呋喃西林代謝物半抗原的制備及其免疫檢測(cè)中的應(yīng)用

李斌，俞思明，胡睿，于淑娟

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）（2.廣州潤(rùn)坤生物科技有限公司，廣東廣州 510800）（3.暨南大學(xué)生物材料廣東高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生物醫(yī)學(xué)工程系，廣東廣州 510632）

呋喃西林屬于硝基呋喃類藥物，近年來(lái)頻繁用于水產(chǎn)類養(yǎng)殖和禽類養(yǎng)殖[12]。硝基呋喃類藥物進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后，快速代謝為氨基脲（Semicarbazide，SEM），具有致畸、致突變和致癌作用[3]。歐美和我國(guó)相繼公布了禁止使用硝基呋喃類藥物的法令，并明確了其代謝物的最高殘留量為0.25 μg/L[4]。

現(xiàn)階段有關(guān)呋喃西林代謝物殘留的檢測(cè)技術(shù)主要有：高效液相（HPLC）、液相質(zhì)譜（LC-Ms或LC-Ms/Ms）、高效氣相（GC）、氣相質(zhì)譜（GC-Ms）和免疫分析技術(shù)。前四種技術(shù)主要是通過 SEM 與鄰硝基苯甲醛過夜衍生后，用儀器測(cè)定其衍生物（2-NPSEM）[5～7]。色譜技術(shù)的樣本處理較繁瑣費(fèi)時(shí)，需昂貴的儀器設(shè)備，且需要專業(yè)分析人員操作，不適合大批量的樣本篩查，無(wú)法滿足現(xiàn)有市場(chǎng)的需求。酶聯(lián)免疫分析技術(shù)作為一種快速、高靈敏度、高特異性的檢測(cè)方法，正廣泛應(yīng)用于有毒、有害藥物的殘留檢測(cè)。

免疫分析技術(shù)的關(guān)鍵是生物原材料（抗原、抗體）的制備，其性能決定了快檢產(chǎn)品的質(zhì)量。由于呋喃西林代謝物（SEM）分子量較小，只具有反應(yīng)原性，免疫時(shí)必須與大分子載體偶聯(lián)，制備成人工合成抗原后才能獲得免疫原性，從而刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體[8]。Cooper等[9]用羧基苯甲醛制備了SEM衍生物的多克隆抗體，并建立了檢測(cè)SEM殘留的ELISA法，在雞肉中的檢測(cè)限為0.25 μg/L。李軍平[10]用3-羧基苯甲醛與 SEM 衍生制備了半抗原，通過偶聯(lián)蛋白后免疫小鼠制備了單克隆抗體，其IC50值為31.25 μg/L。任海濤[11]等將4-（4-醛基苯氧基）-丁酸和4-（4-醛基苯氧基）-乙酸與SEM衍生合成半抗原，通過偶聯(lián)蛋白后免疫小鼠制備了單克隆抗體，其 IC50值為12.37 μg/L。Huang Deng Yu等[12]用4-羧基苯甲醛與SEM衍生制備了半抗原，通過偶聯(lián)蛋白后免疫小鼠制備了單克隆抗體，其IC50值為0.54 μg/L?，F(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道合成的SEM半抗原結(jié)構(gòu)都為傳統(tǒng)的4-CP或3-CP衍生物結(jié)構(gòu)，共同點(diǎn)是沒有保留待測(cè)目標(biāo)物硝基端的優(yōu)勢(shì)基團(tuán)，導(dǎo)致制備獲得的抗體存在特異性差、親和力低。

本文重點(diǎn)解決現(xiàn)有 SEM 半抗原結(jié)構(gòu)不含硝基端優(yōu)勢(shì)基團(tuán)的不足，提供一種新的呋喃西林代謝物SEM衍生化半抗原及人工抗原的制備方法，獲得具有高靈敏度和特異性的單克隆抗體，用于 ciELISA法檢測(cè)2-NPSEM的研究。

1 材料與方法

1.1 材料與主要儀器

牛血清蛋白 BSA、卵清蛋白 OVA、弗氏完全與不完全佐劑，美國(guó)sigma公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體，上海杰一生物技術(shù)有限公司；2-NPSEM、氫氧化鋰、呋喃西林代謝物、吐溫-20，上海阿拉丁試劑公司；分析級(jí) Na2CO3、NaHCO3、KH2PO4、Na2HPO4·12H2O、KCl、濃硫酸和檸檬酸等，廣州化學(xué)試劑有限公司；HRP顯色用的 3,3,5,5-四甲基聯(lián)苯胺（TMB），上海安耐吉化學(xué)有限公司；實(shí)驗(yàn)用水均為Milipore超純水；SPF級(jí)Balb/c純種雌性小鼠，廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

酶聯(lián)免疫測(cè)定(ELISA)用溶液：磷酸鹽緩沖液（PBS，0.01 mol/L，pH 7.4）、碳酸鹽緩沖液（CB，0.05 mol/L，pH 9.6）、洗滌液（PBST，0.01 mol/L，pH 7.4，PBS-0.05 mol/L 吐溫20）、封閉液（1% BSA-PBS）、3,3,5,5-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）底物液（TMB-過氧化氫脲溶液）、終止液（10% H2SO4溶液）。

Multiskan MK3酶標(biāo)儀、Wellwashi MK2洗板機(jī)，美國(guó)Thermo公司；高速冷凍離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；恒溫加熱磁力攪拌器、磁力攪拌器、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鞏義予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2 半抗原合成

（1）將2.0 g（7.1 mmol）的化合物Ⅰ溶于10 mL乙醇中，通過6 mol/L的氫氧化鋰溶液將化合物Ⅰ的乙醇溶液調(diào)至pH值為10～12，室溫反應(yīng)15～26 h，加入40 mL純化水，所得溶液通過1 M的稀鹽酸調(diào)PH值至4～5，過濾，烘干得到1.1 g的化合物Ⅱ。1H NMR（600 MHz，CDCl3，TMS）：δ 10.50（s，1H），8.20（d，1H），7.35（d，1H），7.15～7.19（dd，1H），4.23（t，2H），2.66（t，2H），2.26（m，2H）。ESI-MS：167 [M-CH2CH2CH2COOH-1]，252 [M-1]，288[M+2H2O-1]，315 [2×167-H2O-1]，505 [2M-1]，537[2M+MeOH-1]。

（2）將0.5 g（即2.0 mmol）的化合物Ⅱ溶解于10 mL甲醇中，加入0.18 g（即2.4 mmol）的呋喃西林代謝物SEM，于60～70 ℃反應(yīng)2 h，反應(yīng)完畢，冷卻至室溫，過濾，得0.42 g的呋喃西林代謝物的半抗原。半抗原合成路線圖如圖1如示：

圖1 半抗原的合成路線圖（式Ⅲ為合成的半抗原）Fig.1 Synthetic route of SEM hapten (III was the synthesized hapten)

1.3 人工抗原合成

人工抗原采用活潑酯法制備，將式Ⅲ半抗原在碳二亞胺（EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）作用下與載體蛋白上的氨基偶聯(lián)，合成示意圖如圖2所示：

圖2 人工抗原合成示意圖Fig.2 Synthetic route of artificial antigen

本文所制備的人工抗原包括免疫原與包被原，兩者的不同之處在于制備過程中偶聯(lián)的載體蛋白種類不同，免疫原通過半抗原與牛血清蛋白（BSA）偶聯(lián)制備（式(Ⅲ)-BSA），包被原通過半抗原與卵清蛋白（OVA）偶聯(lián)制備（式(Ⅲ)-OVA）。具體合成步驟如下：

（1）取10.0 mg式Ⅲ半抗原，溶解于0.5 mL二甲基甲酰胺（DMF）中，攪拌充分后，加入 8.0 mg的碳二亞胺（EDC）和6.0 mg的N-羥基琥珀酰亞胺（NHS），室溫下攪拌4 h，即可得到半抗原活化酯；

（2）稱取70.9 mg BSA（或43.0 mg OVA）（式Ⅲ半抗原與BSA和OVA的摩爾比均控制在30：1），使其充分溶解在4 mL的濃度為0.01 mol/L的PBS溶液中，形成載體蛋白溶液，在攪拌下將半抗原活化酯逐滴緩慢滴加至載體蛋白溶液中，并在室溫下攪拌24 h；

（3）步驟（2）制得的溶液用0.01 mol/L的PBS溶液室溫透析3 d，每天換3次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)；

（4）分裝，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 單克隆抗體的制備

將制備的免疫原式(Ⅲ)-BSA，與等體積弗氏佐劑乳化后，免疫 BALB/C小鼠。每只小鼠免疫劑量為50～100 μg，免疫間隔3周，免疫3次后，采小鼠尾部靜脈血檢測(cè)血清效價(jià)。如抗血清效價(jià)不達(dá)100000，需加強(qiáng)免疫，待抗體效價(jià)不再升高后，以100 μg免疫原進(jìn)行皮下加強(qiáng)免疫，5 d后取小鼠的脾細(xì)胞與SP20細(xì)胞融合。融合后的細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中篩選，5 d后以完全培養(yǎng)基替換成 HAT培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。用ciELISA對(duì)細(xì)胞上清進(jìn)行檢測(cè)，將檢測(cè)結(jié)果為強(qiáng)陽(yáng)性的孔內(nèi)細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋法克隆培養(yǎng)，經(jīng)3次克隆培養(yǎng)檢測(cè)后，均呈陽(yáng)性的孔內(nèi)細(xì)胞即為分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。將雜交瘤細(xì)胞放大培養(yǎng)后，接種至小鼠腹腔，產(chǎn)生含抗體的腹水。用辛酸-硫酸銨沉淀法純化腹水，即可得到高純度、高特異性的單克隆抗體。

1.5 單克隆抗體的效價(jià)及特異性測(cè)定

用pH 9.6的碳酸鹽緩沖液作包被稀釋液，將合成的免疫原式(Ⅲ)-OVA按預(yù)試0.5 μg/mL的濃度包被酶標(biāo)板，將純化好的單克隆抗體按 1：20000、1：40000、1：160000、1：320000、1：640000、1：1280000、1：2560000倍稀釋，用ciELISA法測(cè)定單克隆抗體效價(jià)和特異性。選擇效價(jià)高且抑制率好的抗體濃度，根椐方陣滴定法以450波長(zhǎng)下的OD值在2.0左右的稀釋濃度作為抗2-NPSEM單克隆抗體的工作濃度，將呋喃西林代謝物SEM 的衍生物標(biāo)準(zhǔn)品配制成濃度為 0、0.05、0.15、0.45、1.35和 4.05 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，建立ciELISA法標(biāo)準(zhǔn)曲線[13]。通過測(cè)定20個(gè)0 μg/L標(biāo)準(zhǔn)液，計(jì)算OD值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，根據(jù)最低檢測(cè)限公式Z=平均值-3標(biāo)準(zhǔn)差，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上的Z值（即Y值）對(duì)應(yīng)的濃度即為標(biāo)準(zhǔn)品最低檢測(cè)限值[14]。

將 SEM 結(jié)構(gòu)類似物呋喃它酮、呋喃唑酮和呋喃妥因代謝物的衍生物，按上述方法獲得ciELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算其半抑制濃度 IC50值，并計(jì)算其與 SEM的交叉反應(yīng)率。

2 結(jié)果

2.1 半抗原的結(jié)構(gòu)鑒定

半抗原的核磁共振氫譜和質(zhì)譜表征結(jié)果分別如圖3（a）和圖3（b）所示。核磁共振氫譜結(jié)果為：1H NMR（600 MHz，DMSO，TMS）：δ 12.17（s，1H），10.61（s，1H），8.37（s，1H），8.03（d，1H），7.12（dd，1H），6.68（s，2H），4.21（s，2H），2.44（t，2H），2.03（m，2H）。質(zhì)譜結(jié)果為ESI-MS：311 [M+1]。以上結(jié)果表明，本文設(shè)計(jì)的半抗原被成功合成，且半抗原結(jié)構(gòu)中含有末端羧基，能夠用于人工完全抗原合成。

2.2 人工抗原的結(jié)構(gòu)鑒定

人工抗原利用紫外光譜法進(jìn)行分析鑒定[15]，紫外圖譜如圖4所示，其中半抗原、BSA和OVA的紫外圖譜作為對(duì)照。從圖4中可看出，BSA在280 nm處有特征吸收，式Ⅲ半抗原在265 nm處有強(qiáng)的特征吸收。式(Ⅲ)-BSA完全抗原在260 nm左右出現(xiàn)一個(gè)寬的吸收峰，相對(duì)于式Ⅲ半抗原吸收峰有所藍(lán)移，且未見BSA蛋白的特征吸收，這是因?yàn)槭舰蟀肟乖cBSA發(fā)生共價(jià)偶聯(lián)所致。同樣的，式(Ⅲ)-OVA在265 nm處出現(xiàn)寬的吸收峰，且相對(duì)于式Ⅲ半抗原和OVA，吸收峰有所藍(lán)移，說(shuō)明式Ⅲ半抗原與 OVA成功偶聯(lián)。綜上所述，免疫原式(Ⅲ)-BSA和包被原式(Ⅲ)-OVA被成功合成。

圖3 半抗原的核磁共振氫譜圖（a）和質(zhì)譜圖（b）Fig.3 1H NMR spectrum (a) and mass spectrum of hapten (b)

圖4 BSA、OVA、式Ⅲ半抗原以及免疫原式(Ⅲ)-BSA和包被原式(Ⅲ)-OVA的紫外圖譜Fig.4 UV-Vis spectra of BSA, OVA, Ⅲ-hapten, immunogen SEM-BSA (Ⅲ)and coating antigen SEM-OVA(Ⅲ)

2.3 單克隆抗體效價(jià)檢測(cè)

第三次免疫BALB/C小鼠后，結(jié)合細(xì)胞融合技術(shù)制備的單克隆抗體的效價(jià)如表1所示，結(jié)果表明包被原式(Ⅲ)-OVA對(duì)應(yīng)的抗體效價(jià)為1：2560000。

2.4 單克隆抗體的靈敏度和特異性的ciELISA法檢測(cè)結(jié)果

圖5 SEM衍生物ciELISA法標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Calibration curve of SEM derivates by ciELISA method

本文利用ciELISA法對(duì)制備的單克隆抗體的靈敏度和特異性進(jìn)行了測(cè)定分析。在ciELISA法中，對(duì)不同SEM衍生物濃度的OD值以及B/B0（不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)試孔OD值與含量為0的標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)試孔OD值的比值）進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如表2所示。從表2中可看出，當(dāng)呋喃西林代謝物SEM的衍生物含量為0.05 μg/L時(shí)，其B/B0值為73.44%，說(shuō)明其檢測(cè)OD與含0 μg/L濃度的呋喃西林代謝物SEM的衍生物測(cè)試孔OD值有明顯差異。

通過表2數(shù)據(jù)，采用ELISA Calc軟件進(jìn)行四參數(shù)Logistic曲線擬合繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖5），線性方程為：y=(A-D)/[1+(x/C)^B]+D，R2=0.9998，A=2.15892，B=0.64857，C=0.28492，D=-0.14724，x表示待測(cè)物濃度，y表示OD值，計(jì)算得到IC50值為0.23 μg/L，在0.05～4.05 μg/L呈線性關(guān)系。通過測(cè)定20個(gè)0 μg/L標(biāo)準(zhǔn)液，按公式Z=平均值-3標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算出了Z值為1.6484，把Z值做為Y值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線即可算出最低檢測(cè)限為0.04 μg/L。

表1 抗2-NPSEM單克隆抗體效價(jià)Table 1 Anti 2-NPSEM monoclonal antibody titer

表2 ciELISA法測(cè)試不同濃度SEM衍生物標(biāo)準(zhǔn)品的OD值及B/B0值Table 2 OD and B/B0 value of different concentrations of SEM derivate standards by ciELISA method

以相同方法對(duì)抗血清的交叉反應(yīng)性進(jìn)行測(cè)定，對(duì)結(jié)構(gòu)類似物NPAMOZ、NPAOZ和NPAHD的交叉反應(yīng)率分別為0.03%、0.02%和0.26%，結(jié)果表明該抗血清對(duì)其他三種硝基呋喃代謝衍生物均無(wú)交叉反應(yīng)，特異性良好。

3 討論

3.1 免疫檢測(cè)技術(shù)的關(guān)鍵是獲得性能優(yōu)良的人工合成抗原和抗體，而抗體的效價(jià)和特異性取決于人工合成抗原的結(jié)構(gòu)和活性?，F(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的呋喃西林代謝物 SEM 抗原的常用方法是將其改造為具有 4-CP或3-CP衍生物結(jié)構(gòu)的半抗原，然后偶聯(lián)蛋白制備完全抗原。此種方法共同點(diǎn)是半抗原結(jié)構(gòu)改造時(shí)沒有保留待測(cè)目標(biāo)物的優(yōu)勢(shì)基團(tuán)硝基端，導(dǎo)致制備獲得的抗體存在特異性差、親和力低。如李軍平[10]用3-羧基苯甲醛與 SEM 衍生制備了半抗原，通過偶聯(lián)蛋白后免疫小鼠制備了單克隆抗體，其IC50值僅為31.25 μg/L。因此，探索一種新的合成方法，對(duì)喃西林代謝物SEM結(jié)構(gòu)進(jìn)行合理衍生化改造，保留其優(yōu)勢(shì)基團(tuán)硝基端，對(duì)于獲得高效價(jià)的抗體及建立高效的ciELISA法檢測(cè)呋喃西林代謝物SEM極為關(guān)鍵。

3.2 本實(shí)驗(yàn)以呋喃西林代謝物 SEM 為模型，4-（3-醛基-4-硝基-苯氧基）-丁酸為衍生手臂，合成了一種新型SEM半抗原，偶聯(lián)載體蛋白后，通過Balb/c免疫，成功制備了對(duì)2-NPSEM 有較好識(shí)別作用的單克隆抗體。本實(shí)驗(yàn)的半抗原與傳統(tǒng)的4-CP或3-CP衍生化半抗原相比，具有明顯優(yōu)勢(shì)。半抗原引入的手臂不僅具有活性基團(tuán)，還完整保留了待測(cè)目標(biāo)物的硝基端，使得半抗原與待測(cè)目標(biāo)物的電子云密度一致，有效提高了小分子半抗原的免疫原性，提高了抗體質(zhì)量。

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