冠突散囊菌及其次級代謝產(chǎn)物研究進(jìn)展

趙楠楠，石琳琳，羅娟，肖力爭

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，植物功能成分利用省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝作物基因資源評價利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙 410128）

冠突散囊菌（Eurotiumcristatum，E.C.）是茯磚茶加工“發(fā)花”過程的優(yōu)勢菌種，因其產(chǎn)生金黃色閉囊殼，也被稱為“金花”菌[1?2]。冠突散囊菌對營養(yǎng)要求較低，能夠在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）、察氏瓊脂培養(yǎng)基（czapek dox agar，CZG）和20%蔗糖察氏培養(yǎng)基（czapek dox agar，CZ20）中生長繁殖，是茯磚茶香氣物質(zhì)代謝的核心功能微生物，在茯磚茶獨(dú)特風(fēng)味的形成方面發(fā)揮重要作用[3?4]。此外，冠突散囊菌在茯磚茶“發(fā)花”過程中產(chǎn)生豐富的次級代謝物，這些次級代謝物與茶葉基質(zhì)發(fā)生復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，影響茯磚茶的品質(zhì)和生理功能，因此具有重要的研究價值[5?7]。目前對冠突散囊菌的研究大多集中于茯磚茶的化學(xué)成分和生理功效[8?12]，而單獨(dú)對冠突散囊菌的次級代謝產(chǎn)物及生物活性方面的研究較少。本文基于目前已有研究，對茯磚茶中冠突散囊菌的鑒定、次級代謝產(chǎn)物種類、生物活性和應(yīng)用前景進(jìn)行綜述，以期為深入應(yīng)用和挖掘冠突散囊菌的次級代謝產(chǎn)物提供參考。

1 冠突散囊菌的鑒定

1.1 冠突散囊菌的屬名鑒定

茯磚茶“金花”菌的屬名鑒定有較大分歧，其中以曲霉屬（Aspergillus）和散囊菌屬（Eurotium）為主。1941年，劉作易[13]根據(jù)分生孢子梗的分化情況，將“金花”菌歸入曲霉屬的灰綠曲霉類（Aspergillusglaucus）。胡建程等[14]也將“金花”菌鑒定為曲霉屬的灰綠曲霉類。直至1990年，齊祖同等[15]以有性生殖和無性生殖為依據(jù)，將“金花”菌有性型歸為散囊菌屬，無性型歸為曲霉屬。

1.2 冠突散囊菌的種名鑒定

冠突散囊菌種名鑒定與其屬名的形成密切相關(guān)。倉道平等[16]根據(jù)“金花”菌的子囊果和子囊孢子特征，將其種名鑒定為曲霉屬的謝瓦氏曲霉（Aspergillusche?valieri）。溫瓊英[17]研究發(fā)現(xiàn)，“金花”菌的子囊孢子凸面并不像謝瓦氏曲霉表面光滑，因此“金花”菌種名更改為冠突曲霉（Aspergilluscristatum）。齊祖同等[15]研究表明“金花”菌是一種能產(chǎn)生有性型（子囊孢子期）和無性型（分生孢子期）的真菌，將“金花”菌有性型命名為冠突散囊菌，無性型命名為針刺曲霉（Aspergillusspicu?losusBlaser）。

近年來，“金花”菌的分類研究取得了較大進(jìn)展，目前常用的技術(shù)包括18S rDNA、28S rDNA 序列分析及內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列鑒定。黃浩等[18?19]根據(jù)菌落形態(tài)特征和18S rDNA 序列分析，將“金花”菌鑒定為冠突散囊菌。王文濤[20]對我國茯磚茶的“金花”菌進(jìn)行系統(tǒng)分類，認(rèn)為茯磚茶中優(yōu)勢菌為冠突散囊菌，且產(chǎn)區(qū)影響優(yōu)勢菌的形態(tài)表現(xiàn)。孟令緣等[21]將涇陽茯磚茶中分離得到的26 株“金花”菌歸類為散囊屬，并將其確定為冠突散囊菌。茯磚茶中“金花”菌的鑒定結(jié)果見表1。

表1 茯磚茶中“金花”菌的鑒定結(jié)果Table 1 Identification of'Jinhua'fungi in Fuzhuan brick tea

2 冠突散囊菌的次級代謝產(chǎn)物

冠突散囊菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物（secondary me?tabolites，SMs）具有極強(qiáng)的生物活性，研究表明，冠突散囊菌能夠分泌4 類SMs，包括苯甲醛類衍生物、蒽醌類衍生物、二酮哌嗪吲哚生物堿類和其他類化合物。其中，苯甲醛類衍生物和蒽醌類衍生物均屬于聚酮類化合物，其核心結(jié)構(gòu)由聚酮合成酶催化合成。

2.1 苯甲醛類衍生物

金色灰綠曲霉素（auroglaucin，AG）和灰綠曲霉黃色素（flavoglaucin，F(xiàn)G）是散囊菌屬特有的次級代謝產(chǎn)物，均屬于苯甲醛類色素[22]。彭曉赟等[23]從冠突散囊菌的發(fā)酵液提取物中分離出4 個苯甲醛類化合物，其中FG、2?（2′，3?環(huán)氧基?1′，3′，5′?庚三烯基）?6?羥基?5?（3?甲基?2?丁烯基）苯甲醛、2?（3E，5E?庚二烯基）?3，6?二羥基?5?（3?甲基?2?丁烯基）苯甲醛均為黃色粉末狀，2?（2′，3?環(huán)氧基?1′，3′?庚二烯基）?6?羥基?5?（3?甲基?2?丁烯基）苯甲醛則為黃色油狀物。Shi 等[24]從不同品牌茯磚茶中分離出8 株冠突散囊菌，然后從冠突散囊菌中分離出6 個苯甲醛類衍生物，包括二氫牛黃素、異二氫牛黃素、2?（2′，3?環(huán)氧?1′，3′?庚二烯基）?6?羥基?5?（3?甲基?2?丁烯基）苯甲醛、FG、四氫牛黃素和2?（2′，3?環(huán)氧?1′，3′，5′?庚三烯基）?6?羥基?5?（3?甲基?2?丁烯基）苯甲醛。

2.2 蒽醌類衍生物

Anke 等[25?26]在散囊菌屬中首次發(fā)現(xiàn)蒽醌類色素物質(zhì)，通過質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）、紅外線（infrared ray，IR）、紫外光譜（ultraviolet，UV）分析將紫色色素命名為紫冠突素，鏈蠕孢素?8?甲醚命名為赤冠突素。此外，從冠突散囊菌菌絲中分離出9 個蒽醌類化合物，其中9，10?蒽醌類化合物有大黃素、大黃素?6?甲醚?9?蒽酮、紅灰青素、赤冠突素、大黃素?6?甲醚、大黃素?8?單甲醚、鏈蠕孢素；1，4?蒽醌類化合物有紫冠突素和異紫突素。Li等[27]通過高速逆流色譜法分離純化冠突散囊菌的次級代謝物，從冠突散囊菌的100 mg 粗乙酸乙酯提取物中得到6.1 mg 大黃素、5.6 mg 大黃酚和3.8 mg 大黃素甲醚。

2.3 二酮哌嗪吲哚生物堿類

二酮哌嗪吲哚生物堿類是冠突散囊菌的一種重要次級代謝產(chǎn)物，包括刺孢曲霉素（echinulin）、cristatu?min F、neoechinulin A、preechinulin 等。Zou 等[28]從冠突散囊菌的粗提物中分離出異戊烯基吲哚二酮哌嗪生物堿cristatumin F，以及4 種生物堿類echinulin、dehy?droechinulin、neoechinulin A 和variecolorin O。楊娟娟等[29]采用冠突散囊菌與金黃色葡萄球菌固體混合發(fā)酵培養(yǎng)，在其乙酸乙酯提取物中也鑒定出二酮哌嗪吲哚生物堿cristatumin F、echinulin、neoechinulin A 和pre?echinulin。Liu 等[30]從茯磚茶中的冠突散囊菌孢子中提取出一種新型的植物生物堿即二酮哌嗪二聚體生物堿eurocristatine。

2.4 其他類物質(zhì)

冠突散囊菌能夠產(chǎn)生許多其他類次級代謝產(chǎn)物，如聚酮類化合物、苯甲酸類、酚類和多糖等[31]。Guo等[32]研究發(fā)現(xiàn)，冠突散囊菌產(chǎn)生多種聚酮類化合物，其中包括檸檬酸葡糖苷、isodihydroauroglaucin、曲菌素等。從冠突散囊菌的發(fā)酵液中分離出對羥基苯甲酸和2 個酚類化合物即酪醇和苔黑酚[23]。Li 等[33]從冠突散囊菌菌絲中分離的多糖ECIP?1A，其主要成分是甘露糖、葡萄糖和半乳糖，摩爾比為4.00∶0.59∶4.58。王珊[34]從冠突散囊菌的乙酸乙酯提取液中鑒定出洛伐他汀，他汀類物質(zhì)能夠抑制羥甲基戊二酸輔酶A 還原酶活性并阻斷膽固醇合成。鄭欣欣[35]對冠突散囊菌黃色素兩次薄層分離發(fā)現(xiàn)，黃色素中含有官能團(tuán)O—H、C=O、C—O，可能為蒽醌類衍生物，含有官能團(tuán)O—H、C=O、C=C，可能為蒽醌雜環(huán)類物質(zhì)。黑色素是一種獨(dú)特的天然生物聚合物，主要通過酚類化合物氧化聚合形成[36?38]，具有抗氧化[39]、抗輻射[40]、抗癌癥[41]等作用。冠突散囊菌的胞外黑色素70 ℃以下耐熱性強(qiáng)、Mg2+、Zn2+、Fe3+均可增強(qiáng)其穩(wěn)定性[42]。

3 冠突散囊菌的次級代謝產(chǎn)物應(yīng)用前景

3.1 在食品方面的應(yīng)用前景

作為一種天然的微生物色素，冠突散囊菌黃色素抗氧化能力較強(qiáng)，總還原能力、DPPH 自由基清除力和紅細(xì)胞溶血抑制力均優(yōu)于維生素E[43]，可以將其作為改善食品營養(yǎng)和生理功能的食品添加劑。此外，冠突散囊菌的培養(yǎng)濾液含有多種抗菌成分，隨著培養(yǎng)濾液濃度的增加，黃曲霉的徑向生長和黃曲霉毒素B1 的產(chǎn)生明顯受到抑制，可能是由于冠突散囊菌的次級代謝產(chǎn)物引起[44]。由此推測，冠突散囊菌次級代謝物可能成為新的抑菌劑，用于食品保存以抑制細(xì)菌滋生和減少營養(yǎng)流失。冠突散囊菌在發(fā)酵麥麩過程中產(chǎn)生莫納可林K 的β?羥基酸代謝物（β?hydroxy acid metabo?lites of monacolin K，MKA），MKA 可抑制膽固醇生成的限速酶，用于治療總膽固醇、冠心病和動脈粥樣硬化等疾病，麥麩中DPPH 自由基、ABTS+自由基清除率和胰脂肪酶抑制率均隨MKA 的增加而顯著提高[45]。因此，冠突散囊菌可用作功能性食品的發(fā)酵劑。

3.2 在醫(yī)藥方面的應(yīng)用前景

冠突散囊菌的次級代謝產(chǎn)物具有豐富的生物活性，具體見表2。

表2 冠突散囊菌的次級代謝產(chǎn)物及其生物活性Table 2 Secondary metabolites and biological activities of Eurotium cristatum

苯甲醛衍生物在脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞中表現(xiàn)出較好的抗炎活性，其中2?6?H?5?B 是較有潛力的抗炎藥物先導(dǎo)物，其抗炎活性可能與激活磷酸腺苷活性蛋白酶（adenosine monophosphate?activated protein kinase，AMPK）通路相關(guān)[46]。FG 和其他苯甲醛類化合物對SF?268、MCF?7 和NCI?H460 腫瘤細(xì)胞具有良好的細(xì)胞抑制作用[23]。大黃素、大黃酚和大黃素甲醚對α?葡萄糖苷酶的活性有明顯抑制作用，并且有一定的降血糖效果[27]。生物堿Eurocristatine 是一種具有降血糖作用的次級代謝產(chǎn)物，可以考慮作為治療糖尿病及其并發(fā)癥的潛在候選藥物，但其降血糖機(jī)制有待進(jìn)一步探討[47]。生物堿cristatumin F 對DPPH 自由基表現(xiàn)出一定的清除作用，并對3T3L1 脂肪細(xì)胞有邊緣衰減作用[28]。冠突散囊菌菌絲體中提取的多糖ECIP?1A 表現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)活性，這可能與其低分子量特性和單糖組成密切相關(guān)，也可能通過免疫調(diào)節(jié)對人體產(chǎn)生一定的抗腫瘤作用[33]。胞外多糖ECP 能夠抑制紅白血病K562 細(xì)胞活性并調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，這也證實(shí)了胞外多糖在抗腫瘤和降脂方面的重要性[48]。苔黑酚對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有明顯的抑制作用，降異戊二烯和二酮哌嗪二聚體均能有效地抑制酵母菌、皮癬菌和葡萄球菌，并可作為治療痢疾和調(diào)節(jié)腸道菌群的藥物[23，49?50]。

4 總結(jié)和展望

隨著茶葉有效成分的深入研究，冠突散囊菌的次級代謝產(chǎn)物因高效的降血糖、抗炎、抑菌、抗腫瘤等生物活性逐漸被認(rèn)識和關(guān)注。冠突散囊菌的次級代謝產(chǎn)物在功能上協(xié)同發(fā)揮作用。例如，在抗菌活性方面，苔黑酚、降異戊二烯、二酮哌嗪二聚體對腸道致病菌表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制作用；在降血糖活性方面，大黃素、大黃素甲醚和生物堿Eurocristatine 具有明顯的降血糖能力；在抗腫瘤活性方面，胞外多糖和苯甲醛類衍生物對腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，同時多糖還具有免疫調(diào)節(jié)、降血脂和抗氧化的活性。因此，基于冠突散囊菌的次級代謝物多組分特征，在生物活性方面也表現(xiàn)出多功能性。

雖然冠突散囊菌的次級代謝產(chǎn)物具有較強(qiáng)的生物活性，但在利用方面仍存在一些局限性，如黃色素極不穩(wěn)定，胞外多糖的合成較為復(fù)雜，成本較高，一些活性物質(zhì)的作用機(jī)制尚不清楚。另外，冠突散囊菌的次級代謝產(chǎn)物在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用主要集中在細(xì)胞和動物基礎(chǔ)研究，在臨床醫(yī)學(xué)上的相關(guān)試劑還未見報道。近年來，茶葉中部分活性代謝物的產(chǎn)品轉(zhuǎn)化得到迅速發(fā)展，為冠突散囊菌的次級代謝產(chǎn)物開發(fā)和應(yīng)用奠定了良好基礎(chǔ)，同時也提示冠突散囊菌次級代謝產(chǎn)物的深入探索和產(chǎn)業(yè)化領(lǐng)域是今后需要進(jìn)一步研究的方向。