蛹蟲(chóng)草菌株胞外發(fā)酵液抗氧化能力評(píng)價(jià)及優(yōu)良菌株篩選

張疏雨，李劍梅，謝存一，柴林山，朱萬(wàn)芹

（遼寧省微生物科學(xué)研究院，遼寧朝陽(yáng) 122000）

蛹蟲(chóng)草（Cordycepsmilitaris）又名北冬蟲(chóng)夏草，分類學(xué)上屬于子囊菌亞門（Ascomycotina）、核菌綱（Pyreno?myce?tes）、球殼菌目（Sphaeriales）、麥角菌科（Clavicipti?aceae）、蟲(chóng)草屬（Cordyceps）[1?2]。蛹蟲(chóng)草廣泛分布于世界各地，在我國(guó)吉林、遼寧、河北、陜西、甘肅、安徽、山東、湖北、湖南、四川、貴州、福建、廣東、廣西、云南等地均有發(fā)現(xiàn)[3]，其主要化學(xué)成分有蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類、有機(jī)酸、生物堿、甾醇及酚類、無(wú)機(jī)元素和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等，不僅具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，而且具有抗癌、抗氧化、鎮(zhèn)定安眠、抗炎、治療心腦血管疾病等功效，已被國(guó)家科技部批注為新資源食品，極具營(yíng)養(yǎng)保健食品的開(kāi)發(fā)潛力[4?8]。目前，關(guān)于蛹蟲(chóng)草子實(shí)體產(chǎn)量?jī)?yōu)化、活性成分含量?jī)?yōu)化、菌絲體收率提升等方面的研究已獲得一些成果[9?10]，特別是通過(guò)液體發(fā)酵法培養(yǎng)蛹蟲(chóng)草菌絲體及發(fā)酵液，不僅周期短、條件簡(jiǎn)單、產(chǎn)量高，而且有利于活性成分含量提升及目的組分的提取，已經(jīng)成為了蛹蟲(chóng)草的研究熱點(diǎn)[11?12]。

研究表明，蛹蟲(chóng)草無(wú)性型液體發(fā)酵代謝產(chǎn)物及其發(fā)酵制品的水和乙醇提取物具有較強(qiáng)的抗氧化活性，其抗氧化能力與其對(duì)機(jī)體內(nèi)自由基的清除密切相關(guān)，是抗氧化食品、保健品、化妝品原料的良好來(lái)源[13?15]，培養(yǎng)高抗氧化功能的蛹蟲(chóng)草產(chǎn)品，可為蛹蟲(chóng)草的開(kāi)發(fā)利用提供新的商業(yè)市場(chǎng)。然而，蛹蟲(chóng)草無(wú)性型液體發(fā)酵代謝產(chǎn)物產(chǎn)量及其抗氧化活性的高低在很大程度上取決于蛹蟲(chóng)草菌種的生理生化活力，因而生產(chǎn)上迫切需要建立高抗氧化能力的蛹蟲(chóng)草優(yōu)良菌種評(píng)價(jià)篩選方法。目前，食用菌菌種的評(píng)價(jià)方法主要有分子生物學(xué)評(píng)價(jià)、試驗(yàn)評(píng)價(jià)以及生理生化評(píng)價(jià)方法[16]。盡管蛹蟲(chóng)草可以實(shí)現(xiàn)人工栽培，但生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，通過(guò)結(jié)實(shí)性實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)蛹蟲(chóng)草菌種質(zhì)量費(fèi)時(shí)費(fèi)力；通過(guò)生理生化方法評(píng)價(jià)、鑒定蛹蟲(chóng)草菌種具有實(shí)用、經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，是較為切實(shí)可行的方法之一。為篩選出抗氧化綜合能力強(qiáng)、高活力、生物學(xué)轉(zhuǎn)化率高的優(yōu)良菌株，本試驗(yàn)以10 株蛹蟲(chóng)草菌株為研究對(duì)象，以菌株生長(zhǎng)活力、發(fā)酵液胞外酶活力、抗氧化能力為指標(biāo)，在相關(guān)性分析的基礎(chǔ)上建立線性回歸方程，確定定向篩選模型，創(chuàng)新確定有效評(píng)價(jià)蛹蟲(chóng)草菌株抗氧化綜合能力的方法，并通過(guò)結(jié)實(shí)性試驗(yàn)中的蛹蟲(chóng)草生物學(xué)轉(zhuǎn)化率、子實(shí)體形態(tài)、蟲(chóng)草素含量、生長(zhǎng)周期等指標(biāo)對(duì)模型進(jìn)行可行性驗(yàn)證分析，以期為蛹蟲(chóng)草的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌株

供試蛹蟲(chóng)草菌株共10 株，種屬均為蛹蟲(chóng)草（Cordycepsmilitaris）。供試菌株編號(hào)、品種及來(lái)源如表1所示。

表1 蛹蟲(chóng)草供試菌株Table 1 Tested strains of Cordyceps militaris

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA 平板培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，KH2PO43 g，MgSO41.5 g，維生素B110 mg，瓊脂15 g，pH 值自然，水1 000 mL。121 ℃高溫高壓滅菌保持30 min。

液體搖瓶培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，KH2PO43 g，MgSO41.5 g，維生素B110 mg，pH 值自然，水1 000 mL。121 ℃高溫高壓滅菌保持30 min。

栽培培養(yǎng)基所需營(yíng)養(yǎng)液：MgSO41.0 g，KH2PO42.0 g，維生素B15 mg，配制成1 000 mL 溶液，備用。

麥粒培養(yǎng)基：650 mL 罐頭瓶，每瓶裝小麥粒35 g，麥?！脿I(yíng)養(yǎng)液=1∶1.7（g/mL）。用聚乙烯膜包裹瓶口，再用橡皮筋扎緊，于121 ℃下滅菌1 h，冷卻，備用。

1.1.3 試劑

蟲(chóng)草素標(biāo)準(zhǔn)品、乙酸鈉緩沖液（pH5.8，0.1 mol/L）：上海源葉生物科技有限公司；乙醇、葡萄糖、蛋白胨、硫酸鎂、絡(luò)氨酸、磷酸二氫鉀、可溶性淀粉（分析純）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；3，5 二硝基水楊酸（3，5?dinitrosalicylic acid，DNS）顯色劑（分析純）：廈門海標(biāo)科技有限公司；乙腈（色譜純）：天津星馬克科技發(fā)展有限公司；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T?AOC）測(cè)定試劑盒、1，1?二苯基?2?三硝基苯肼（1，1?di?phenyl?2?picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力測(cè)定試劑盒、羥自由基清除能力測(cè)定試劑盒、超氧陰離子自由基清除能力試劑盒、2，2′?聯(lián)氮?雙?3?乙基苯并噻唑啉?6?磺酸[2，2′?azino?bis（3?ethylbenzothiazoline?6?sulfonic acid），ABTS]、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer sa?line，PBS）：蘇州格銳思生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BHC?1300IIA/B2 生物安全柜：上海力申科學(xué)儀器有限公司；SPH?2102 立式雙層大容量恒溫培養(yǎng)搖床：上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；BCD?649WADV 冰箱：青島海爾股份有限公司；SPX?4501 生化培養(yǎng)箱：中儀國(guó)科（北京）科技有限公司；LDZX?75KBS 立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；2695 高效液相色譜儀、2489 二極管陣列檢測(cè)器：沃特世科技（上海）有限公司；USUXA42508 C18 色譜柱（5μm，4.6 mm×250 mm）：安捷倫科技（上海）有限公司；KQ?50DA 型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；723N 可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；HH?2 數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州市江南實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 菌絲生長(zhǎng)速度的測(cè)定

制備PDA 平板培養(yǎng)基（培養(yǎng)皿直徑90 mm），用打孔器取直徑6 mm 的相同菌齡菌絲塊，接種于PDA 培養(yǎng)基中部，置于（18±1）℃黑暗培養(yǎng)，十字交叉法劃線，當(dāng)菌落直徑達(dá)到2 cm 時(shí)，在菌落邊緣畫(huà)線作為菌絲生長(zhǎng)起始線，當(dāng)生長(zhǎng)最快的菌株即將長(zhǎng)滿PDA 平板時(shí)取出所有的培養(yǎng)皿，在菌落邊沿畫(huà)終止線，用游標(biāo)卡尺測(cè)量起始線與終止線之間的距離（不同方向測(cè)3 次，取平均值，精確到0.02 mm），將此距離除以培養(yǎng)時(shí)間（d）即為菌絲平均生長(zhǎng)速度。記錄菌絲長(zhǎng)勢(shì)及轉(zhuǎn)色后色澤，每個(gè)處理3 次重復(fù)。

1.3.2 發(fā)酵生物量的測(cè)定

液體搖瓶發(fā)酵：250 mL 錐形瓶中倒入100 mL 液體培養(yǎng)基，121 ℃高溫高壓滅菌30 min，冷卻備用；用打孔器取直徑6 mm 的平板培養(yǎng)基中相同菌齡菌絲塊，接種量為每瓶接種3 塊菌絲塊，于18 ℃、140 r/min條件下振蕩培養(yǎng)5～6 d，待長(zhǎng)勢(shì)最好的菌株發(fā)酵菌球豐富、黏稠后停止培養(yǎng)，用多層紗布過(guò)濾，濾液備用，用蒸餾水將沉淀清洗3 次后，收集菌絲體，置于烘箱烘干（55 ℃）至恒重，稱重。每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)。

1.3.3 供試樣品液前處理

將1.3.2 中供試菌株發(fā)酵液的備用濾液于4 ℃、8 000 ×g離心10 min，取上清液移入新的離心管，0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，得到胞外樣品液，用于胞外酶活力、抗氧化活性的測(cè)定。

1.3.4 β?葡萄糖苷酶活力測(cè)定

參照張曦文等[17]的測(cè)定方法，以葡萄糖的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得線性回歸方程為Y=1.091 1X-0.034 8（R2=0.996 1）。于540 nm 處分別測(cè)定不同供試菌株胞外樣品液的吸光度，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算胞外樣品液中葡萄糖的質(zhì)量濃度，并計(jì)算酶活力。酶活單位規(guī)定為每秒鐘生成1 mmol/mL 的葡萄糖為一個(gè)酶活單位（U）。

1.3.5 蛋白酶活力測(cè)定

參照肇瑩等[18]的測(cè)定方法，以酪氨酸濃度為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得線性回歸方程為Y=1.336 4X+0.007 3（R2=0.999 8）。于680 nm處分別測(cè)定不同供試菌株胞外樣品液的吸光度，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算胞外樣品液中酪氨酸的質(zhì)量濃度，并計(jì)算酶活力。酶活單位規(guī)定為1.0 mL 培養(yǎng)液中的酶量每秒鐘作用于底物釋放出酪氨酸的質(zhì)量（μg）為1 個(gè)活力單位（U）。

1.3.6 淀粉酶活力測(cè)定

試管中加入1.5 mL 的0.5% 可溶性淀粉溶液（用pH5.8，0.1 mol/L 乙酸鈉緩沖液配制）作為底物，加入0.5 mL 胞外樣品液，混勻，38 ℃恒溫水浴保溫30 min，取出后立即加入DNS 試劑1.5 mL，沸水浴5 min，冷卻后用蒸餾水定容至10 mL，混勻，于540 nm 處測(cè)吸光度。以煮沸10 min 的粗酶液作對(duì)照。以每毫升樣品中的酶量與底物反應(yīng)每分鐘內(nèi)改變0.01 個(gè)OD 值為一個(gè)活力單位（U）。淀粉酶標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=1.110 7X+0.075 2（R2=0.998 8）。

1.3.7 抗氧化能力測(cè)定

1.3.7.1 總抗氧化能力測(cè)定

參考試劑盒使用說(shuō)明，利用總抗氧化能力（T?AOC）測(cè)定試劑盒（ABTS 法）對(duì)供試樣品液進(jìn)行總抗氧化能力的測(cè)定，按照公式（1）計(jì)算供試樣品液總抗氧化能力（T，μmol Trolox/mL）。

式中：A測(cè)定為樣品ABTS 的吸光度；A對(duì)照為樣品與PBS 混合液吸光度；A空白為ABTS 工作液與PBS 混合液的吸光度；D表示樣品的稀釋倍數(shù)。

1.3.7.2 DPPH 自由基清除率測(cè)定

參考試劑盒使用說(shuō)明，利用DPPH 自由基清除能力測(cè)定試劑盒對(duì)供試樣品液進(jìn)行DPPH 自由基清除率的測(cè)定。按照公式（3）計(jì)算供試樣品液的DPPH 自由基清除率（D，%）。

式中：A測(cè)定為樣品與DPPH 混合液吸光度；A對(duì)照為樣品與無(wú)水乙醇混合液吸光度；A空白為DPPH 與無(wú)水乙醇混合液吸光度。

1.3.7.3 超氧陰離子自由基清除率測(cè)定

參考試劑盒使用說(shuō)明，利用超氧陰離子自由基清除能力試劑盒進(jìn)行超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定，按照公式（4）計(jì)算供試樣品的超氧陰離子自由基清除率（S，%）。

式中：A測(cè)定為測(cè)定管的吸光度；A對(duì)照為對(duì)照管的吸光度；A空白為空白管的吸光度。

1.3.7.4 羥自由基清除率測(cè)定

參考試劑盒使用說(shuō)明，利用羥自由基清除能力測(cè)定試劑盒進(jìn)行羥自由基清除率的測(cè)定，按照公式（5）計(jì)算供試樣品的羥自由基清除率（H，%）。

式中：A測(cè)定為測(cè)定管的吸光度；A對(duì)照為對(duì)照管的吸光度；A空白為空白管的吸光度。

1.3.8 模型的驗(yàn)證

對(duì)10 株蛹蟲(chóng)草供試菌株進(jìn)行小麥基質(zhì)人工培養(yǎng)[19]，并對(duì)菌株主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行評(píng)價(jià)。將蛹蟲(chóng)草液體菌種按照8 mL/瓶接種于麥粒培養(yǎng)基中，栽培條件：菌絲生長(zhǎng)階段18 ℃避光培養(yǎng)8～10 d，待菌絲長(zhǎng)滿基質(zhì)后進(jìn)行原基誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為300 lx 光照24 h、溫度20 ℃、空氣相對(duì)濕度不低于60%、二氧化碳濃度0.5%，當(dāng)培養(yǎng)至20 d 左右，菌絲由白色變成均勻的橘黃色，且形成針尖狀原基時(shí)，用滅菌后的接種針在封口膜上扎眼通氣（一般扎2 排孔，每排扎3 個(gè)直徑約2 mm的小孔即可），進(jìn)入子實(shí)體培養(yǎng)階段，當(dāng)培養(yǎng)60 d 左右時(shí)，采收子實(shí)體，記錄子實(shí)體性狀，計(jì)算生物學(xué)轉(zhuǎn)化率、菌種生長(zhǎng)周期，測(cè)定蟲(chóng)草素含量。

1.3.9 蟲(chóng)草素含量測(cè)定

參考NY/T 2116—2012《蟲(chóng)草制品中蟲(chóng)草素和腺苷的測(cè)定高效液相色譜法》[20]測(cè)定蛹蟲(chóng)草子實(shí)體提取液中蟲(chóng)草素含量。色譜條件：柱溫35 ℃；流動(dòng)相，5%乙腈，95%水；流速1.0 mL/min；檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)18 min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm；進(jìn)樣量10μL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：稱取蟲(chóng)草素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，去離子水溶解，用流動(dòng)相定容至100 mL 搖勻，配成濃度為100μg/mL 蟲(chóng)草素準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。?zhǔn)確吸取蟲(chóng)草素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.25、0.50、1.25、2.50、5.00、12.50 mL于25 mL 容量瓶中，用去離子水定容，搖勻，濃度為1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00 μg/mL，0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾。每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液重復(fù)進(jìn)樣3 次，得到相應(yīng)峰面積，計(jì)算平均值。以蟲(chóng)草素的濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，得到蟲(chóng)草素標(biāo)準(zhǔn)曲線y=34 479x+10 846（R2=0.998 3）。

樣品中蟲(chóng)草素含量測(cè)定：將供試蛹蟲(chóng)草子實(shí)體于55 ℃干燥至恒重，粉碎，過(guò)80 目篩，分析天平準(zhǔn)確稱?。?.50±0.01）g 于刻度管中，按照液料比20︰1（mL/g）加入70% 乙醇，在60 ℃條件下超聲提取3 h，70% 乙醇定容至25 mL，混勻，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，得到蛹蟲(chóng)草子實(shí)體提取液，按照上述高效液相色譜法分析，重復(fù)進(jìn)樣3 次，得到相應(yīng)峰面積，計(jì)算平均值，并帶入到標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算蟲(chóng)草素含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析處理

所有結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析。采用SPSS 19.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，以P＜0.05 表示差異顯著，以P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株生長(zhǎng)活力

2.1.1 菌株生長(zhǎng)特性及發(fā)酵生物量

供試蛹蟲(chóng)草菌株菌絲生長(zhǎng)速度和發(fā)酵生物量結(jié)果見(jiàn)圖1，菌株的菌落形態(tài)見(jiàn)圖2。

圖1 蛹蟲(chóng)草菌株的菌絲生長(zhǎng)速度和發(fā)酵生物量Fig.1 Mycelial growth rate and fermentation biomass of Cordyceps militaris strain

圖2 蛹蟲(chóng)草菌株的菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of Cordyceps militaris strain

由圖1 可知，10 株蛹蟲(chóng)草供試菌株菌絲生長(zhǎng)速度相差較大，其中CH?1、CA?1 明顯快于其他菌株，菌絲生長(zhǎng)速度為其他菌株的2 倍多，其次為CX?4、CY?1、CB?1、CX?3、CS?1，而CS?2、CX?1、CD?1 長(zhǎng)速最慢；從發(fā)酵生物量看，CH?1、CA?1 要高于其他8 株菌株，其次為CX?4、CB?1、CS?2、CX?3、CX?1、CY?1、CD?1，CS?1 發(fā)酵生物量最低。由圖2 可知，在菌落狀態(tài)方面，轉(zhuǎn)色前，10 株供試菌株菌絲致密，呈絨毛狀，菌落顏色為白色，轉(zhuǎn)色后，除菌株CS?2、CX?1、CD?1 菌落形態(tài)為稀疏淺黃色外，其他7 株菌株菌落顏色為黃色至橘黃色，其中CX?4、CY?1、CB?1、CS?1、CX?3 菌落為黃色，CH?1、CA?1菌落為橘黃色，菌絲致密絨毛狀，長(zhǎng)勢(shì)較好。綜合以上分析初步得到菌株CH?1、CA?1 在菌絲生長(zhǎng)速度、菌落狀態(tài)、發(fā)酵生物量方面明顯優(yōu)于其他菌株。

2.1.2 菌株胞外酶活力

食用菌在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中產(chǎn)生胞外酶，食用菌胞外酶可以將天然谷物、木料等培養(yǎng)料中的糖類、蛋白質(zhì)等大分子轉(zhuǎn)化成利于吸收的小分子物質(zhì)，為其菌絲生長(zhǎng)、原基分化、子實(shí)體生長(zhǎng)發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[21]。10 株供試菌株胞外酶活力見(jiàn)圖3。

圖3 供試菌株胞外酶活力Fig.3 Extracellular enzyme activity of tested strains

由圖3 可知，供試10 株菌株發(fā)酵液胞外酶活力差異較大，CA?1 的β?葡萄糖苷酶酶活力明顯高于其他菌株，CH?1、CS?2、CX?4、CS?1、CX?3、CY?1、CB?1 次之，CD?1、CX?1 最低；CH?1 蛋白酶活力最高，CA?1、CS?2、CS?1、CB?1、CY?1、CD?1、CX?3 次之，CX?4、CX?1 活性最低；CX?1 淀粉酶活性最強(qiáng)，CA?1、CH?1、CS?1、CY?1、CX?4、CX?3、CB?1、CD?1、CS?2 活性依次降低。

2.2 菌株抗氧化能力

10 株供試蛹蟲(chóng)草菌株胞外樣品液羥自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率、DPPH 自由基清除率和總抗氧化能力結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 供試菌株抗氧化能力Fig.4 Antioxidant activity of tested strains

由圖4 可知，CH?1 的羥自由基清除率超過(guò)了60%，明顯高于其他菌株；CA?1 的超氧陰離子自由基清除率最高，其次是CH?1、CD?1、CS?1；CX?4、CS?2 的DPPH 自由基清除率較高，CB?1、CH?1 次之；總抗氧化能力方面，CH?1、CA?1、CY?1 表現(xiàn)出了一定的優(yōu)勢(shì)。

2.3 抗氧化綜合能力與生長(zhǎng)活力指標(biāo)的相關(guān)性分析及模型建立

隸屬函數(shù)是用于表征模糊集合的數(shù)學(xué)工具，為了能夠更簡(jiǎn)單直觀的表達(dá)供試蛹蟲(chóng)草菌株的抗氧化綜合能力，對(duì)羥自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率、DPPH 自由基清除率和總抗氧化能力采用隸屬函數(shù)值法進(jìn)行賦值計(jì)算，得到平均隸屬函數(shù)值，結(jié)果見(jiàn)表2。隸屬函數(shù)值的范圍為0～1，數(shù)值越大說(shuō)明該菌株的抗氧化綜合能力越高。這里定義平均隸屬函數(shù)值代表蛹蟲(chóng)草菌株抗氧化綜合能力。

表2 供試菌株隸屬函數(shù)值計(jì)算表Table 2 Calculation of membership function value of tested strains

使用SPSS 軟件對(duì)10 株蛹蟲(chóng)草菌株的菌絲生長(zhǎng)速度、搖瓶發(fā)酵生物量、胞外酶活力和抗氧化綜合能力進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 蛹蟲(chóng)草10 菌株指標(biāo)相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of indicators of Cordyceps militaris strain 10

由表3 可知，抗氧化綜合能力與發(fā)酵生物量、菌絲生長(zhǎng)速度、β?葡萄糖苷酶活力、蛋白酶活力呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），發(fā)酵生物量與菌絲生長(zhǎng)速度、β?葡萄糖苷酶活力呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），菌絲生長(zhǎng)速度與β?葡萄糖苷酶活力、蛋白酶活力呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），β?葡萄糖苷酶活力與蛋白酶活力呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），淀粉酶活力與各活性指標(biāo)有一定相關(guān)性。

為了進(jìn)一步闡明10 個(gè)蛹蟲(chóng)草菌株抗氧化綜合能力與發(fā)酵生物量、菌絲生長(zhǎng)速度、β?葡萄糖苷酶活力、蛋白酶活力之間的內(nèi)在聯(lián)系，采用多元線性回歸方法分析各解釋變量的影響程度，決定具有代表性的指標(biāo)對(duì)抗氧化綜合能力的解釋水平。以抗氧化綜合能力作為因變量，以發(fā)酵生物量、菌絲生長(zhǎng)速度、β?葡萄糖苷酶活力、蛋白酶活力為自變量，建立多元線性數(shù)學(xué)模型，模型公式如公式（6）所示。

式中：BY為蛹蟲(chóng)草菌株抗氧化綜合能力；BFER為發(fā)酵生物量，g/100 mL；BCMD為菌絲平均生長(zhǎng)速度，cm/d；BGLU為β?葡萄糖苷酶活力，U；BPRO為蛋白酶活力，U；A0為常數(shù)；A1、A2、A3、A4為變量系數(shù)。

運(yùn)用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行多元線性回歸分析，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 多元線性回歸分析Table 4 Multiple linear regression analysis

由表4 顯著性分析可知，菌絲平均生長(zhǎng)速度、發(fā)酵生物量、蛋白酶活力、β?葡萄糖苷酶活力對(duì)蛹蟲(chóng)草菌株抗氧化綜合能力的貢獻(xiàn)程度依次遞減，這些變量具有一定的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)回歸模型，可以得到蛹蟲(chóng)草菌株抗氧化綜合能力與發(fā)酵生物量、菌絲平均生長(zhǎng)速度、β?葡萄糖苷酶活力、蛋白酶活力的數(shù)學(xué)模型，線性方程如公式（7）所示。

所有的指標(biāo)中對(duì)蛹蟲(chóng)草菌株抗氧化綜合能力貢獻(xiàn)最大的是菌絲平均生長(zhǎng)速度，其次分別是發(fā)酵生物量、蛋白酶活力、β?葡萄糖苷酶活力。因此，可以根據(jù)此模型來(lái)快速篩選出具有高抗氧化綜合能力的蛹蟲(chóng)草菌株：即通過(guò)比較菌絲的平均生長(zhǎng)速度及生長(zhǎng)狀況，初步篩選出菌絲生長(zhǎng)快、致密、顏色鮮黃的菌株，然后通過(guò)比較菌株的搖瓶生物量，篩選出發(fā)酵生物量較高的菌株，最后測(cè)定菌株的蛋白酶活力、β?葡萄糖苷酶酶活力，從而篩選出具有高抗氧化綜合能力的蛹蟲(chóng)草菌株。

2.4 模型的驗(yàn)證

對(duì)10 株蛹蟲(chóng)草供試菌株進(jìn)行小麥基質(zhì)人工培養(yǎng)，并對(duì)菌株主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行評(píng)價(jià)，驗(yàn)證栽培優(yōu)勢(shì)菌株與模型選擇的優(yōu)勢(shì)菌株是否一致。10 株蛹蟲(chóng)草菌株子實(shí)體生物學(xué)性狀和外觀見(jiàn)表5 和圖5。

圖5 10 株蛹蟲(chóng)草菌株子實(shí)體生長(zhǎng)圖Fig.5 Growth of fruiting bodies of 10 Cordyceps militaris strains

表5 菌株子實(shí)體生物學(xué)性狀Table 5 Biological characteristics of fruiting bodies of strains

由表5、圖5 可知，菌株CH?1 與CA?1 子實(shí)體形成能力強(qiáng)、農(nóng)藝性狀優(yōu)良，子實(shí)體生物轉(zhuǎn)化率達(dá)到90%以上，CS?1、CS?2、CX?3、CX?4 子實(shí)體生物學(xué)轉(zhuǎn)化率達(dá)到50% 以上，CB?1、CD?1、CX?1、CY?1 菌株較差，子實(shí)體生物轉(zhuǎn)化率在50%以下；蛹蟲(chóng)草CH?1、CA?1 菌株蟲(chóng)草素含量較野生菌株（CX?4、CS?2、CX?1）高60%左右，菌株生長(zhǎng)周期短10 d 左右，綜合子實(shí)體性狀、生物轉(zhuǎn)化率等指標(biāo)，蛹蟲(chóng)草CH?1、CA?1 菌株為優(yōu)勢(shì)菌株，與模型選擇的菌株一致，表明抗氧化綜合能力高的菌株子實(shí)體農(nóng)藝性狀也較好，說(shuō)明模型具有一定可行性。

3 討論與結(jié)論

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平的提高，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)對(duì)蛹蟲(chóng)草的需求量急劇增加。研究表明，蛹蟲(chóng)草發(fā)酵菌絲體也具有良好的生物活性，所以采用液體發(fā)酵技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)蛹蟲(chóng)草菌絲體是滿足國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)需求的有效途徑，而發(fā)酵獲得的蛹蟲(chóng)草菌絲體的產(chǎn)量及其抗氧化能力的高低在很大程度上決定了蛹蟲(chóng)草菌種的優(yōu)劣[21]。菌種優(yōu)劣的評(píng)價(jià)通常采取出菇試驗(yàn)來(lái)進(jìn)行，但由于受多種因素影響，導(dǎo)致出菇試驗(yàn)評(píng)價(jià)結(jié)果不穩(wěn)定，并且實(shí)驗(yàn)成本較高，周期比較長(zhǎng)。目前，已有一些可以方便快捷評(píng)價(jià)菌種質(zhì)量的相關(guān)報(bào)道：宋好倩[22]研究發(fā)現(xiàn)淀粉酶與蛹蟲(chóng)草子實(shí)體的生長(zhǎng)呈正相關(guān)，纖維素酶和淀粉酶活性在轉(zhuǎn)色期達(dá)到峰值；楊歡東[23]研究發(fā)現(xiàn)異硫氰酸烯丙酯（allyl?isothiocyanate，AITC）處理能夠有效保持SOD 酶活較高活性，提高鐵離子抗氧化能力（Ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）值、DPPH自由基清除能力和ABTS 陽(yáng)離子自由基清除能力；劉淑琴等[24]研究發(fā)現(xiàn)蛹蟲(chóng)草子實(shí)體的產(chǎn)量與液體菌種的氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chloride，TTC）酶活力呈正相關(guān)。

雖然相關(guān)研究對(duì)于蛹蟲(chóng)草菌種質(zhì)量評(píng)價(jià)具有重要意義，但從總體上來(lái)講，研究方法相對(duì)單一，難以綜合反映蛹蟲(chóng)草菌株的生長(zhǎng)活性和抗氧化活性的問(wèn)題。本研究通過(guò)測(cè)定蛹蟲(chóng)草菌株的菌絲生長(zhǎng)活力、相關(guān)酶活及清除自由基等指標(biāo)，對(duì)10 株供試菌株進(jìn)行較為全面的評(píng)價(jià)，得到相關(guān)性分析結(jié)果：抗氧化綜合能力與發(fā)酵生物量、菌絲生長(zhǎng)速度、β?葡萄糖苷酶活力、蛋白酶活力呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；發(fā)酵生物量與菌絲生長(zhǎng)速度、β?葡萄糖苷酶活力呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；菌絲生長(zhǎng)速度與β?葡萄糖苷酶活力、蛋白酶活力呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；β?葡萄糖苷酶活力與蛋白酶活力呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；這些生理生化指標(biāo)可以作為蛹蟲(chóng)草優(yōu)良菌株篩選的重要指標(biāo)。采用相關(guān)數(shù)據(jù)分析軟件建立得到了蛹蟲(chóng)草菌株抗氧化綜合能力與發(fā)酵生物量、菌絲平均生長(zhǎng)速度、β?葡萄糖苷酶活力、蛋白酶活力的數(shù)學(xué)模型，可以根據(jù)此模型來(lái)快速篩選出具有高抗氧化綜合能力的蛹蟲(chóng)草菌株，克服了以往蛹蟲(chóng)草菌株活力評(píng)價(jià)相關(guān)報(bào)道的單一性，通過(guò)結(jié)實(shí)性實(shí)驗(yàn)對(duì)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證，表明抗氧化綜合能力高的菌株具有很好的子實(shí)體農(nóng)藝性狀和生物轉(zhuǎn)化率，說(shuō)明模型具有一定可行性，也為蛹蟲(chóng)草優(yōu)良菌種選育提供了一定的參考。