高效液相色譜法測(cè)定花椒中的苯甲酸

李曦，仲伶俐，趙珊，雷欣宇，魏超，郭靈安

（四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心，四川成都 610066）

花椒為天然植株蕓香科落葉灌木或小喬木蜀椒的果實(shí)，分布于亞洲、美洲、非洲及大洋洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)[1]，在我國主要產(chǎn)于山西、陜西、四川、山東、河北和河南等省。研究表明，花椒的主要化學(xué)成分有：蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪、礦物質(zhì)元素、氨基酸、揮發(fā)油、生物堿、酰胺和香豆素等[2]。

鳳凰網(wǎng)2017年6月報(bào)道，山東淄川區(qū)食藥監(jiān)局在對(duì)一超市的花椒抽檢中檢出苯甲酸，此外，在作者的日常檢測(cè)中，也在花椒中有檢出苯甲酸。GB 2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定食品中苯甲酸及其鈉鹽以苯甲酸計(jì)，花椒不在其范圍內(nèi)視為不得檢出[3]?；ń分袡z出苯甲酸與國家安全標(biāo)準(zhǔn)沖突，因而明確花椒中是否含有苯甲酸、含量如何，就成為當(dāng)前亟待解決的問題。明確其系內(nèi)源性苯甲酸或添加物，對(duì)判定廠家是否有非法添加行為至關(guān)重要。

苯甲酸，也稱為安息香酸，屬芳香族酸，未離解酸具抗菌活性，因而常以鈉鹽形式被添加飲料、果醬、蜜餞、糖果、醬油和醋等多種食品中[3]。苯甲酸以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)的形式天然存在于許多植物和動(dòng)物中，是植物和有機(jī)體的一種普遍代謝產(chǎn)物[4]。大多數(shù)漿果中均含有0.05%左右的苯甲酸，紅棗中苯甲酸含量可達(dá)到74～95 mg/kg[5]。除此之外，蜂蜜、牛奶和小麥中也都存在一定量的苯甲酸[6,7]。

傳統(tǒng)的檢測(cè)苯甲酸山梨酸的方法有液相色譜法、氣相色譜法、毛細(xì)管電泳法、紫外分光光度法和薄層層析法等[8]。因高效液相色譜法簡(jiǎn)便、高效、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，于2016年12月發(fā)布的GB 5009.28-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測(cè)定》也采用其作為測(cè)定苯甲酸和山梨酸的第一法[9]。標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)一般食品、含膠基食品、高油脂食品和液體食品的前處理方法進(jìn)行了詳細(xì)的分類說明，基本步驟是使用沉淀劑沉淀蛋白之后，用水定容過膜供液相色譜分析。該方法操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)限和回收率均符合要求，對(duì)大多數(shù)食品來說，分離效果良好。而對(duì)于像花椒這樣的天然復(fù)雜基質(zhì)，含有比一般食品更加復(fù)雜的成分，該方法由于除雜效果有限，花椒中的目標(biāo)物苯甲酸不能和其他成分有效地分離開。因而，有必要建立花椒中苯甲酸的高效液相色譜檢測(cè)方法，并對(duì)花椒中苯甲酸的含量進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 原料

花椒：共40批次樣品，抽取于四川各城市批發(fā)市場(chǎng)。

甲醇：色譜純，美國Fisher公司；甲酸：色譜純，德國CNW公司；氨水、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀：分析純，西隴化工；苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品：德國DR公司；混合陰離子小柱（60 mg/3 mL）：waters公司MAX小柱；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

1100高效液相色譜儀：美國Agilent公司；離心機(jī)：LD5-2A北京京立離心機(jī)有限公司；0.45 μm微孔濾膜：天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；超純水系統(tǒng)：成都優(yōu)普公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品50.0 mg于50 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度配置成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。量取儲(chǔ)備液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL至100 mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容后經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，得到濃度分別為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 樣品前處理

（1）樣品的提取

稱取2 g樣品于50 mL離心管中，加入2%氨水溶液21 mL，震搖2 min，超聲提取10 min，加入92 g/L的亞鐵氰化鉀和183 g/L的乙酸鋅溶液各2 mL，渦旋混勻，以5000 r/min離心5 min。上清液待凈化。

（2）樣品的凈化

依次用3 mL甲醇、3 mL水活化固相萃取小柱，準(zhǔn)確吸取提取液5.0 mL過此小柱。再依次用2%氨水溶液3 mL、甲醇3 mL淋洗，抽干小柱。用5%甲酸甲醇溶液2.0 mL洗脫，洗脫液過0.45 μm濾膜后，供高效液相色譜測(cè)定。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Waters sunfire C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫：35 ℃；流動(dòng)相A：磷酸鹽緩沖溶液（磷酸二氫鉀2.5 g和磷酸氫二鉀2.5 g定容至1 L），流動(dòng)相B：甲醇，A：B=97：3；流速：0.9 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；紫外檢測(cè)器波長：230 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取凈化方法的選擇

圖1 苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液及不同前處理圖譜Fig.1 The chromatograms of benzonic acid standard and samples with different pretreatment

GB 5009.28-2016中一般食品試樣的前處理方法如下：2 g樣品→加水25 mL渦旋→50 ℃超聲→亞鐵氰化鉀和乙酸鋅各2 mL→離心轉(zhuǎn)移水相于50 mL→殘?jiān)铀俅翁崛∞D(zhuǎn)移水相至 50 mL容量瓶→定容→0.22 μm濾膜過濾。該方法簡(jiǎn)便易操作，利于批樣處理。實(shí)驗(yàn)中除了亞鐵氰化鉀配合乙酸鋅作為澄清劑沉淀蛋白之外，沒有更多的除雜和凈化步驟。

因此我們除了使用亞鐵氰化鉀和乙酸鋅沉淀蛋白外，增加了固相萃取小柱凈化過程。實(shí)驗(yàn)采用Waters Oasis MAX固相萃取小柱，裝載混合型陰離子交換反相吸附劑，對(duì)酸性化合物具有高的選擇性和靈敏度。通過固相萃取步驟將花椒基質(zhì)中的分析物分成兩部分：酸性化合物和堿性/中性化合物，通過收集洗脫液得到包含目標(biāo)物苯甲酸在內(nèi)的酸性化合物混合液。

圖1是苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液以及同一花椒樣品分別采用以上兩種前處理之后的色譜圖，其中a為按照GB 5009.28-2016處理的色譜圖，b按本文1.3.2進(jìn)行前處理的色譜圖，c為濃度10.0 μg/mL的苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。圖中可見，色譜圖a未經(jīng)固相萃取凈化，譜圖雜峰較多，且在苯甲酸出峰位置正好有干擾峰；色譜圖b經(jīng)過陰離子交換固相萃取之后，譜圖較干凈，苯甲酸峰形完整，分離度合適。

2.2 儀器條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

圖2 四種色譜柱的標(biāo)樣圖譜Fig.2 The standard chromatograms of four different columns

本研究比較了以下四種色譜柱的分離效果：Waters sunfire C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、和Shiseido MGⅡC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent Zorbax SB-AQ（4.6 mm×150 mm，5 μm）和Agilent Zorbax SAX（4.6 mm×150 mm，5 μm）。流動(dòng)相條件為：10% MeoH+90%磷酸鹽緩沖溶液，流速 0.9 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長230 nm。在此條件下，苯甲酸在四種色譜柱的出峰時(shí)間先后分別為SB-AQ、MGⅡ、Sunfire、SAX，相應(yīng)的峰面積為414，427，429和384。分離雜質(zhì)與目標(biāo)峰的需要，色譜柱需要對(duì)苯甲酸有較強(qiáng)的保留，且結(jié)合峰面積，因而本實(shí)驗(yàn)選用Sunfire色譜柱對(duì)花椒中苯甲酸進(jìn)行分離。

2.2.2 流動(dòng)相

比較 20 mM/L乙酸銨-甲醇（國標(biāo) GB 5009.28-2016中使用的流動(dòng)相）和磷酸鹽緩沖溶液-甲醇作為流動(dòng)相的分離效果，兩種鹽溶液和甲醇的比例均為90：10。其他分析條件一致：流速0.9 mL/min，柱溫35 ℃，檢測(cè)波長230 nm，Waters sunfire C18色譜柱。

在此條件下，乙酸銨-甲醇和磷酸鹽緩沖溶液-甲醇作為流動(dòng)相苯甲酸的出峰時(shí)間分別為：6.147和9.157，色譜峰面積431和429。因而本實(shí)驗(yàn)選用了對(duì)苯甲酸有著更強(qiáng)保留作用的磷酸鹽緩沖溶液-甲醇作為流動(dòng)相。實(shí)驗(yàn)比較了磷酸鹽緩沖溶液-甲醇比例85：15、90：10、95：5、98：2 四種比例下的色譜圖情況，發(fā)現(xiàn)當(dāng)甲醇含量過高時(shí)，花椒樣品溶液中苯甲酸與相鄰峰未分離開。為滿足分離度要求，確定流動(dòng)相磷酸鹽緩沖溶液和甲醇比例的97：3。

2.2.3 方法的線性范圍和檢出限

配制質(zhì)量濃度為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，從低濃度到高濃度依次進(jìn)樣，計(jì)算各自的峰面積(每個(gè)樣平行進(jìn)樣三次)。按實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線，以濃度(X)對(duì)色譜峰面積(Y)進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程(見表1)。根據(jù)儀器靈敏度和添加回收實(shí)驗(yàn)，以信噪比（S/N）≥3計(jì)算方法的檢出限為2.0 mg/kg，低于國標(biāo)GB 5009.28-2016的檢出限5.0 mg/kg，能夠滿足國家限量標(biāo)準(zhǔn)要求。

表1 回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 1 Regression equations, correlation coefficient and LOD

2.2.4 方法回收率與精密度

對(duì)花椒樣品進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)。加標(biāo)濃度為2.0、5.0和20.0 mg/kg，每個(gè)濃度做三次平行試驗(yàn)。結(jié)果如表2，苯甲酸的加標(biāo)回收率為73.1%～94.3%，RSD為2.8%～7.4%。結(jié)果表明，經(jīng)混合陰離子固相萃取小柱凈化后，HPLC測(cè)定花椒中苯甲酸的準(zhǔn)確度和精密度較好，能滿足檢測(cè)要求。

表2 回收率與精密度實(shí)驗(yàn)Table 2 Results of recovery test and precision experiment

2.3 樣品測(cè)定

圖3 苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液及11號(hào)樣品的圖譜Fig.3 The chromatograms of benzonic acid standard and No. 11 sample

表3 花椒樣品中的苯甲酸含量（mg/kg）Table 3 The content of benzonic acid in Sichuan pepper samples (mg/kg)

采用本實(shí)驗(yàn)篩選出的方法對(duì) 40個(gè)花椒樣品中的苯甲酸進(jìn)行了測(cè)定，標(biāo)樣及11號(hào)樣品的圖譜見圖3。結(jié)果表明，苯甲酸在39個(gè)花椒樣品中有檢出，含量為2.08～12.20 mg/kg，平均含量6.02 mg/kg，結(jié)果見表3。可見花椒中含有一定量的苯甲酸，而少量的苯甲酸對(duì)人體無毒害，它可以在體內(nèi)很快被吸收，主要與甘氨酸結(jié)合以馬尿酸的形式排出體外，也有一小部分與葡糖醛酸結(jié)合為 1-苯甲酰葡糖醛酸而排出[10]。10～14 h便可從體內(nèi)全部排出，因此少量的苯甲酸不會(huì)有積蓄作用。

3 結(jié)論

3.1 本研究確定了花椒中苯甲酸的高效液相色譜檢測(cè)方法并進(jìn)行了含量測(cè)定。在前處理中采用混合陰離子固相萃取小柱以凈化樣品，以磷酸鹽緩沖溶液-甲醇（95：5）為流動(dòng)相，選用Waters sunfire C18色譜柱在230 nm下進(jìn)行高效液相色譜分析，方法檢出限為2.0 mg/kg。該方法能有效地分開花椒中的目標(biāo)物和干擾物質(zhì)，具有簡(jiǎn)便性和通用性，能滿足添加劑檢測(cè)要求和國內(nèi)外限量標(biāo)準(zhǔn)要求，適用于復(fù)雜基質(zhì)中苯甲酸的測(cè)定。

3.2 采用該方法對(duì)四川的花椒主產(chǎn)區(qū)的40批次樣品進(jìn)行分析，檢測(cè)結(jié)果顯示 39批花椒樣品中檢出苯甲酸，含量為2.08～12.20 mg/kg，平均含量6.02 mg/kg?？梢娀ń分泻幸欢康谋郊姿幔倭康谋郊姿嵩谌梭w內(nèi)可通過代謝排出。世界衛(wèi)生組織國際化學(xué)品安全署暫定的苯甲酸每日耐受攝入量為5.0 mg/kg體重[11]，且花椒僅作為調(diào)味料加入到食品中，因此花椒中的苯甲酸鈉不會(huì)對(duì)健康產(chǎn)生負(fù)面影響。

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