克百威人工抗原合成及其免疫應(yīng)用

孫鳳霞，康立超，龐芳琴，刑麗杰，羅瑞峰，羅小玲，彭夏雨

(省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點實驗室 / 新疆農(nóng)墾科學院 分析測試中心，新疆 石河子 832000)

克百威(Carbofuran, CBF)，化學名為2,3-二氫-2,2-二甲基-7-苯并呋喃基-N-甲基氨基甲酸酯，商品名為呋喃丹，是一種廣譜高效的氨基甲酸酯類農(nóng)藥，主要用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中多種農(nóng)作物害蟲的防治?？税偻梢院湍憠A酯酶發(fā)生不可逆結(jié)合，造成乙酰膽堿不能分解而蓄積在體內(nèi)，影響神經(jīng)中樞傳導，具有神經(jīng)毒性和胃毒?？税偻谒嵝酝寥乐胁灰捉到?，殘留期長，可被植物根部吸收并輸送到植物體的各器官，主要積蓄在植物葉部；也可能通過徑流滲透污染地下水源，給食品安全和環(huán)境帶來潛在威脅[1-3]。目前，農(nóng)業(yè)部已禁止將克百威用于蔬菜、果樹、茶葉和中草藥材的生產(chǎn)種植，但仍有不少違法使用現(xiàn)象時有發(fā)生,導致克百威殘留在果蔬等產(chǎn)品中。因此，在持續(xù)加大使用監(jiān)管力度和完善監(jiān)管體系的同時，加強克百威殘留檢測技術(shù)研究十分必要。

目前克百威的檢測多采用儀器分析法[4-6]，需要昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員，對檢材要求較高，樣品前處理和提純過程費時費力，不能滿足現(xiàn)代檢測對方便、快速、準確的要求。電化學傳感器法具有靈敏度高、選擇性好和檢測時間短的特點，在克百威殘留檢測上也得到一定的應(yīng)用[7-8]，但該方法檢測樣本數(shù)量單一，難以實現(xiàn)高通量檢測，不能滿足現(xiàn)場檢測和大批量樣品篩選需求。免疫分析法操作簡便，對樣本要求不高，可實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測，是21世紀最有競爭力的分析方法，已被應(yīng)用于克百威殘留檢測[9-15]。

農(nóng)藥免疫分析的關(guān)鍵是制備高特異性的抗體，包括半抗原設(shè)計、人工抗原合成及抗體制備，而半抗原的設(shè)計與合成是農(nóng)藥免疫分析的前提、基礎(chǔ)和關(guān)鍵。做為典型的小分子化合物，克百威本身不具有免疫原性，同時其結(jié)構(gòu)中不含有可直接偶聯(lián)的功能基團，需要進行半抗原衍生化或者人工合成。Abad等[9]設(shè)計合成4種克百威半抗原(表1)，根據(jù)抗體制備和免疫分析結(jié)果，確定免疫效果最好的克百威半抗原為4-[〔(2，3-二氫-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氧)羰基〕氨基]丁酸(BFNB)。因而在此后的克百威免疫分析中，多選用BFNB作為免疫半抗原，但其合成方法普遍采用傳統(tǒng)的三光氣合成工藝，需要使用大量光氣和甲苯，極易危害健康，造成環(huán)境污染。因此，本研究以克百威水解產(chǎn)物呋喃酚為起始原料，設(shè)計新型合成方法制備半抗原BFNB并對其結(jié)構(gòu)進行鑒定，利用活性酯法制備人工抗原，免疫小鼠獲得特異性識別克百威的多克隆抗體，為建立克百威免疫檢測方法和保障農(nóng)產(chǎn)品安全提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

表1 克百威4種半抗原的結(jié)構(gòu)Table 1 The chemical structures of four haptens

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

1.1.1 試驗動物 4只SPF級BALB/c小鼠(雌性，6～8周齡)購自新疆疾病預防控制中心。

1.1.2 主要試劑 克百威標準品購自農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(天津)；呋喃酚(純度99%)、二(對硝基苯)碳酸酯(純度≥99%)、4-氨基丁酸甲酯(純度≥99%)、三氟醋酸(純度≥99.8%)、三乙胺(純度≥99%)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS，純度98%)、N,N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC，純度≥99%)、牛血清白蛋白(BSA，純度≥98%)、弗氏完全佐劑和不完全佐劑等均購自Sigma公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗(HRP-IgG)為Jackson公司產(chǎn)品；Bradford蛋白濃度測定試劑盒(去垢劑兼容型)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；二氧六環(huán)、乙酸乙酯、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，均購自國藥集團上?；瘜W試劑總公司；試驗用水為Millipore超純水；上述試劑若無特別注明均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 克百威半抗原BFNB的合成及純化 取一四口燒瓶置于恒溫磁力攪拌器(上海滬西分析儀器廠)上，配置溫度計。稱取1.64 g呋喃酚溶解于50 mL 二氯甲烷(DCM)中，冰浴下加入1.11 g三乙胺(Et3N)。攪拌10 min后，將3.04 g二(對硝基苯)碳酸酯溶于15 mL二氯甲烷中，緩慢滴加到上述反應(yīng)體系中，緩慢升溫至室溫，繼續(xù)攪拌反應(yīng)1 h，TLC板監(jiān)控反應(yīng)完成，展開劑為V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=10∶1，此為溶液A；稱取1.697 g經(jīng)三乙胺堿化的4-氨基丁酸甲酯鹽酸鹽溶于10 mL二氯甲烷中，在冰浴下滴加到A液中，將溫度升到室溫并繼續(xù)攪拌過夜；用水、飽和食鹽水依次洗滌并用無水硫酸鈉干燥，濾液真空旋干后用硅膠柱層析純化，得到半抗原中間體B，收率為58%；將B溶于15 mL 1,4-二氧六環(huán)溶液中，加入18 mL三氟醋酸和15 mL水，60 ℃反應(yīng)4 h后冷卻至室溫；反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取后，依次用水、飽和碳酸氫鈉、水、飽和食鹽水進行洗滌，用無水硫酸鈉干燥，濾液真空旋干后用硅膠柱層析純化后即可得到克百威半抗原BFNB，洗脫劑為V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=5∶1，收率為42%，合成路線見圖1。

圖1 克百威半抗原BFNB合成路線Fig.1 Synthetic route of hapten BFNB

1.2.2 克百威半抗原BFNB的鑒定 將純化后的克百威半抗原BFNB采用核磁共振儀和LC-MS2進行分子結(jié)構(gòu)鑒定，以確定半抗原是否合成成功。

1.2.3 克百威人工抗原的合成 免疫原(BFNB-BSA)采用活性酯法進行合成，控制半抗原BFNB與載體蛋白BSA的反應(yīng)摩爾比為80∶1，稱取29.3 mg半抗原BFNB、13.8 mg NHS溶于1 mL無水DMF中，待其充分溶解完全后加入24.3 mg DCC，室溫攪拌反應(yīng)過夜；離心去沉淀，收集上清，此為A液；稱取BSA 83 mg溶解在5 mL 0.01 mol/L PBS溶液中，為B液；在冰水浴中，將A液逐滴滴加到B液中，4 ℃攪拌過夜。反應(yīng)混合液用PBS緩沖液透析3 d，6～8 h換液1次，離心取上清，分裝于0.5 mL離心管中， 20°C保藏，標記為BFNB-BSA，合成路線見圖2。

包被原(BFNB-OVA)在合成中將載體蛋白更改為卵清蛋白(OVA)，控制半抗原BFNB與OVA的反應(yīng)摩爾比為40∶1，其余步驟與免疫原的合成相同。

圖2 克百威人工抗原的合成路線Fig.2 Synthetic route of CBF complete antigen

1.2.4 克百威人工抗原的鑒定 采用紫外掃描光譜法對克百威人工抗原進行鑒定，并計算半抗原BFNB和載體蛋白的偶聯(lián)比，半抗原、人工抗原和載體蛋白用PBS緩沖液稀釋后，分別在波長200～400 nm進行全波長掃描，根據(jù)紫外掃描光譜的疊加情況判斷半抗原和載體蛋白是否偶聯(lián)成功，并根據(jù)半抗原特征吸收波長處的吸光度計算半抗原BFNB和載體蛋白的偶聯(lián)比[16]，公式為：

偶聯(lián)比=(ε偶聯(lián)物-ε蛋白)/ε半抗原

式中：ε為在半抗原特征吸收波長 278 nm處的摩爾吸光系數(shù)。

1.2.5 抗克百威多克隆抗體的制備 將制備的BFNB-BSA做為免疫原免疫BALB/c小鼠，免疫程序和方法參照文獻[17]。首次免疫采用弗氏完全佐劑乳化抗原，背部皮下多點免疫，免疫劑量為每只100 μg。加強免疫采用弗氏不完全佐劑乳化抗原，免疫劑量為每只75 μg。第4次免疫7 d后斷尾采血，分離血清測定效價。將BFNB-OVA作為包被抗原，利用方陣法確定最佳的抗原抗體工作濃度，用間接競爭酶聯(lián)免疫法(ELISA)對血清進行靈敏度測定[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 半抗原BFNB的結(jié)構(gòu)分析與鑒定

呋喃酚分子質(zhì)量為164，4-氨基丁酸甲酯分子質(zhì)量為169，衍生產(chǎn)物BFNB分子質(zhì)量為293。由圖3可知，在多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)下半抗原BFNB的保留時間為0.92 min，母離子為294.3，其為M+1；對母離子進行能量碰撞，產(chǎn)生165.1的碎片離子，分析165.1是半抗原BFNB的氨基甲酸酯鍵發(fā)生斷裂，產(chǎn)生的呋喃酚碎片；當碰撞能量繼續(xù)提高，呋喃環(huán)上的C-O鍵和C-C鍵發(fā)生斷裂，產(chǎn)生了123.1的碎片離子，據(jù)此可以推斷半抗原BFNB合成成功。

圖3 克百威半抗原BFNB的質(zhì)譜圖Fig.3 The MS spectrum of hapten BFNB

圖4 克百威半抗原BFNB的H譜Fig.4 1H NMR of CBF haptens BFNB

半抗原BFNB經(jīng)1H NMR (500 MHz, CDCl3)測定，鑒定其分子結(jié)構(gòu)(圖4)，其1H NMR為：δ為6.97 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 6.93 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.78 (t, J = 7.0 Hz, 8.0 Hz, 1H), 5.24 (br, 1H), 3.34 (m, 2H), 3.03 (s, 2H), 2.46 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 1.91 (m, 2H), 1.49 (s, 6H)，所得結(jié)構(gòu)信息與化合物BFNB的結(jié)構(gòu)信息相同，從而確定該化合物為目標半抗原BFNB。

2.2 克百威人工抗原的紫外掃描鑒定

紫外光譜結(jié)果如圖5所示，半抗原BFNB和載體蛋白BSA的最大特征吸收均在278 nm，在同樣濃度下，BFNB-BSA偶聯(lián)物相比BSA的最大特征吸收峰的強度發(fā)生了明顯增強，呈現(xiàn)一定的光譜疊加趨勢。另外，BFNB在245 nm處為特征峰間谷點，BSA在252 nm處為特征峰間谷點，而偶聯(lián)物BFNB-BSA的特征峰間谷點在250 nm處，介于BFNB和BSA的峰間谷點之間，發(fā)生了偏移，說明偶聯(lián)物中形成了新的化合物結(jié)構(gòu)，證明人工抗原BFNB-BSA偶聯(lián)成功。根據(jù)計算得到人工抗原BFNB-BSA的偶聯(lián)比約為17∶1，同法計算包被原BFNB-OVA的偶聯(lián)比約為8∶1。

圖5 人工抗原BFNB-BSA的紫外掃描圖Fig.5 Ultraviolet spectrum of the antigen BFNB-BSA

2.3 多克隆抗體的鑒定結(jié)果

2.3.1 多克隆抗體效價測定 采用間接ELISA法對4免抗血清進行效價測定，當包被原BFNB-OVA包被質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL時，4種抗血清效價均達到1∶9 000以上，其中2號小鼠血清效價達到1∶27 000，說明制備的免疫原具有良好的免疫原性，所制備的包被原也可以很好的用于免疫檢測。

2.3.2 多克隆抗體靈敏度測定 經(jīng)方陣法確定包被原最佳包被質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL，抗血清最佳工作稀釋倍數(shù)為8 000倍。采用間接競爭ELISA法對抗血清進行靈敏度測定，以克百威質(zhì)量濃度的對數(shù)值為橫坐標，OD450的吸光值為縱坐標，通過四參數(shù)回歸方程擬合曲線，得到競爭抑制曲線(圖6)，定量檢測線性(IC20～IC80)為0.023～0.403 μg/mL，半數(shù)抑制濃度(IC50)為0.096 μg/mL。

圖6 抗體的間接競爭ELISA抑制曲線Fig.6 Standard inhibition curve of polyclonal antiserum detected by icELISA

3 討 論

免疫分析法是以抗體對抗原的特異性識別作用為基礎(chǔ)的分析方法，免疫檢測已被應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品中多種農(nóng)藥殘留檢測[19]。抗體是所有免疫檢測方法的關(guān)鍵試劑，對于小分子農(nóng)藥而言，其半抗原設(shè)計、篩選和合成是制備抗體的關(guān)鍵環(huán)節(jié)?？税偻陌肟乖饕鶕?jù)Abad等[9]篩選的4種半抗原，其中免疫效果最好的抗體來源于半抗原BFNP和BFNB，半抗原合成方法普遍采用傳統(tǒng)的三光氣法，如楊金易等[20]采用光氣合成法合成BFNB作為半抗原，成功制備了高親和力的抗克百威單克隆抗體，并建立相應(yīng)的免疫分析方法。朱國念等[21]和Zhu等[22]利用光氣法合成半抗原BFNB、BFNH和BFNP。 由于三光氣合成法中需要使用大量有機溶劑甲苯和光氣，危害操作人員身體健康，造成二次環(huán)境污染，研究者們開始尋找克百威半抗原新的合成方法，如朱德銳[23]以克百威、對硝基苯氯甲酸酯、6-氨基己酸為反應(yīng)原料，開辟克百威半抗原BFNH新的合成方法，避免傳統(tǒng)三光氣合成法的危害。本研究以克百威水解產(chǎn)物呋喃酚為起始原料，首先與二(對硝基苯)碳酸酯和4-氨基丁酸甲酯鹽酸鹽反應(yīng)生成中間體，再和三氟醋酸反應(yīng)合成半抗原BFNB，經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振測定半抗原BFNB合成成功，同時合成步驟簡潔有效，得率高，避免傳統(tǒng)三光氣合成方法中大量使用光氣和甲苯的危害性，為克百威半抗原提供了新的合成方法。

人工抗原的結(jié)構(gòu)決定抗體對目標抗原的親和力、選擇性和靈敏度，直接影響免疫分析方法的結(jié)果。人工抗原的鑒定主要采用紫外光譜法和蛋白電泳法[24]，其中紫外光譜法可以同時計算偶聯(lián)比，且操作簡單快捷，被廣泛使用。人工抗原的偶聯(lián)比即半抗原與載體蛋白的最佳分子結(jié)合比對抗體的產(chǎn)生和質(zhì)量有著重要影響。關(guān)于最佳偶聯(lián)比，不同研究者的結(jié)果有所不同。通常認為半抗原分子與載體蛋白的偶聯(lián)比在5∶1～25∶1最佳[25]。對于克百威半抗原BFNB，楊金易等[20]和朱國念等[21]分別通過活性酯法制備完全抗原BFNB-BSA，其偶聯(lián)比均為13∶1；本研究制備的克百威免疫原的偶聯(lián)比約為17∶1，處于適宜范圍內(nèi)。

同時，動物免疫試驗結(jié)果進一步證明克百威人工抗原合成成功，所獲得的鼠源抗克百威多克隆抗體的IC50值為0.096 μg/mL，線性(IC20～IC80)為0.023～0.403 μg/mL。研究所制備的克百威半抗原為進一步制備抗克百威高特異性單克隆抗體和建立克百威免疫分析方法奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

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