不同品系紅松籽油脂肪酸分析及其抗氧化活性研究

張思桐，楊凱，趙玉紅

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040）（2.黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究院，黑龍江哈爾濱 150081）

紅松(Pinus koraiensis)，又稱海松、紅果松，為松科松屬植物的常綠喬木。在中國主要分布在東北長白山到小興安嶺地區(qū)，常與魚鱗松、紅皮云杉等組成混交林，是重要的農(nóng)林資源[1]。紅松籽是松子成熟種子去皮后得到的種仁[2]，紅松籽顆粒飽滿，營養(yǎng)豐富，粗蛋白約16.5%、粗脂肪約63.5%、水分含量約4.2%、纖維含量13.6%、灰分3%左右[3]。松籽油含有的總酚與VE使其具有較強的抗氧化能力，此外還含有角鯊烯、芝麻素、谷甾醇和蝦青素等甾醇類物質(zhì)，具有優(yōu)良的營養(yǎng)價值[4,5]。研究表明，松籽油有調(diào)節(jié)血脂代謝[6]，有抑制食欲、近一步達到減肥的效果[7]，并具有抗癌[8]等功效。

松籽仁的高需求使得世界產(chǎn)量逐增。中國、韓國、俄羅斯和巴基斯坦都成為紅松的主要出口國[9]。松籽油出油率因提取方式的不同而略有差異(例如：冷壓榨法或溶劑浸提法)，但多數(shù)研究報道都在45～65 g/100 g左右[10～12]。Ryan等[12]研究表明松籽油中脂肪酸通常為50%多不飽和脂肪酸(PUFAs)、40%單不飽和脂肪酸(MUFAs)和 10%飽和脂肪酸(SFAs)。其中主要的多不飽和脂肪酸為亞油酸(48.4%)、油酸(25.5%)及棕櫚酸(4.2%)[12,13]。此外，西伯利亞紅松和某不確定基因型的紅松松籽油的過氧化值范圍在0.26～1.00 meq O2/kg和0.22 meq O2/kg[11,12]，這些結(jié)果均表明了松籽油中的不飽和脂肪酸具有良好的抗氧化穩(wěn)定性，松籽油中存在植物甾醇、生育酚和鯊烯等。

國內(nèi)外對紅松籽油的研究多為提取工藝[14]、開發(fā)調(diào)和油、軟膠囊和化妝品等衍生產(chǎn)品[15～17]、降血脂等動物實驗研究[18]及脂肪酸成分研究[19]等。而對高寒地區(qū)生長的不同品種(品系)紅松籽油成分及抗氧化的對比研究甚少。本研究選取黑龍江地區(qū)抗寒、豐產(chǎn)的10種紅松為原料，進行提取油脂，研究10種松籽油脂肪酸組成、理化性質(zhì)及抗氧化活性，通過主成分分析和聚類分析篩選出優(yōu)勢紅松品系，為今后紅松品種選育、食用松籽的生產(chǎn)提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料

1.1.1 實驗材料

依據(jù)黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所在省內(nèi)主要地區(qū)進行的抗寒性、豐產(chǎn)性評價基礎(chǔ)，在 25個品系中選取10個品種（品系）的紅松材料編號為1#025、2#058、3#060、4#066、5#117、6#118、7#119、8#124、9#148、10#179；-20 ℃冷藏。

1.1.2 實驗藥品

三吡啶基三嗪，上海源葉生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH），美國Sigma公司；其余試劑均為分析純等。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備

DZF-6053型烘箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；中藥粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司；JA2003型電子天平，上海良平儀器儀表有限公司；索氏抽提器，上海精科精密儀器公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，鞏義市予華儀器有限責任公司；Agilent GC 6890-MS 5973N型GC/MS氣質(zhì)聯(lián)用儀，濟南捷島分析儀器有限公司；722N可見分光光度計，上海市佑科儀器儀表有限公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；TDL-40B-W離心機，上海習(xí)仁科學(xué)儀器有限公司；DK-8D型電熱恒溫水槽，上海一恒科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預(yù)處理

將10種的紅松籽去殼、去皮，粉碎烘干于-20 ℃保存。出油量的測定參照GB/T 5512-2008《食品中粗脂肪的測定》的方法[20,21]。采用索氏提取法提取率最高[22]，溶劑選用石油醚，抽提時間為 6 h。紅松籽出油率為：

式中：W為出油率%；M為試樣質(zhì)量，g；M1為空燒瓶質(zhì)量，g；M2為燒瓶與油樣質(zhì)量，g。

1.2.2 脂肪酸分析

采用氣相色譜法，脂肪酸經(jīng)甲酯化：稱取油脂 3 mL，置于10 mL容量瓶內(nèi)，加入1 mL正己烷和苯的混合溶劑(體積比1：1)，輕輕搖勻使之溶解；再加入1 mL 0.5 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液，混勻；在室溫條件下靜置30 min，加1 mL蒸餾水使全部有機相甲醇溶液升至瓶頸上部；靜置，取上清液，用于GC氣象色譜分析。

氣相色譜條件[19]，色譜柱：SP-2560(100 m×0.25 mm×0.2 μm，Supelco，PA)；色譜條件：進樣口溫度250 ℃，載氣 N2，流速 52 mL/min；柱溫先保持 100 ℃(5 min)，采用程序升溫以4 ℃/min升至220 ℃保持20 min，并計算出不飽和脂肪酸、飽和脂肪酸含量及其比值。

1.2.3 VE測定

參照鄧娜等[23]方法。VE含量計算式為：

式中：X為樣品中維生素E的量，μg/g；c為標準曲線上查得樣品溶液中維生素E的含量，μg/mL；c0為標準曲線上查得樣品空白液中維生素E的含量，μg/mL；m為樣品質(zhì)量，g；V為樣品提取后加入無水乙醇定容之體積，mL。

1.2.4 抗氧化測定

1.2.4.1 DPPH自由基清除活性

參考 Emira Noumi等[24]方法，采用1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl DPPH測定DPPH自由基清除能力。經(jīng)調(diào)整，取0.1 mL紅松籽油定容到2 mL混勻，加入2.0 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液混勻，于暗處避光處理30 min，在波長517 nm處測定其吸光度。

式中：A1為樣品與DPPH反應(yīng)的吸光度；A2為DPPH替換成無水乙醇的吸光度；A3為空白組的吸光度。

1.2.4.2 總還原能力

采用FRAP法，參考E.Tsantili等[25]方法，精確稱取6.08 mg硫酸亞鐵標準品溶解于50 mL蒸餾水中，即得濃度為0.1 mol/L的硫酸亞鐵標準溶液。分別稀釋為0.01，0.02，0.04，0.05，0.08，0.1 mol/L濃度。加入配好的3 mL FRAP工作液（現(xiàn)配37 ℃保溫）混勻，于37 ℃水浴中反應(yīng)30 min，在波長593 nm處測定其吸光度。繪制標準曲線，得到的回歸方程為：y=3.9242x-0.0006，相關(guān)系數(shù)R2=0.9999。

樣品FRAP測定：取樣液100 μL，按上述步驟操作，在波長593 nm處測定其吸光度。樣液中抗氧化能力以FRAP值表示，即樣品的抗氧化能力相當于硫酸亞鐵標準品的mmol/L數(shù)。

1.2.4.3 羥基自由基清除能力

參考孟阿會[26]方法。加1 mL 6 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液和1 mL 6 mmol/L硫酸亞鐵溶液進試管；后分別加1 mL的稀釋樣液；最后加入1 mL 0.1%雙氧水溶液搖勻，放置在37 ℃反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后在4000 r/min 30 min離心，取上清液測其在510 nm處的吸光值。以蒸餾水取代雙氧水作為對照組，以蒸餾水取代樣液作為空白組。

式中：A1為樣品的吸光度；A2為對照組的吸光度；A0為空白的吸光度。

1.2.4.4 超氧陰離子清除能力

參考周鳳娟等[27]實驗方法，以維生素C為對照品，采用鄰苯三酚自氧化法測定核桃油自由基清除劑對其產(chǎn)生的超氧陰離子自由基的清除作用。分別取 1.0 mg/mL油-乙醇溶液、維C溶液于10 mL試管中；加入pH 8.2的Tris-HCl溶液，20 ℃水浴20 min平衡；加入5 mL鄰苯三酚溶液50 μL迅速混勻。以蒸餾水為空白，每30 s一個周期測定溶液在325 nm處的吸光值。

式中：A1為樣品的吸光度30 s內(nèi)變化值；A0為空白的吸光度30 s內(nèi)變化值。

1.2.5 理化性質(zhì)

參照國標 GB/T 5530-2005、GB/T 5532-2008和GB/T 5538-2005測定油脂酸價[28]、碘值[29]和過氧化值[30]。

1.2.6 統(tǒng)計分析

用Origin 8及SPSS 21.0對數(shù)據(jù)進行分析，所得結(jié)果用平均值±標準差(±s，n=3)表示，以 p＜0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同品系紅松松籽油脂出油率

10種紅松松籽不同部位的出油率見表1。由表可知，10種松籽仁平均出油率為 64.74%，出油率從61.33%（4#060）到69.05%（4#066）不等，其中有4個品種的出油率大于 65%(1#025、4#066、5#117、9#148)。10個品種中，1#、4#、9#與其余紅松籽仁的出油率間存在顯著性差異(p＜0.05)。與伊春市林業(yè)局紅松籽[14]含油量（68.06±0.23）%相符，略低于 H.Miraliakbari等[31]研究加拿大松仁油出油率(75.1±0.2)%。

經(jīng)三者比較，東北紅松與加拿大紅松含油量存在明顯差異且含油量也會受不同地域及氣候等環(huán)境因素而影響。此外，松籽殼和松仁紅衣的平均出油率為9.27%、20.94%，最高值僅 30%左右，是松籽仁含油量的一半以下。因此，紅松松籽油出油率高，具有較高的商業(yè)價值。

表1 不同品系紅松籽出油率Table 1 The oil yield of Pinus koraiensis seed from different strains

2.2 松籽油理化性質(zhì)

由表2可見，不同品種松籽油之間理化性質(zhì)存在顯著差異（p＜0.05）。酸價是用于評定油脂好壞，酸價越小，油脂新鮮度越好。松籽油脂的酸價在0.72～1.12 mg KOH/g之間，即6#118酸價最小，油脂質(zhì)量最好，5#117最次。

而碘值則反應(yīng)油脂的不飽和程度和干性，碘值越大則不飽和程度越大，油干性越大。碘值在88.13～127.22 g I2/100 g之間，其中8#124碘值接近130 g I2/100 g干性油。過氧化值用于衡量油脂酸敗程度，過氧化值越高，酸敗越嚴重。其過氧化值在0.17～1.28 meq/kg之間。國家食品衛(wèi)生標準GB 2716-2005對油脂酸價和過氧化值有一個統(tǒng)一的最高限量標準，即植物原油酸價≤4 mg KOH/g，過氧化值≤19.7 meq/kg，實驗結(jié)果均在國標范圍以內(nèi)。

表2 不同品系紅松籽油脂理化性質(zhì)比較Table 2 Comparison of physicochemical properties of Pinus koraiensis seedoil from different strains

表3 不同品種松籽油脂脂肪酸分析Table 3 Fatty acid analysis of different Pinus koraiensis seed oil

2.3 不同品系松籽油脂肪酸組成及含量

2.3.1 脂肪酸組成及含量

通過氣相色譜法對不同種類松籽油的脂肪酸進行分析，分析譜圖見圖1，分析結(jié)果見表3。

由表3可知，不同品種松籽油脂肪酸含量略有差異。10種紅松松籽油脂肪酸均以亞油酸含量最高，平均 含 量 為 44.84%， 從 43.203%(10#179)到46.135%(6#118)不等。

圖1 松籽油脂肪酸成分氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatogram of fatty acid in different Pinus koraiensis seed oil

與朱雪梅等[19]研究松籽油脂肪酸分布特征中亞油酸含量46.29%相符。而榛子類堅果則以油酸含量最高，均含量70%左右[23]。亞油酸作為人體必需脂肪酸，具有降低血脂、抗癌等功能[32,33]。松籽油富含的多種不飽和脂肪酸，使其在降血壓、降膽固醇等方面具有重要作用，故而松籽油具有很高的營養(yǎng)價值。脂肪酸中油酸含量均在亞油酸含量的一半以上，平均含量為26.57%，與亞油酸呈負相關(guān)，二者總含量超過70%。其中飽和脂肪酸棕櫚酸(C16：0)和硬脂酸(C18：0)均含量分別為 5.18%和 2.53%。十六碳烯酸(C16：1)和二十碳酸(C20：0)含量較少，從 0.59%（8#124）到 0.733%(4#066)、0.49%(4#066)到 0.754(1#025)不等。UFA/SFA、MUFA/SFA、PUFA/SFA的均值分別為10.67、3.45和7.22，多不飽和脂肪酸占有的比例最大，為單不飽和脂肪酸的2.1倍。

因高不飽和脂肪酸含量(90%)極易影響油脂氧化穩(wěn)定性，根據(jù)脂肪酸氧化速率油酸：亞油酸：亞麻酸=1：10：20，亞油酸高于橄欖油(9.48%亞油酸)五倍更易氧化[34]。所以松籽油中天然的抗氧化物質(zhì)對抑制氧化、延長貨架期具有重要作用。

2.3.2 VE分析

比色法測定 VE含量。標準曲線為y=0.22882x+0.01624，R2=0.99907，回歸曲線在0～4.0 μg/mL范圍內(nèi)線性良好。

由表4可知，不同品種松籽油間的α-VE含量存在顯著性差異(p＜0.05)。10種松籽油 α-VE含量在23.07±1.94 μg/g～162.22±6.55 μg/g，平均值為 97.33 μg/g。其中α-VE含量＞100 μg/g的有6種(3#、6#、7#、8#、9#和 10#)。品種 1#、2#、4#、5#與 Margit Kornsteiner等[35]對松籽油的α-VE含量研究值2.20 mg/100 g～6.00 mg/100 g一致，品種3#、6#、7#、8#、9#、10#與朱雪梅等[19]α-VE 含量15.01±1.22 mg/100 g 相符。SI值用于衡量油脂氧化穩(wěn)定性，可知氧化穩(wěn)定性順序為5#＜2#＜4#＜1#＜3#＜7#＜6#＜10#＜8#＜9#，即 9#148 和8#124油脂氧化穩(wěn)定性最好，可以儲存的時間較長。結(jié)合2.3.1結(jié)果可知，油脂氧化穩(wěn)定性與油脂中脂肪酸含量關(guān)系不明顯，而與存在的抗氧化物質(zhì)有關(guān)。

表4 不同品種松籽油的VE分析Table 4 VE analysis of different Pinus koraiensis seed oil

2.4 不同松籽油抗氧化能力比較

圖2 不同松籽油抗氧化能力Fig.2 The antioxidant activities in different Pinus koraiensis seed oil

10種松籽油的抗氧化能力(DPPH、超氧陰離子、羥基自由基、FRAP總還原能力)見圖2。其中10種松籽油整體的羥基自由基和超氧陰離子的清除能力較強，且2#058、3#060、4#066、5#117超氧陰離子%＜羥基自由基%，平均清除率為82.71%和70.46%。DPPH清除率均在60%以下，不同品種之間差異甚微。與其他三個抗氧化指標相比，F(xiàn)RAP總還原能力則因松籽油品種不同而存在顯著差異(p＜0.05)，可用于區(qū)分 10種松籽油的指標。2#058、3#060、9#148和10#179的總還原能力遠高于 5#117、6#118、7#119和8#124。3#060、9#148和10#179整體抗氧化能力最好，與表4中α-VE含量較多的3#、6#、9#、和10#相符，即松籽油抗氧化能力與VE含量及其他天然抗氧化物質(zhì)相關(guān)。

2.5 脂肪酸含量與抗氧化活性的相關(guān)性

不同品種松籽油的脂肪酸含量與抗氧化活性存在復(fù)雜的正負相關(guān)性。由表 5 可知，C18：2與 C18：3、C18：0與 SFA、C18：1與 MUFA、C18：2與 MUFA、C18：2與 PUFA、C18：3與 PUFA、SI與 VE均存在極顯著正相關(guān)。C18：1與 C18：2、C18：1與 C18：3、C18：3與 MUFA、C18：0與 UFA/SFA存在極顯著負相關(guān)（p＜0.01）。

C16：0與 C18：0、 C18：0與 MUFA/SFA 、 C18：0與PUFA/SFA 存在負相關(guān)。C18：1與 MUFA/SFA、UFA/SFA與MUFA/SFA、SI與OH存在正相關(guān)(p＜0.05)。除此，OH 與 C18：0、C18：1、SFA、FRAP、VE 和 SI存在較弱的正相關(guān)；與C18：3、PUFA、UFA/SFA、PUFA/SFA存在較弱的負相關(guān)。FRAP與C16：0存在較弱的正相關(guān)。VE、SI與 C18：3存在較弱的負相關(guān)。不同松籽油油脂的氧化穩(wěn)定性可以由OH、FRAP、SI衡量，即OH、FRAP值越大，VE含量最多，SI穩(wěn)定系數(shù)越大，則PUFA、UFA/SFA、PUFA/SFA越小。

表5 松籽油相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis among different Pinus koraiensis seed oil

注：*p＜0.05（雙側(cè)），**p＜0.01（雙側(cè)）。

2.6 聚類主成分分析(CLU-PCA)

公因子方差中各個變量共同度較高（均大于0.77），表明變量中大部分信息能被因子所提取，說明因子分析結(jié)果有效，可進行主成分分析。碎石圖用來確定最優(yōu)的主成分數(shù)目，橫坐標代表主成分數(shù)目，縱坐標代表特征值。

圖3 碎石圖Fig.3 Screen plot of PCA (principal component analysis)

圖4 主成分散點圖Fig.4 Scatter diagram of PCA(principal component analysis)

圖5 聚類分析Fig.5 Cluster analysis

主成分特征值的連線陡峭部分即為應(yīng)取的主成分數(shù)目。由碎石圖和Total Variance Explained分析可知，前3個因子的特征值λ＞1，連線較為陡峭，且累計方差貢獻率占86.39%，即前3個主成分對解釋變量的貢獻最大。

變量在主成分中得分的絕對值越大就表明其特征性越顯著。主成分的載荷矩陣旋轉(zhuǎn)之后載荷系數(shù)更接近1或者更接近0，這樣得到的主成分能夠更好的解釋和命名變量。由圖和表可知，前3個主成分累計得分為86.39%(＞80%)，代表10種松籽油脂肪酸86.39%的信息。其中，第一主成分F1貢獻率最高為41.905%，在變量 C18：1、C18：2、C18：3、MUFA、PUFA 具有較高的載荷系數(shù)。

其中 C18：2、C18：3、PUFA 在 F1上呈負向分布，C18：1和MUFA呈正向分布，即在F1坐標正向越大，C18：1、PUFA 最大，C18：2、C18：3、PUFA 越小，則 F1代表不飽和脂肪酸因子；F2貢獻率為30.76%，變量C18：0、SFA呈負相分布，UFA/SFA、MUFA/SFA和PUFA/SFA呈正向分布，則F2代表碳18飽和脂肪酸因子；F3貢獻率為13.724%，變量VE、SI和OH呈正向分布，則F3代表抗氧化穩(wěn)定性因子。

在SPSS 21.0中根據(jù)10種松籽油中脂肪酸的含量、主成分的特征值和載荷值繪制出其主成分散點圖[36]。以F1為橫坐標，F(xiàn)2、F3主成分值為縱坐標。根據(jù)散點圖中點與點之間的距離代表特征差異程度。

用主成分F1、F2、F3作為變量通過聚類分析得到3類：一類是1#025、2#058、4#066和5#117（抗氧化活性弱于二、三類）；二類是6#118、7#119、8#124、10#179；三類是3#060、9#148。同一類群松籽油的脂肪酸組成、含油量以及抗氧化活性具有相似性。

表6 各主成分的特征值和方差貢獻率Table 6 The characteristic value and variance contribution rate of each principal component

表7 主成分分析旋轉(zhuǎn)矩陣Table 7 Rotated component matrix of PCA (principal component analysis)

3 結(jié)論

10種松籽油均具有較高的出油率和抗氧化活性，且松籽油中富含豐富的亞油酸等不飽和脂肪酸。通過對10種松籽油的脂肪酸和抗氧化穩(wěn)定性研究可知：同一類群松籽油的脂肪酸組成、含油量以及抗氧化活性具有相似性。依據(jù)主成分分析和聚類分析將10種松籽油分成 3個類群：一類是 1#025、2#058、4#066和5#117；二類是6#118、7#119、8#124、10#179；三類是3#060、9#148。

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