小鼠CD40胞外片段的原核表達(dá)及多克隆抗體的制備

曹旗 潘悅 鄭宇

摘要：為了探討CD40抗體與CD40結(jié)合對B細(xì)胞應(yīng)答小分子半抗原的增強(qiáng)作用，利用TRIzol法提取BALB/c小鼠脾臟總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA;根據(jù)CD40的胞外段CDS設(shè)計引物，通過PCR擴(kuò)增目的基因，構(gòu)建pGEX4T-1-CD40表達(dá)載體，進(jìn)行原核表達(dá)及多克隆抗體制備。結(jié)果表明，成功擴(kuò)增了522 bp的目的基因，表達(dá)并純化獲得了45 ku的CD40重組蛋白，多克隆抗體抗體不但可與重組蛋白結(jié)合，與小鼠脾臟天然CD40蛋白也可以特異性結(jié)合。說明CD40重組蛋白表達(dá)成功，且制備的抗體有望模擬CD40L為B細(xì)胞活化提供第二信號。

關(guān)鍵詞：CD40;原核表達(dá);多克隆抗體;半抗原;免疫增強(qiáng)

中圖分類號：Q786 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）06-0130-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.06.026 ? ? ? ? ? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Prokaryotic expression of mouse extracellular domain of CD40

and preparation of polyclonal antibody

CAO Qi，PAN Yue，ZHENG Yu，WANG Han，REN Hong-lin，HU Pan，

LI Yan-song，ZHOU Yu，LIU Zeng-shan，LU Shi-ying

（College of Veterinary Medicine，Jilin University/Institute of Zoonosis/Key Laboratory of

Zoonosis Research Ministry of Education，Changchun 130062，China）

Abstract： To investigate the enhanced effect of CD40 antibody binding to CD40 on B-cell response to small molecule haptens，in this study， the total RNA of BALB/c mouse spleen was extracted by TRIzol method and reverse transcribed into cDNA; Primers were designed based on the CDS region of the extracellular domain of CD40， and the target gene was amplified by PCR to construct the pGEX4T-1-CD40 expression vector for prokaryotic expression;The polyclonal antibody was prepared. The results showed that the 522 bp target gene was successfully amplified， CD40 recombinant protein of 45 ku was expressed and purified. The antibody obtained by Western-blot detection not only binds to recombinant protein， but also can specifically bind to mouse spleen natural CD40 protein. Those indicated that the expression of CD40 recombinant protein is successful， and the prepared antibody was expected to mimic CD40L to provide the second signal for B cell activation.

Key words： CD40; prokaryotic expression; polyclonal antibody; hapten;immune enhancement

CD40（Cluster of Different 40，CD40）是Ⅰ型跨膜糖蛋白，屬于腫瘤壞死因子（TNF）受體超家族成員，在許多細(xì)胞如單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（DCs）、造血祖細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、B細(xì)胞和部分腫瘤細(xì)胞系上均有表達(dá)[1，2]。CD40與其配體CD40L是免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)系統(tǒng)中很重要的一對共刺激分子，參與機(jī)體T淋巴細(xì)胞依賴的B淋巴細(xì)胞應(yīng)答過程[3]。免疫細(xì)胞表面的CD40通過與三聚體形式的CD40L結(jié)合，提高細(xì)胞間的活性氧水平，這些活性氧，尤其是N-乙酰半胱氨酸，可以促進(jìn)免疫細(xì)胞活化、增殖、分化以及記憶細(xì)胞的生成，Ig的分泌與類型轉(zhuǎn)換，從而調(diào)節(jié)機(jī)體特異性體液免疫和細(xì)胞免疫[4-6]。有文獻(xiàn)報道，極少量的CD40抗體就可增強(qiáng)機(jī)體的免疫水平。CD40抗體與抗原進(jìn)入體內(nèi)后，CD40抗體能夠模擬CD40L特異性的與免疫細(xì)胞表面的CD40結(jié)合，作為B細(xì)胞活化的第二信號，無需借助T細(xì)胞輔助作用，因此可以更快地刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)對該免疫原作出反應(yīng)[7]。研究顯示CD40抗體在DNA疫苗、蛋白類、多糖類抗原免疫過程能夠發(fā)揮佐劑效應(yīng)。本研究擴(kuò)增了小鼠CD40胞外段CDS區(qū)序列，對其進(jìn)行原核表達(dá)，制備多克隆抗體，為進(jìn)一步研究CD40抗體對B細(xì)胞應(yīng)答半抗原過程中的免疫增強(qiáng)作用提供基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?實驗動物 ?成年雌性SPF級新西蘭大耳白兔和10周齡雌性SPF級balb/c小鼠購自遼寧長生生物技術(shù)公司。

1.1.2 ?試劑 ?大腸桿菌Rosetta（DE3）感受態(tài)和大腸桿菌（E.coli）DH5α購自北京天根生物科技有限公司;弗氏不完全和弗氏完全佐劑購自美國Sigma公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PGEX-4T-1質(zhì)粒購自寶生物工程（大連）有限公司;TRIzol、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ、ES-Taq酶、DL 2000 DNA Marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;PageRulerTM Prestained Marker購自美國Thermo fisher公司;膠回試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒和Western blot超敏發(fā)光液購自北京索萊寶科技有限公司;小鼠抗GST標(biāo)簽抗體和HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 ?試驗設(shè)備 ?超凈工作臺購自天津市生物潔凈設(shè)備廠;PCR儀購自蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司;電泳儀購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司;離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱、水浴鍋購自美國Thermo fisher公司;AKTA購自美國GE公司。

1.2 ?方法

1.2.1 ?引物設(shè)計 ?從NCBI獲取小鼠CD40基因序列（序列號：M83 312.1），選取胞外段即CDS區(qū)第58～579位堿基（522 bp）作為目的基因，用Primer Premier 5.0設(shè)計上下游引物，分別加入BamHⅠ和XhoⅠ兩個酶切位點（下劃線部分），F(xiàn)：5-CGCGGATCCCTAGGGCAGTGTGTTACGTG-3;R：5-CCG

CTCGAGTCGCATCCGGGACTTTAAAC-3，引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成。

1.2.2 ?小鼠脾臟細(xì)胞cDNA的獲取 ?用TRIzol法提取小鼠脾臟總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.3 ?目的基因的擴(kuò)增 ?以上面cDNA為模板，用設(shè)計的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)總體系為20 μL：模板2 μL，2×Es Taq MasterMix（Dye）10 μL，上、下游引物各1.5 μL，ddH2O 5 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段。

1.2.4 ?原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 ?用限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ將PCR產(chǎn)物和PMD18-T載體進(jìn)行雙酶切處理后，使酶切后的目的片段與克隆載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli.DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有氨芐的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)8 h，挑取單克隆菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)6 h，送至庫美生物科技有限公司測序，序列比對正確的重組質(zhì)粒命名為PMD18-T-CD40。再用限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ酶切PGEX4T-1和PMD18-T-CD40， 連接后轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂板后挑取單克隆菌株，測序鑒定，正確的質(zhì)粒命名為PGEX4T-1-CD40。

1.2.5 ?重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) ?提取上述鑒定正確的重組克隆質(zhì)粒PGEX4T-1-CD40，轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta（DE3）中，涂布于含有氨芐的LB固體培養(yǎng)基上，挑取單克隆菌株，接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)并測序，取測序正確的單克隆菌株保種;再接種于LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃搖床中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，經(jīng)終濃度1 mmol/L的IPTG來誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)2、3、4 h后，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳并染色。

1.2.6 ?重組蛋白的驗證及純化 ?使用Western-blot方法，一抗為鼠源GST標(biāo)簽單克隆抗體，用5%的脫脂奶粉2 000倍稀釋后，37 ℃孵育1 h;二抗為辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG，用5%的脫脂奶粉4 000倍稀釋，37 ℃孵育1 h后顯影。大量培養(yǎng)重組菌株，8 000 r/min離心20 min，收集菌體，PBS緩沖液重懸，冰浴下超聲破碎，離心取沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，用0.25 mol/L的KCl溶液染色30 s，切下白色目的條帶，移入另一干凈的平皿中，用蒸餾水沖洗，將膠條置于透析袋中在水平電泳槽中進(jìn)行電泳。用PBS緩沖液透析5次，每次間隔5 h。將收集到的蛋白用PEG 20 000濃縮，測定其濃度，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 ?多克隆抗體的制備、純化及鑒定 ?取新西蘭大白兔，耳緣靜脈收集陰性血清備用;初次免疫為500 μg重組蛋白和等體積完全弗氏佐劑混合后乳化，皮下多點注射免疫;然后加強(qiáng)免疫為500 μg重組蛋白和等體積不完全弗氏佐劑混合后乳化，皮下多點注射免疫;免疫周期為14 d/次，免疫次數(shù)為4次，心臟采血收集兔血清。利用A蛋白純化柱經(jīng)AKTA對抗血清進(jìn)行純化，SDS-PAGE分析抗體的純化情況，Western-blot檢測多抗中GST抗體與CD40重組蛋白和GST蛋白的反應(yīng)性，再用PGEX4T-1空質(zhì)粒表達(dá)的GST包涵體吸附多抗中多余的GST抗體，Western-blot檢測吸附后抗體與CD40重組蛋白和GST蛋白的反應(yīng)性，以及與小鼠脾臟細(xì)胞中CD40天然蛋白的結(jié)合活性。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?CD40目的片段擴(kuò)增結(jié)果

以小鼠脾臟細(xì)胞的cDNA為模板，用設(shè)計合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。結(jié)果表明，在522 bp處有明亮的條帶（圖1），與預(yù)期大小相符。

2.2 ?目的基因和載體酶切產(chǎn)物的鑒定

將PCR膠回收產(chǎn)物和載體pGEX4T-1以BamHⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，載體和目的基因均有明亮的條帶（圖2），且大小都符合預(yù)期。

2.3 ?CD40重組蛋白的表達(dá)及純化結(jié)果

將構(gòu)建的重組菌株，經(jīng)IPTG在37 ℃誘導(dǎo)后用SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果表明，成功表達(dá)CD40重組蛋白，在45 ku處有明顯條帶（圖3），與CD40理論分子質(zhì)量19 ku和GST理論分子質(zhì)量26 ku之和接近。且2、3、4 h的表達(dá)情況良好且相一致，所以確定最佳誘導(dǎo)時間是2 h。切膠純化后在45 ku處有重組蛋白（圖4）。

2.4 ?CD40重組蛋白的鑒定

利用Western-blot驗證CD40重組蛋白，可見在45 ku處有結(jié)合帶（圖5），與預(yù)期大小相符，表明CD40胞外段重組蛋白表達(dá)成功，且特異性良好。

2.5 ?多克隆抗體的純化

經(jīng)Protein A抗體純化柱用AKTA對CD40抗血清進(jìn)行純化，通過SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果（圖6）顯示，重鏈和輕鏈較為完整，且雜帶較少，純度較高。

2.6 ?標(biāo)簽抗體的清除及多克隆抗體的鑒定

以1∶1 000倍稀釋純化的多克隆抗體為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗，用Western-blot分別與CD40重組蛋白和PGEX4T-1誘導(dǎo)的GST蛋白反應(yīng)來檢測多克隆抗體的特異性。結(jié)果表明，該多抗與二者都能結(jié)合（圖7），表明其中含有GST標(biāo)簽抗體。經(jīng)GST包涵體吸附多抗中的GST抗體后，再用Western-blot分別與CD40重組蛋白和PGEX4T-1誘導(dǎo)的GST蛋白反應(yīng)來檢測多克隆抗體的特異性，可見GST蛋白無條帶，CD40重組蛋白有反應(yīng)條帶，說明多抗中GST標(biāo)簽抗體被清除，且CD40抗體特異性良好（圖8）。用清除GST抗體后的CD40抗體與小鼠脾臟提取的天然蛋白經(jīng)Western-blot反應(yīng)有條帶，說明該CD40抗體還可以識別CD40天然蛋白（圖9），可用于進(jìn)一步試驗。

3 ?小結(jié)與討論

小鼠的CD40（Cluster of Different 40，CD40）是包含270個氨基酸的Ⅰ型跨膜糖蛋白，其中胞外段174個氨基酸，跨膜區(qū)22個氨基酸，胞內(nèi)區(qū)74個氨基酸，屬于腫瘤壞死因子（TNF）受體超家族成員。CD40/CD40L共刺激途徑是機(jī)體免疫應(yīng)答過程中非常重要的組成部分，免疫細(xì)胞上的CD40通過其胞外區(qū)與可溶性的CD40L結(jié)合，發(fā)揮相應(yīng)生物學(xué)應(yīng)效[8]。因CD40L是以三聚體的形式在膜外與CD40胞外段結(jié)合，故本研究選取了小鼠CD40胞外段CDS區(qū)來進(jìn)行原核表達(dá)，初期利用pET-28a和pET-32a質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)載體，嘗試從16～37 ℃溫度、多種濃度IPTG以及多種感受態(tài)細(xì)胞等均未成功表達(dá)，猜想可能是因為此序列編碼的是膜蛋白，有較強(qiáng)的疏水區(qū)，疏水性多肽會抑制翻譯過程[9]。而后改用PGEX4T-1質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)載體，由于PGEX系列載體具有許多優(yōu)點如載體構(gòu)建無需考慮SD及RBS序列，表達(dá)效率、表達(dá)產(chǎn)率均較高，易于表達(dá)等優(yōu)點[10，11]，在37 ℃成功誘表達(dá)出重組蛋白。IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)2、3、4 h后顯示表達(dá)量無明顯差異 ，均能表達(dá)大量包涵體，所以確定最佳誘導(dǎo)時間為2 h。切膠純化的包涵體無雜帶，純度較高;多克隆抗體制備成功后，因其中含有GST抗體，故用GST包涵體將其吸附，盡可能減少其他抗體影響，吸附后的CD40抗體能與CD40重組蛋白以及小鼠天然CD40結(jié)合，特異性良好，可用于進(jìn)一步試驗。

研究表明，CD40抗體可作為分子免疫佐劑，有著顯著的免疫增強(qiáng)效應(yīng)。Vinuesa等[12]的研究表明，CD40抗體能夠在不依賴T細(xì)胞輔助的情況下，增強(qiáng)機(jī)體對細(xì)菌莢膜多糖的反應(yīng)原性，常伴有樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及B細(xì)胞顯著的再分布和增殖，同時還能維持脾臟中漿細(xì)胞的生長，使抗原特異性漿細(xì)胞的數(shù)量增加。Rycyzyn等[13]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD40抗體可活化和誘導(dǎo)體外靜止性B淋巴細(xì)胞體外增殖，顯示CD40抗體能夠使B細(xì)胞在狀態(tài)和數(shù)量上發(fā)生改變，可增強(qiáng)免疫效果。Barr等[14，15]研究發(fā)現(xiàn)將T細(xì)胞依賴性抗原與0.5 mg的CD40抗體共同免疫時，機(jī)體可以產(chǎn)生很強(qiáng)的針對這種抗原的特異性免疫反應(yīng)，并且再次單獨免疫此抗原時，又可產(chǎn)生一種很強(qiáng)的再次免疫應(yīng)答，表明這種免疫應(yīng)答有較強(qiáng)的記憶性，可用于許多疫苗的生產(chǎn)。這些研究均顯示CD40抗體具有較強(qiáng)的增強(qiáng)免疫效應(yīng)，可以作為潛在的免疫佐劑。本研究成功進(jìn)行了鼠CD40胞外段的原核表達(dá)，并制備獲得了抗鼠CD40的特異性抗體，為繼續(xù)研究CD40抗體對機(jī)體B細(xì)胞應(yīng)答半抗原的免疫增強(qiáng)作用提供了充足的理論和試驗依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 羅龍龍，張 ?彥，侯春梅，等.抗CD40單克隆抗體研究進(jìn)展[J]. 中國實驗血液學(xué)雜志，2013，21（2）：508-512.

[2] 吳 ?甜，郭 ?韌，REN G. CD40/CD40L基因及其多態(tài)性與動脈粥樣硬化的研究進(jìn)展[J].中南大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2012，37（4）： 413-418.

[3] 杜振蘭. CD40-CD40L共刺激途徑在體液免疫和細(xì)胞免疫中的作用[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2012，28（12）：1341-1343.

[4] CLAUDE-HENRY V，GHANIA A G，JEREMY F，et al. CD40/CD40L interaction induces Abeta production and increases gamma-secretase activity independently of tumor necrosis factor receptor associated factor （TRAF） signaling[J]. Experimental cell research，2009，315（13）：2265-2274.

[5] NADEAU P J，ANNIE R，CATHERINE G S A，et al. Modulation of CD40-activated B lymphocytes by N-acetylcysteine involves decreased phosphorylation of STAT3[J]. Molecular immunology，2012，49（4）：582-592.

[6] 任 ?超，葛秀國，李吉霞.雞CD40L基因的原核表達(dá)及多克隆抗體的制備[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2014（7）：32-36.

[7] BARR T A，MCCORMICK A L，JENNIFER C，et al. A potent adjuvant effect of CD40 antibody attached to antigen[J].Immunology，2010，109（1）：87-92.

[8] 趙 ?燁，劉 ?璽，王若愚，等. CD40/CD40L系統(tǒng)對B淋巴細(xì)胞的作用研究進(jìn)展[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2015，31（5）： 144-147.

[9] 李向茸，馬瑞仙，李 ?倩，等.人跨膜蛋白39A原核表達(dá)載體構(gòu)建、條件優(yōu)化及可溶性表達(dá)[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2019，39（7）：932-936.

[10] 付 ?俊，繆時英，宋 ?偉.人精子肌動蛋白樣蛋白7a蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)的表達(dá)純化及多克隆抗體制備[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2013，29（5）：507-510.

[11] 周宇荀，魏東芝，王二力.融合蛋白表達(dá)載體pGEX及其應(yīng)用[J].生命科學(xué)，1998，10（3）：122-124.

[12] VINUESA C，GARCíA D E，MACLENNAN I C，et al. Anti-CD40 antibody enhances responses to polysaccharide without mimicking T cell help[J].European journal of immunology， 2015，29（10）：3216-3224.

[13] RYCYZYN M A，STAQUET K，F(xiàn)ISHER J，et al. The use of an anti-CD40 agonist monoclonal antibody during immunizations enhances hybridoma generation[J].Hybridoma，2008，27（1）：25-30.

[14] BARR T A，CARLRING J，HEATH A W.Co-stimulatory agonists as immunological adjuvants[J].Vaccine，2006，24（17）： 3399-3407.

[15] BARR T A，MCCORMICK A L，JENNIFER C，et al.A potent adjuvant effect of CD40 antibody attached to antigen[J].Immunology，2010，109（1）：87-92.