的優(yōu)化，得到3個顯著因子，分別為葡萄糖添加量13.08 g/L，蛋白胨添加量 6.52 g/L，KH2PO4添加量0.37 g/L。通過響應面法優(yōu)化后，活菌量比初始培養(yǎng)提高了34.49%。

關鍵詞：菌糠；枯草芽孢桿菌；纖維素酶；響應面法；培養(yǎng)基優(yōu)化

中圖分類號：S816.3 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2016）11-0457-03

菌糠是培育食用菌后所剩的糠類物質(zhì)，含有豐富的纖維素、粗蛋白等營養(yǎng)物質(zhì)。隨著我國對食用菌需求量的加大，菌糠的產(chǎn)量也大大增加，菌糠資源的二次利用以及環(huán)境保護等方面面臨極大的挑戰(zhàn)[1-2]。近年來的大量研究表明，利用微生物發(fā)酵菌糠可以制成微生物制劑及飼料，纖維素、木質(zhì)素等被不同程度地降解，粗蛋白、粗脂肪均高于未經(jīng)發(fā)酵的基質(zhì)，可以緩解資源的浪費[3]。另外，將菌糠制備成益生菌制劑用于動物飼養(yǎng)，不僅有利于動物的消化吸收，而且降低了飼料成本[4-5]。

以往研究中的發(fā)酵菌糠所用菌株多為保藏菌種，關于菌糠中菌種利用的報道很少。本試驗從菌糠中篩選出1株產(chǎn)纖維素酶能力強的菌株S-4，該菌株產(chǎn)生的纖維素酶可以更好地利用菌糠中的纖維素，降低纖維素含量。經(jīng)生理生化、16S rRNA序列對比及分析鑒定，菌株S-4為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），羧甲基纖維素酶（carboxymethyl cellulase enzyme，CMCase）活力為67.5 U/ml。采用軟件Design-Expert 8.0的Plackett-Burman試驗篩選出對響應值影響較大的3個因素，利用最陡爬坡試驗逼近最大響應區(qū)域，用Box-Behnken試驗進一步優(yōu)化得到最大響應值及最優(yōu)增殖條件。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品 菌糠樣品由河北農(nóng)業(yè)大學動物科技學院提供。

1.1.2 試劑 羧甲基纖維素鈉（簡稱CMC-Na）、酵母提取物、蛋白胨、牛肉膏均由北京奧博星有限公司提供。MgSO4·7H2O、K2HPO4、KH2PO4、葡萄糖由天津福晨化學試劑廠提供。

1.1.3 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、加水補足至1 000 mL，pH值7.0～8.0，121 ℃ 滅菌20 min，備用；發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：CMC-Na 10 g、KH2PO4 2 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、蛋白胨5 g、酵母粉5 g，加水補足至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min，備用。剛果紅篩選培養(yǎng)基：CMC-Na 2 g、（NH4）2SO4 2 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO4 1 g、NaCl 0.5 g、剛果紅0.4 g、瓊脂20 g，加水補足至1 000 mL，pH值7.0，121 ℃滅菌30 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株篩選

1.2.1.1 富集培養(yǎng) 菌糠中添加2%糖蜜、1%硫酸銨、60%水，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。將發(fā)酵后的菌糠按 1 ∶9 的比例置于生理鹽水中，靜置30 min，5 000 r/min離心 5 min，將離心后得到的菌懸液進行梯度稀釋，涂布后于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)48 h。

1.2.1.2 產(chǎn)纖維素酶菌株初篩 將培養(yǎng)后的菌糠按1 ∶9的比例溶于生理鹽水中，5 000 r/min離心5 min，將離心后得到的菌懸液進行梯度稀釋，并涂布于剛果紅篩選培養(yǎng)基上，37 ℃ 培養(yǎng)24 h后放置2 d，測量透明圈直徑與菌落直徑，挑選出透明圈直徑與菌落直徑比值（簡稱圈菌比）較大的作為初篩菌株[6-7]，在剛果紅初篩平板上進行劃線分離純化，并于斜面保存菌種。

1.2.1.3 產(chǎn)纖維素酶菌株復篩 將初篩得到的菌株接種到產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于37 ℃、160 r/min培養(yǎng)48 h，后于4 ℃、5 000 r/min 離心10 min，測定上清液的羧甲基纖維素酶活性[8]。

1.2.2 菌株鑒定

1.2.2.1 形態(tài)學特征及生理生化鑒定 觀察菌株的菌落形態(tài)，革蘭氏染色后觀察菌株顯微形態(tài)。利用細菌微量生化鑒定管進行生理生化鑒定[9]。

1.2.2.2 菌株的基因鑒定 提取菌株的基因組，并對基因組進行擴增，采用試劑盒割膠回收之后連接片段，進行熱轉(zhuǎn)化，對基因片段進行PCR擴增。擴增引物的合成以及測序工作由華大基因完成。得到16S序列后，在NCBI系統(tǒng)通過Blast進行序列比對分析，利用Mega 5.0軟件的鄰接法創(chuàng)建系統(tǒng)發(fā)育樹[10-12]。

1.2.3 響應面法優(yōu)化菌株S-4發(fā)酵條件 通過Plackett-Burman（PB）試驗設計，從7個試驗因素中篩選出3個顯著影響因子[13-14]，利用最陡爬坡試驗，使因素水平值逼近最大響應區(qū)域，結(jié)合響應面法BB試驗設計進一步研究，并利用Design Expert軟件進行回歸分析[15-16]，尋求最佳水平，得到最優(yōu)發(fā)酵條件[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌糠篩菌

由表1可知，圈菌比最大的菌株S-4為產(chǎn)纖維素酶能力最強的菌株。

搖瓶發(fā)酵復篩結(jié)果顯示，菌株S-1、S-4的CMC活性分別為22.4、67.5 U/mL（表2）。綜合圈菌比和CMC活性可知，S-4為目的菌株。

2.2 菌株S-4的鑒定

2.2.1 形態(tài)學特征及生理生化鑒定 形態(tài)觀察表明，菌株 S-4 菌落形態(tài)為圓形，邊緣不整齊，表面褶皺，干燥不透明，白色；液體培養(yǎng)形成菌膜，分層明顯；經(jīng)過染色后，油鏡下觀察到菌體形態(tài)為桿狀，單個排列，革蘭氏染色陽性，有芽孢。表3為菌株S-4的生理生化鑒定結(jié)果。

2.2.2 菌株的分子鑒定 提取菌株S-4的基因，進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳。S-4菌株16S rRNA序列的擴增產(chǎn)物約為1 500 bp。序列信息在NCBI進行Blast比對，S-4菌株16S rRNA序列與枯草芽孢桿菌的16S rRNA序列同源性為97%。從系統(tǒng)進化發(fā)育樹分析可知，菌株S-4與枯草芽孢桿菌的16S rRNA序列相似度最高（圖1）。結(jié)合序列對比分析，初步判斷菌株S-4為枯草芽孢桿菌。

2.3 響應面法優(yōu)化菌株S-4發(fā)酵條件

2.3.1 PB試驗 以枯草芽孢桿菌S-4為試驗菌株，以菌懸液D546 nm為響應值，于37 ℃、160 r/min搖床發(fā)酵，分析影響發(fā)酵的7個因素：A，葡萄糖；B，酵母粉；C，KH2PO4；D，K2HPO4；E，MgSO4；F，蛋白胨；G，牛肉膏。由表4可見，該模型相關性極顯著（P值=0.000 1<0.01），在90%的置信區(qū)間內(nèi)，對于活菌量影響顯著的3個因素依次為A：葡萄糖，F(xiàn)：蛋白胨，C：KH2PO4，以此作進一步的響應面分析。

2.3.2 最陡爬坡試驗 根據(jù)一階方程，確定其變化的步長以及方向，試驗組合設計及結(jié)果見表5，可見第2組的Y值（D546 nm），即發(fā)酵后菌液中菌種生物含量最高。因此， 將葡萄糖含量12 g/L、蛋白胨含量6 g/L、KH2PO4含量0.4 g/L作為后續(xù)響應面Box-Behnken試驗的中心點。

2.3.3 響應面Box-Behnken試驗 在本研究的條件和方法的基礎上，將A（葡萄糖12 g/L）、B（蛋白胨6 g/L）、C（KH2PO4 0.4 g/L）作為Box-Behnken試驗的中心點，采用Design Expert 8.0軟件對Box-Behnken試驗結(jié)果進行方差分析和二次多項擬合。由表6可知，模型的P值=0.000 4，此模型高度顯著，可信度高。A、C、AB、BC、A2、B2、C2對響應值都有顯著影響，表明3個因素對響應值不是簡單的線性關系。另外模型的R2=0.966 2，校正R2=0.913 7，說明該模型可以很好地模擬和驗證試驗的結(jié)果。變異系數(shù)為1.77%，置信度比較高，說明模型可以反映真實的試驗值。

2.3.4 響應面分析 采用響應面法分析研究培養(yǎng)基成分，將PB試驗、最陡爬坡試驗、Box-Behnken試驗結(jié)合。結(jié)果顯示，當3個顯著因子分別為葡萄糖含量為13.08 g/L、蛋白胨含量為6.52 g/L、KH2PO4含量為0.37 g/L時，優(yōu)化后活菌量比初始培養(yǎng)提高了34.49%。由圖2、圖3、圖4可知，AB、BC之間具有十分明顯的交互作用，AC之間的交互作用較小。為了驗證結(jié)果的可靠性，保證發(fā)酵條件一致，分別于基礎培養(yǎng)基、優(yōu)化后的培養(yǎng)基中對菌株S-4進行試驗，每組3個平行，并取平均值，得到優(yōu)化后的D546 nm為3.478±0.034，與響應面分析預測結(jié)果擬合良好，基礎培養(yǎng)基D546 nm為2.586±0.026，優(yōu)化后的D546 nm比初始培養(yǎng)的提高了34.49%。

3 討論與結(jié)論

通過對菌糠樣品富集培養(yǎng)，利用纖維素篩選平板初篩、搖瓶發(fā)酵復篩，得到1株高產(chǎn)纖維素酶的菌株S-4。經(jīng)過生理生化鑒定，并結(jié)合16S rRNA序列對比分析，鑒定為枯草芽孢桿菌，CMC活性為67.5 U/mL。采用響應面法分析培養(yǎng)基成分得出，當3個顯著因子分別為葡萄糖含量 13.08 g/L、蛋白胨含量6.52 g/L、KH2PO4含量0.37 g/L時，優(yōu)化后活菌量比初始培養(yǎng)提高了34.49%?？莶菅挎邨U菌為飼用益生菌，且高產(chǎn)纖維素酶，用它來發(fā)酵菌糠，不僅可以降低粗纖維的含量，還能提高蛋白含量?？莶菅挎邨U菌也可以提高動物腸道內(nèi)的消化利用率[18-19]。響應面法優(yōu)化增殖培養(yǎng)條件，試驗次數(shù)少，周期較短，且對影響試驗的各個因素進行分析總結(jié)，分析顯著影響因子之間的交互作用，是一種高效優(yōu)化發(fā)酵條件的途徑[20-22]。

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