擬除蟲菊酯類農(nóng)藥半抗原合成及酶聯(lián)免疫分析

胡久平，李相前，任世英，周禮紅

摘要：酶聯(lián)免疫分析（ELISA）是農(nóng)藥殘留檢測的一種重要方法，具有方便快速、特異靈敏等優(yōu)點。主要介紹了擬除蟲菊酯類農(nóng)藥半抗原的合成方法，對擬除蟲菊酯分子的環(huán)丙烷、氰基和芳香環(huán)進行修飾；對擬除蟲菊酯水解產(chǎn)物進行修飾；增加一個連接臂作為半抗原。同時介紹了酶聯(lián)免疫分析的研究進展，對擬除蟲菊酯類農(nóng)藥半抗原的合成及酶聯(lián)免疫分析進行了討論和展望。酶聯(lián)免疫分析在擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的殘留檢測中將起到越來越重要的作用。

關(guān)鍵詞：擬除蟲菊酯；半抗原；酶聯(lián)免疫分析（ELISA）

中圖分類號：S482.3；Q503 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）05-0993-04

Hapten Synthesis and ELISA Analysis of Pyrethroid Pesticides

HU Jiu-ping1，2，LI Xiang-qian1，3，REN Shi-ying1，3，ZHOU Li-hong2

（1.Huaiyin Institute of Technology， Huaian 223003，Jiangsu，China；2.College of Life Science， Guizhou University，Guiyang 550025，China；

3. Huaian High-Tech Research Institute， Nanjing University，Huaian 223003， Jiangsu， China）

Abstract： A enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） is an important method to detect the residue of pesticides with the characteristics of convenience and high efficiency. The main synthesis methods of hapten include modifying the cyclopropane， cyanogroup and aromatic nucleus of the pyrethroid insecticides， modifying the hydrolysate of the pyrethroid insecticides or adding a linker arm. Research progress in ELISA analysis was reviewed， and the methods of hapten synthesis and the application of ELISA were discussed. ELISA will be a promising method and play more and more important role in detecting the residue of pyrethroid insecticides.

Key words： pyrethroid； hapten； enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）

擬除蟲菊酯類農(nóng)藥是一類重要的合成型殺蟲劑[1]，它具有高效、低毒、低殘留等特點，如今被廣泛用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)、公共衛(wèi)生等方面。但隨著擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的大量使用，其殘留對環(huán)境和人類健康造成的危害，特別是在農(nóng)產(chǎn)品和食品中的殘留問題不斷引起全社會的關(guān)注[2]。如今對于擬除蟲菊酯殘留的分析檢測多以高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜-電子捕獲法（GC-ECD）以及氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）等儀器分析的方法為主。雖然這些方法檢測靈敏度高，但樣品的前處理步驟多且檢測費用高，不適用于現(xiàn)場快速檢測。這些問題促使人們不得不尋找一種新的快速檢測方法。20世紀80年代以來，免疫學技術(shù)在農(nóng)藥殘留檢測中的應用不斷深入，其中酶聯(lián)免疫分析（ELISA）技術(shù)是檢測農(nóng)藥殘留較好的方法，它提供了一種對痕量殘留快速、靈敏、選擇性的檢測方法。酶聯(lián)免疫的關(guān)鍵技術(shù)是半抗原的設計、合成和抗體制備[3]。

1 半抗原的合成

擬除蟲菊酯類農(nóng)藥多是相對分子質(zhì)量小于1 000的化合物，其本身不具有誘導產(chǎn)生抗體的能力。且擬除蟲菊酯分子也往往不能直接與雙功能交聯(lián)劑或蛋白質(zhì)共價偶聯(lián)，因此需要先通過化學反應在擬除蟲菊酯分子上引入活性基團由此合成半抗原再與蛋白質(zhì)偶聯(lián)得到抗體[4]。目前半抗原的設計及合成主要有以下幾種途徑。

1.1 對擬除蟲菊酯上活性位點的修飾

1.1.1 對擬除蟲菊酯環(huán)丙烷的修飾 Lee等[5]和程敬麗等[6]將環(huán)丙烷上的雙鍵轉(zhuǎn)變?yōu)楹然孽０分频冒肟乖▓D1）；祝金鳳[7]將環(huán)丙烷所連接的雙鍵通過高錳酸鉀氧化為羧基獲得半抗原；Mark等[8]用臭氧將連接在環(huán)丙烷上的雙鍵氧化為羧基和醛基；程敬麗等[9]用三氯化釕和高碘酸鈉也將環(huán)丙烷上連接的雙鍵氧化為羧基得到半抗原，且收率較高。

1.1.2 對活性基團氰基的轉(zhuǎn)化 王鳴華等[10]將溴氰菊酯中的氰基轉(zhuǎn)化為羧基和含羧基的酰胺達到制備半抗原的目的；張獻忠[11]用合成的方式制備溴氰菊酯并將其氰基轉(zhuǎn)化為羧基獲得半抗原；Lee等[5]將氰基轉(zhuǎn)化為羧基再與γ-氨基丁酸反應得到含羧基的酰胺半抗原（圖2）。

1.1.3 在擬除蟲菊酯芳香環(huán)上的修飾 擬除蟲菊酯的芳香環(huán)上也存在著進行修飾的理想位點。早在1998年Queffelec等[12]就在溴氰菊酯的芳香環(huán)上引入羰基酸來制備半抗原，其具有良好特異性，且與其他擬除蟲菊酯類沒有交叉反應。Lee等[13]用SnCl2將芳香環(huán)上的硝基還原為氨基，其衍生物作為半抗原所得抗體對溴氰菊酯檢測效果較好。羅世能等[14]在氯氟菊酯的芳香環(huán)上通過硝化、還原得到具有氨基活性基團的半抗原?？讜系萚15]將芳香環(huán)末端含硝基的溴氰菊酯的硝基還原后與丁二酸酐反應，得到芳香化末端含有羧基的酰胺半抗原（圖3）。

1.2 對擬除蟲菊酯菊酸部分的改造

擬除蟲菊酯作為一個酯類化合物，研究表明對其菊酸部分進行改造也可以得到半抗原。李培武等[16，17]直接通過酯交換反應將菊酸替換，并對酯交換后得到的產(chǎn)物進行修飾制得半抗原。此類半抗原制備出的抗體對擬除蟲菊酯類農(nóng)藥具有較高識別特異性且其制備的擬除蟲菊酯類多克隆抗體效價非常高（圖4）；李瑩瑩等[18]用γ-氨基丁酸與酰氯化的PBA進行反應從而達到替換菊酸的目的，制得PBA-GABA半抗原并成功合成了擬除蟲菊酯的人工抗原（圖4）。王俊平等[19]用γ-氨基丁酸與PBA進行反應得到與李瑩瑩等[18]所制得的相同的半抗原，但其使用的方法和試劑相對更簡單。郝曉蕾[20]用酸酐取代菊酸部分得到含羧基的半抗原。

1.3 以擬除蟲菊酯水解后的酸和醇的衍生物為半抗原

擬除蟲菊酯水解后得到酸和醇，其衍生物也可以作為半抗原。早在1998年Anne-Laurence等[21]就對菊酸進行修飾得到了含γ-氨基丁酸的衍生物作為擬除蟲菊酯類農(nóng)藥半抗原（圖5）。還有水解得到醇的衍生物，如1997年Anatoliy等[22]對水解得到的醇進行氧化得到酸作為半抗原。雖然制備這類半抗原較為簡單，但其制備的抗體特異性較差，多用于檢測農(nóng)藥在哺乳動物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物。

2 酶聯(lián)免疫分析技術(shù)研究進展

酶聯(lián)免疫分析技術(shù)用于擬除蟲菊酯類農(nóng)藥免疫分析已研究了多年且取得了一定的成果（表1）[4]。

根據(jù)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殺蟲機理不同，此類農(nóng)藥被劃分為兩類，即Ⅰ型和Ⅱ型擬除蟲菊酯類農(nóng)藥。Ⅰ型擬除蟲菊酯類農(nóng)藥不含氰基，相對應含有氰基的則為Ⅱ型，其結(jié)構(gòu)式如圖6。

2.1 Ⅰ型擬除蟲菊酯的ELISA研究

2001年Takaho 等[23]利用氯菊酯衍生物和間苯氧基甲酸反應產(chǎn)物與甲狀腺球蛋白結(jié)合形成免疫原免疫兔子。經(jīng)條件優(yōu)化后，氯菊酯的IC50為30.0 μg/L，對苯醚菊酯的IC50為20.0 μg/L。

Ahn等[24]用ELISA檢測氯菊酯在人體內(nèi)的殘留，以其代謝產(chǎn)物DCCA-glycine為檢測目標，結(jié)果反式DCCA-glycine的IC50為1.3～2.2 μg/L，順式DCCA-glycine的IC50為0.4～2.8 μg/L。

2.2 Ⅱ型擬除蟲菊酯的ELISA研究

Sally等[25]利用菊酸和間苯氧基芐醇反應制備半抗原后與甲狀腺球蛋白結(jié)合免疫原免疫動物制得多克隆抗體，并且進行條件優(yōu)化，經(jīng)優(yōu)化的ELISA方法對各種擬除蟲類農(nóng)藥的IC50氯氰菊酯為78 ng/mL，對百樹菊酯為205 ng/mL，對氨氟氰菊酯為120 ng/mL，對溴氰菊酯為13 ng/mL，對埃死菊酯為6 ng/mL，對氰戊菊酯為8 ng/mL，對氟胺氰菊酯為123 ng/mL。

Gao等[26]通過ELISA檢測功夫菊酯，其IC50為37.2 μg/L，最低檢測限為4.7 μg/L，與溴氰菊酯等的交叉反應弱。

3 討論與展望

半抗原的立體化學決定免疫分析的特異性[27]，因此在半抗原合成中需要保留原化合物的分子立體結(jié)構(gòu)。在合成半抗原的時候一定長度和結(jié)構(gòu)的連接臂可以增大半抗原的相對分子質(zhì)量和空間構(gòu)型，有利于刺激機體產(chǎn)生抗體。但并不是連接臂越長越大越好。Freia[28]認為連接臂以C3-6為宜，但也有研究者持不同的觀點。

在酶聯(lián)免疫分析中抗體結(jié)構(gòu)和抗原結(jié)構(gòu)相似的化學物質(zhì)可被用來制備某一類有分子結(jié)構(gòu)共性的通用抗體。國內(nèi)外對擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的通用性抗體研究不多，國內(nèi)僅南京農(nóng)業(yè)大學的駱愛蘭等[29]和江蘇農(nóng)業(yè)科學院的李志茹[30]以間苯氧基甲酸為半抗原制備了擬除蟲菊酯的通用抗體，但如何進行實際檢測應用還有待進一步研究。

擬除蟲菊酯類半抗原合成一直是酶聯(lián)免疫檢測的一個關(guān)鍵步驟，20世紀90年代以來小分子化合物免疫化學的理論和技術(shù)飛速發(fā)展，為人們從不同途徑設計合成半抗原提供了支持；在化學合成方面發(fā)現(xiàn)各種新型催化劑使合成中的目標產(chǎn)物產(chǎn)率不斷提高而副產(chǎn)物不斷減少；分離純化方面的技術(shù)也不斷提高；新的能有效得到半抗原的方法也將不斷出現(xiàn)，合成通用性半抗原也是可能的。酶聯(lián)免疫分析技術(shù)在農(nóng)藥檢測上的應用在國內(nèi)起步比較晚，但因其方便、快速、靈敏等優(yōu)勢倍受人們的重視。酶聯(lián)免疫分析技術(shù)在農(nóng)藥殘留和食品安全等諸多方面都具有廣闊的應用前景。

參考文獻：

[1] 王鳴華.擬除蟲菊酯化學[M].北京：中國農(nóng)業(yè)科學技術(shù)出版社，2004.1-22.

[2] SCHIMMEL S C， GARNAS R L， PATRICK J M， et al. Acute toxicity， biocomcentration and persistence of AC222，705， benthiocarb， chlorpyrifos， fenvalerate， methyl parathion and permethrin in estuarine envionment[J]. J Agric Food Chem，1983（31）：104-113.

[3] 劉廷鳳，楊敏娜，劉亞子，等.菊酯類農(nóng)藥酶聯(lián)免疫吸附測定研究進展[J].環(huán)境科學與技術(shù)，2006，29（4）：100-102.

[4] 盧希勤，王鳴華.擬除蟲菊酯類農(nóng)藥半抗原合成及酶聯(lián)免疫分析研究進展[J].農(nóng)藥，2007，46（10）：653-655.

[5] LEE N J， MCADAM D P， SKERRITT J H. Development of immunoassays for type Ⅱ synthetic pyrethroids hapten design and application to heterologous and homologous assay[J]. J Agric Chem， 1998，46（2）：520-534.

[6] 程敬麗，趙金浩，王春梅，等.一種擬除蟲菊酯類半抗原化合物的合成方法[P].中國專利：CN 101215247，2008-07-09.

[7] 祝金鳳.Ⅱ型菊酯類農(nóng)藥廣譜特異性抗體的制備和多殘留免疫技術(shù)建立[D].江蘇揚州：揚州大學，2008.

[8] MARK S K， SHAN G M， LEE H J， et al. Development of a class selective immunoassay for the type Ⅱ pyrethroid insecticides[J]. Analytica Chemica Acta， 2005，534（1）：109-120.

[9] 程敬麗，徐旭輝，趙金浩，等.一種高特異性擬除蟲菊酯類半抗原化合物的制備方法[P].中國專利：CN 101412684， 2009-04-22.

[10] 王鳴華，施海燕，張幫紅.溴氰菊酯抗原、抗體及其應用[P].中國專利：CN 101412674，2009-04-22.

[11] 張獻忠.溴氰菊酯農(nóng)藥殘留免疫檢測技術(shù)研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學院，2008.

[12] QUEFFELEC A L， NODET P， JAELTERS J P， et al. Hapten sunthsis for a monoclonal antibody based elisa for deltamethrin[J]. Agric Food Chem，1998，46（4）：1670-1676.

[13] LEE H J， SHAN G M， WATANABE T， et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for the pyrethroid deltamethrin[J]. J Agric Food Chem， 2002，50（20）：5526-5532.

[14] 羅世能，桑光明，林建國，等.一種氯氟氰菊酯人工抗原及其合成方法[P].中國專利：CN 101519364，2009-09-02.

[15] 孔 曄，李培武，張 奇，等.一種新型溴氰菊酯農(nóng)藥半抗原的合成及應用效果[J].化學試劑，2009，31（4）：245-249.

[16] 李培武，張 奇，張 文，等.一種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥人工抗原、抗體及其制備方法[P].中國專利：CN 101434625，2009-05-20.

[17] 李培武，張 奇，張 文，等.Ⅱ型擬除蟲菊酯類通用半抗原化合物及其合成方法[P].中國專利：CN 101407474，2009-04-15.

[18] 李瑩瑩，苗 虹， 駱鵬杰，等.擬除蟲菊酯類農(nóng)藥人工抗原的合成與鑒定[J].中國食品衛(wèi)生雜志，2011，23（3）：200-204.

[19] 王俊平，余桂春，劉 冰，等.擬除蟲菊酯類農(nóng)藥通用人工抗原的合成與鑒定[J].現(xiàn)代食品科技，2011，27（5）：524-527.

[20] 郝曉蕾.含氰基擬除蟲菊酯類農(nóng)藥多殘留免疫檢測方法的研究[D].江蘇無錫：江南大學，2009.

[21] ANNE-LAURENCE Q， PATRICE N， JEAN-PIERRE H， et al. Hapten synthsis for a monoclonal antibody based ELISA for deltamethrin[J]. J Agric and Food Chemistry，1998，46（4）：1670-1676.

[22] ANATOLIY V Z， BORIS B D， JANNA N T. Homogeneous enzyme immuoassay for pyrethroid pesticides and their dericatives using bacillary alpha-amylase as label[J]. Analytica Chimica Acta1，1997，347（1-2）：131-138.

[23] TAKAHO W，SHAN G， DDONALD W S， et al. Development of a class-special immunoassay for the type Ⅰ pyrethroid insecticides[J].Analytica Chimiaca Acta，2001，444（1）：119-129.

[24] AHN K C，WATANABE T，SHIRLEY J G，et al.Hapten and antibody production for a sensitive immunoassay dtermining a human urinary metbolite of the pyrethroid insecticide permethrin[J].J Agric Food Chem，2004，52（15）：4583-4594.

[25] SALLY K M，GUOMIN S，HU-JANG L，et al.Development of a class selective immunoassay for the type Ⅱ pyrethriod insecticides[J].Analytica Chimica Acta，2005，534（1）：109-120.

[26] GAO H， LING Y， XU T， et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay for the pyrethroid insecticide cyhalothrin[J]. J Afric Food Chem，2006，54（15）：5284-5291.

[27] SKERRITT J H， LEE N. American Chemical Society[M]. Washington D C： Johns Hopkins University Press，1996.124-149.

[28] FREIA J. Detection of pesticides residues by enzyme immunoassay[J]. Pestic Sci，1989，26（3）：303-307.

[29] 駱愛蘭，余向陽，張存政，等.擬除蟲菊酯類農(nóng)藥多殘留酶免疫分析方法的建立[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2005，38（2）：308-312.

[30] 李志茹.擬除蟲菊酯類農(nóng)藥通用抗體制備及高效氟氯氰菊酯免疫檢測技術(shù)研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學，2004.