寬體金線蛭源維氏氣單胞菌的分離鑒定及其生物學(xué)特性分析

摘要：【目的】對引起湖北省荊州市太湖養(yǎng)殖基地寬體金線蛭急性死亡的病原菌進(jìn)行分離鑒定，并分析其生物學(xué)特性，為病害防治提供理論依據(jù)，促進(jìn)寬體金線蛭養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展?！痉椒ā繌幕疾掦w金線蛭病變組織中分離細(xì)菌并進(jìn)行人工感染試驗，通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性鑒定、16S rRNA序列分析、多位點序列分型（MLST）等方法確定其分類地位。同時，通過PCR檢測分離菌株的毒力基因和耐藥基因攜帶情況，采用紙片擴(kuò)散法測定其藥物敏感性，并進(jìn)行中藥抑菌試驗?！窘Y(jié)果】從患病的寬體金線蛭病變組織中分離到菌株W23，人工感染試驗結(jié)果表明分離菌株W23具有較高致病性，通過形態(tài)學(xué)觀察和生理生化特性鑒定初步判斷其為維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii），16S rRNA序列分析結(jié)果表明，分離菌株W23與維氏氣單胞菌參考菌株具有高度相似性，并在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹中與其聚為一支。毒力基因和耐藥基因檢測結(jié)果表明，分離菌株W23攜帶whiB3、Fla、Act、Lip、Aer、Ela共6種毒力基因和blaTEM、tetA、qnrS共3種耐藥基因。此外，分離菌株W23具有生物被膜形成能力，對數(shù)生長期為接種后5～9 h。藥敏試驗結(jié)果表明，分離菌株W23對多黏菌素B、四環(huán)素和氧氟沙星等10種抗生素敏感，對頭孢氨芐和復(fù)方新諾明2種抗生素中度敏感，對苯唑西林、青霉素和頭孢唑林等7種抗生素具有耐藥性。中藥抑菌試驗結(jié)果表明，烏梅、五倍子、五味子和蘇木對分離菌株W23有明顯抑制效果?！窘Y(jié)論】維氏氣單胞菌是引起湖北省荊州市太湖養(yǎng)殖基地寬體金線蛭急性死亡的病原菌，其攜帶6種毒力基因和3種耐藥基因，具有較高的致病性。在寬體金線蛭養(yǎng)殖過程中可選用烏梅、五倍子、五味子和蘇木對維氏氣單胞菌感染引起的疾病進(jìn)行防治。

關(guān)鍵詞：寬體金線蛭；維氏氣單胞菌；毒力基因；藥物治療；多位點序列分型

中圖分類號：S947.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2024）11-3474-13

Isolation， identification and biological characteristics of Aeromonas veronii from Whitmania pigra

ZHU Lin， QIN Xiao-man， LIU Feng， SU Ying-bing*

（College of Animal Science and Technology， Yangtze University， Jingzhou， Hubei 434023， China）

Abstract：【Objective】To isolate， identify and analyze the biological characteristics of the pathogenic bacteria causing acute death of Whitmania pigra in Taihu breeding base of Jingzhou， Hubei， which could provide theoretical basis for di-sease prevention and control of W. pigra and promote the healthy development of the breeding industry.【 Method】Patho‐genic bacteria were isolated and identified from diseased W. pigra. The classification status of the isolated bacteria was de‐termined through morphological observation， physiological and biochemical characteristics analysis， 16S rRNA sequence identification and multilocus sequence typing（ MLST）. PCR amplification was conducted to identify the presence of viru‐lence genes and drug resistance genes. Drug sensitivity tests were performed using the disk diffusion method to assess the drug resistance， and Chinese herbal medicines bacteriostatic test was conducted. 【Result】The results showed that the strain W23 isolated from the edematous parts of W. pigra had high pathogenicity in artificial infection test， and was identi‐fied as Aeromonas veronii through morphological observation and physiological and biochemical characteristics analysis. The 16S rRNA sequence identification results indicated that strain W23 had the highest similarity to Aeromonas veroniireference strain and clustered with it in the phylogenetic tree. Detection of virulence genes and drug resistance genes re‐vealed that strain W23 carried 6 virulence genes （whiB3， Fla， Act， Lip， Aer， Ela） and 3 drug resistance genes （bla‐TEM， tetA， qnrS）. The isolated strain W23 had biofilm formation ability， and the logarithmic growth period was 5-9 h af‐ter inoculation. Drug sensitivity tests showed that strain W23 was sensitive to 10 antibiotics， such as polymyxin B， tetra‐cycline and ofloxacin， moderately sensitive to cefalexin and compound sulfamethoxazole， but resistant to 7 antibiotics， including oxacillin， penicillin and cefazolin. The results of antibacterial test in traditional Chinese medicine showed that Prunus mume， Galla chinensis， Schisandra chinensis， Caesalpinia sappan had obvious inhibitory effects on the isolated strain W23.【 Conclusion】A. veronii is the pathogenic bacterium causing ascites disease in W. pigra in the Taihu breeding base in Jingzhou， Hubei. It carries 6 virulence genes and 3 drug resistance genes， it has high pathogenicity. In the process of W. pigra culture， P. mume， G. chinensis， S. chinensis， C. sappan can be used to prevent and control the disease caused by A. veronii infection.

Key words： Whitmania pigra； Aeromonas veronii； virulence genes； drug therapy； multilocus sequence typing

Foundation items： Youth Science Fund Project of National Natural Science Foundation of China（32002252）；Hubei Modern Agricultural Industry Technology System Projec（t 2021Z22023）

0 引言

【研究意義】寬體金線蛭（Whitmania pigra）又名馬蛭、寬身金線蛭和寬身螞蟥，隸屬于黃蛭科金線蛭屬，養(yǎng)殖分布范圍較廣（吳雷明等，2019）。寬體金線蛭是一種傳統(tǒng)中藥材，可用于治療血瘀閉經(jīng)和跌打損傷等疾病，而在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡及防止腫瘤轉(zhuǎn)移等潛力（喬丹等，2022）。然而，隨著環(huán)境污染和人為過度捕撈的加劇，寬體金線蛭的野生資源數(shù)量逐漸減少，人工養(yǎng)殖成為主要供應(yīng)來源。但在養(yǎng)殖過程中，寬體金線蛭常因各種疾病導(dǎo)致死亡，其中維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）引發(fā)的病害較為突出且傳染性強(qiáng)，若不及時控制，將引發(fā)大規(guī)模疫情，嚴(yán)重影響寬體金線蛭養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】氣單胞菌屬是一類革蘭氏陰性、兼性厭氧桿菌，廣泛分布于海水、淡水和土壤等自然環(huán)境中（王興麗等，2016）。作為條件致病菌，氣單胞菌能感染人類、陸生動物和魚類并引發(fā)多種疾病（Ran et al.，2018）。其中，維氏氣單胞菌是一種人畜共患的傳染病病原菌（康元環(huán)等，2018），能感染魚類、蝦類和龜類等水生動物，并導(dǎo)致腸炎、腹水和出血等癥狀（賈俊鵬等，2018）。近年來，維氏氣單胞菌在水產(chǎn)動物中引發(fā)的病害受到廣泛關(guān)注，大量研究報道了該菌對黃鱔（Monopterus albus）（陳紅蓮等，2014）、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）（王興麗等，2016）、臺灣泥鰍（Paramisgurnus dabrya‐nus ssp. Taiwan）（徐先棟等，2018）、紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus）（郭雷鋒，2022）、大口黑鱸（Microp‐terus salmoides）（雷寧等，2022）、草魚（Ctenopharyn‐godon idella）（元麗花，2022）等多種水產(chǎn)動物的致病性。除維氏氣單胞菌外，其他氣單胞菌屬細(xì)菌也對水產(chǎn)動物中具有致病性，異常嗜糖氣單胞菌（Aeromo‐nas allosaccharophila）被報道為寬體金線蛭的致病菌（邵貴燕，2023），熒光假單胞菌（Pseudomonas fluo‐rescens）（王淑嫻等，2022）、嗜水氣單胞菌（Aeromo‐nas hydrophila）（張曉君等，2006）等也是水產(chǎn)動物常見的致病菌。關(guān)于維氏氣單胞菌感染寬體金線蛭的報道較少，王海華等（2023）報道維氏氣單胞菌是引起寬體金線蛭水腫病的病原菌?！颈狙芯壳腥朦c】湖北省荊州市太湖養(yǎng)殖基地寬體金線蛭暴發(fā)疾病并出現(xiàn)急性死亡，疑似維氏氣單胞菌感染，而目前關(guān)于維氏氣單胞菌對寬體金線蛭致病性的研究鮮有報道，且對于不同養(yǎng)殖環(huán)境下菌株的毒力和藥物敏感性差異缺乏深入研究，特別是關(guān)于寬體金線蛭源維氏氣單胞菌的毒力基因和耐藥基因研究尚無報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】從患病寬體金線蛭病變組織中分離細(xì)菌并進(jìn)行人工感染試驗，通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性鑒定、16S rRNA序列分析、多位點序列分型（MLST）等方法確定其分類地位，進(jìn)行毒力基因檢測、耐藥基因檢測、藥敏試驗和中藥抑菌試驗，分析其生物學(xué)特性，為病害防治提供理論依據(jù)，促進(jìn)寬體金線蛭養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

患病寬體金線蛭樣本采集于湖北省荊州市太湖養(yǎng)殖基地。LB培養(yǎng)基購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；PCR Master Mix和DL2000 DNA Marker均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；革蘭氏染色試劑盒、藥敏紙片和細(xì)菌生化鑒定管均購自杭州濱和微生物試劑有限公司；18種中藥購自北京同仁堂股份有限公司。

主要儀器設(shè)備：SW-CJ-ID超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；Nexus PCR儀（Eppendorf公司）；SHZ-82全溫振蕩培養(yǎng)箱（北京海富達(dá)科技有限公司）；SPX-80恒溫培養(yǎng)箱（紹興市蘇珀儀器有限公司）。

1. 2 細(xì)菌分離與純化

用75%酒精對寬體金線蛭進(jìn)行體表消毒，無菌環(huán)境下進(jìn)行解剖，分別從患病寬體金線蛭的水腫、結(jié)節(jié)部位分離細(xì)菌，在LB培養(yǎng)基上28 ℃靜置培養(yǎng)12～24 h，挑取優(yōu)勢菌落重復(fù)劃線培養(yǎng)以獲得純化菌株，于-80 ℃用80%甘油保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 人工感染試驗

選取300條體表無損傷、經(jīng)檢測不攜帶相關(guān)病原菌的寬體金線蛭（體質(zhì)量5.0±0.8 g、體長9.00±0.67 cm）暫養(yǎng)2周，隨機(jī)分為5組，每組20條，設(shè)3個重復(fù)，放入直徑20 cm、高10 cm的玻璃水瓶內(nèi)。4個試驗組分別在寬體金線蛭背部肌肉注射1×108、1×107、1×106和1×105 CFU/mL分離菌株菌液，對照組注射0.9%生理鹽水，注射量均為每條0.1 mL，攻毒后連續(xù)觀察8 d，攻毒期間水溫保持在 28～30 ℃，不充氧不投喂（董靖等，2018）。待試驗組寬體金線蛭發(fā)病后與自然發(fā)病癥狀進(jìn)行對比，解剖并按1.2方法再次分離鑒定病原菌。采用GraphPad Prism 9.5.1繪制生存曲線。

1. 4 組織載菌量測定和組織切片制作

在進(jìn)行人工感染試驗2 d后，無菌采集1×108 CFU/mL菌液濃度試驗組5條寬體金線蛭的腸道和肌肉組織，將肌肉組織稱重后放入PBS中研磨，稀釋后涂布于LB固體培養(yǎng)基，統(tǒng)計菌落數(shù)并計算組織載菌量，組織載菌量=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)/組織重量。采集對照組5條寬體金線蛭的腸道和肌肉組織，與試驗組寬體金線蛭病變組織一起送至武漢賽維爾生物科技有限公司進(jìn)行切片制作。

1. 5 分離菌株鑒定

1. 5. 1 形態(tài)學(xué)觀察及革蘭氏染色 取分離菌株菌液進(jìn)行劃線培養(yǎng)，觀察單個菌落的大小、形狀、邊緣、質(zhì)地和透明度等形態(tài)特征。進(jìn)行革蘭氏染色后，用油鏡觀察。

1. 5. 2 生理生化特性鑒定 將分離菌株接種于細(xì)菌生化鑒定管中，28 ℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。

1. 5. 3 分子生物學(xué)鑒定 利用通用引物（表1）對分離菌株的16S rRNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將符合預(yù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物送至武漢擎科生物科技有限公司測序。利用BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）進(jìn)行序列比對分析。同時，從GenBank已公布的維氏氣單胞菌菌株序列中篩選與分離菌株序列具有較高相似性的序列，采用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1. 5. 4 MLST鑒定 參照Maiden等（1998）提出的MLST方法，根據(jù)Martino等（2011）報道的6個氣單胞菌屬管家基因gyrB、groL、gltA、metG、ppsA、recA引物（表1），對分離菌株基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物測序后上傳至PubMLST（https：//pubmlst.org/）獲取等位基因編號，以確定分離菌株的序列型（ST）；并采用GrapeTree分組聚類分析維氏氣單胞菌ST型與分離菌株ST型的進(jìn)化關(guān)系（張明洋等，2020）。

1. 6 毒力基因與耐藥基因檢測

1. 6. 1 毒力基因檢測 根據(jù)已報道的維氏氣單胞菌毒力基因引物（表1）（Sen and Rodgers，2004；Nawaz et al.，2010；Deng et al.，2014；Králová et al.，2016），采用PCR檢測Ast、Aer、Lip、Fla、Act、Ela、fbpC、kasB、fbpA、kasA、pup、whiB3共12種毒力基因。

1. 6. 2 耐藥基因檢測 設(shè)計β-內(nèi)酰胺類耐藥基因（blaTEM、blaCTX-M）、四環(huán)素類耐藥基因（tetA、tetC、tetM）、磺胺類耐藥基因（sul1）和喹諾酮類耐藥基因（qnrA、qnrS）引物（表1），采用PCR檢測8種耐藥基因。所有引物均委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 7 生物學(xué)特性測定

1. 7. 1 生物被膜形成能力測定 參照Wu等（2013）、項明源（2020）的方法進(jìn)行分離菌株生物被膜形成能力測定。將純化后的菌液培養(yǎng)至對數(shù)期，取200 μL菌液分別接種于4塊96孔微量滴定板中，置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃分別靜置培養(yǎng)12、24、36和48 h；棄去培養(yǎng)液，用無菌NaCl溶液洗滌3次除去殘留細(xì)菌，每孔加入200 μL 1%結(jié)晶紫染色液染色10 min；用NaCl溶液洗滌后，加入200 μL 33%乙酸，使用酶標(biāo)儀測定OD590 nm，設(shè)3次重復(fù)。結(jié)果判定以空白對照組測得的OD590 nm平均值作為生物被膜形成能力的臨界值（ODC），當(dāng)細(xì)菌OD590 nm≤ODC時，無生物被膜形成能力；當(dāng)ODClt;細(xì)菌OD590 nm≤2×ODC時，生物被膜形成能力較弱；當(dāng)細(xì)菌OD590 nmgt;2×ODC時，生物被膜形成能力強(qiáng)。

1. 7. 2 生長曲線測定 參照Dey等（2020）的方法，將純化后的分離菌株加入LB培養(yǎng)基，每1 h測定1次菌液的OD600 nm，連續(xù)測量20 h，設(shè)3次重復(fù)，取平均值，使用GraphPad Prism 9.5.1繪制生長曲線。

1. 7. 3 掃描電鏡觀察 樣品制備參照王維等（2022）的方法，使用掃描電鏡進(jìn)行觀察和采集圖像。

1. 8 藥敏試驗

參考Yang等（2019）的方法，采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗，將分離菌株均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基，然后將藥敏紙片按順序依次貼在培養(yǎng)基上。28 °C恒溫條件下培養(yǎng)24 h后，測量抑菌圈直徑。

1. 9 中藥抑菌試驗

1. 9. 1 中藥提取液制備 根據(jù)朱成科等（2018）、張桓橋等（2022）、侯天牧等（2023）、許瑞平等（2023）的研究結(jié)果，選取黃芩、黃柏、黃芪、板藍(lán)根、菝葜、金銀花、甘草、天葵子、蘇木、半枝蓮、烏梅、沙棘、訶子、地榆、黃連、五倍子、五味子和石榴皮共18種中藥，各取10 g搗碎，置于200 mL無菌蒸餾水中，浸泡過夜。大火煮沸后改用文火繼續(xù)煎煮2 h，使用300目尼龍篩網(wǎng)進(jìn)行過濾。將殘渣再次加入200 mL無菌蒸餾水中，按照相同方法煎煮并過濾。將2次過濾獲得的濾液混合并加熱濃縮至10 mL，得到濃度為1 g/mL的中藥提取液。將制備好的中藥提取液進(jìn)行滅菌處理，于4 °C保存?zhèn)溆茫◤埰较愕龋?023）。

1. 9. 2 抑菌圈試驗 采用抑菌圈法測定分離菌株對18種中藥的敏感性，抑菌圈直徑gt;15 mm為高度敏感，10 mmlt;抑菌圈直徑≤15 mm為中度敏感，0 mmlt;抑菌圈直徑≤10 mm為低度敏感，抑菌圈直徑=0 mm為不敏感。

1. 9. 3 最小抑菌濃度（MIC）測定 參考馬秀慧等（2018）的方法，采用二倍稀釋法進(jìn)行MIC測定，設(shè)3次重復(fù)，將菌液接種至含有中藥提取液的試管中，28 ℃培養(yǎng)18 h，以無細(xì)菌生長的最高稀釋倍數(shù)中藥提取液濃度作為MIC。

1. 9. 4 最小殺菌濃度（MBC）測定 根據(jù)MIC測定結(jié)果，從無細(xì)菌生長的試管中，吸取100 μL液體均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24 h，以菌落數(shù)不超過5個的最低中藥提取液濃度作為MBC（Naka‐mura et al.，2011）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 人工感染試驗結(jié)果

從患病的寬體金線蛭的病變組織中分離獲得1株菌株，命名為W23。在人工感染分離菌株W23后，試驗組寬體金線蛭多在2～5 d內(nèi)發(fā)病并死亡。其癥狀與自然發(fā)病的寬體金線高度相似，均表現(xiàn)為行動遲緩，對外界刺激反應(yīng)遲鈍，軀體末端或中部形成明顯的結(jié)節(jié)（圖1-A）；進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，患病寬體金線蛭軀體明顯水腫且色澤發(fā)白，體腔內(nèi)有大量積液（圖1-B）。隨著時間推移，結(jié)節(jié)逐漸壞死、僵硬，并擴(kuò)散至整個軀體。該病的發(fā)病率和死亡率均較高，且表現(xiàn)出一定的傳染性。連續(xù)觀察8 d，試驗組均出現(xiàn)發(fā)病，其中接種菌液濃度為1×108 CFU/mL的寬體金線蛭在感染后24 h開始出現(xiàn)死亡，2 d內(nèi)全部死亡（圖1-C）。相比之下，對照組寬體金線蛭在8 d觀察期內(nèi)均保持正常狀態(tài)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，寬體金線蛭的肌肉組織載菌量隨著接種菌液濃度的增大呈升高趨勢，其中在1×108 CFU/mL菌液濃度下，組織載菌量最高，顯著高于其他試驗組（Plt;0.05）（圖1-D）。

對健康寬體金線蛭和接種分離菌株W23的寬體金線蛭進(jìn)行肌肉及腸道組織切片觀察。結(jié)果顯示，健康寬體金線蛭腸道內(nèi)壁可見明顯紫色（圖2-A），患病寬體金線蛭的腸道黏膜層不完整，腸絨毛嚴(yán)重萎縮或脫落，腸道內(nèi)充血明顯，腸腔內(nèi)可見大量死亡細(xì)胞（圖2-B）。上述變化表明，細(xì)菌感染后寬體金線蛭腸道內(nèi)發(fā)生炎癥反應(yīng)，可能導(dǎo)致其消化吸收功能受損。觀察肌肉組織切片發(fā)現(xiàn)，健康寬體金線蛭肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞間界限清晰（圖2-C）；患病寬體金線蛭肌細(xì)胞呈明顯的藍(lán)紫色，較健康寬體金線蛭顏色更深，細(xì)胞排列分散、紊亂，細(xì)胞間隙明顯（圖2-D）。

2. 2 分離菌株鑒定結(jié)果

2. 2. 1 形態(tài)學(xué)觀察及革蘭氏染色結(jié)果 分離菌株W23的菌落形態(tài)為圓形，具有光滑濕潤的表面和整齊的邊緣，呈半透明的灰白色（圖3-A），革蘭氏染色結(jié)果為陰性（圖3-B）。

2. 2. 2 生理生化特性鑒定結(jié)果 生理生化特性鑒定結(jié)果（表2）顯示，分離菌株W23能利用葡萄糖，VP試驗、賴氨酸、精氨酸雙水解酶呈陽性，不能利用肌醇，與維氏氣單胞菌的生理生化特性一致。

2. 2. 3 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果 分離菌株W23的16S rRNA序列（GenBank登錄號：OR816105）長度為1470 bp（圖4-A）；BLAST比對結(jié)果顯示，分離菌株W23的16S rRNA序列與維氏氣單胞菌參考菌株（GenBank登錄號：KT964297.1）序列相似性為98%，進(jìn)一步構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果（圖4-B）顯示，分離菌株W23與該維氏氣單胞菌菌株聚為一支，親緣關(guān)系最近。

2. 2. 4 MLST鑒定結(jié)果 分離菌株W23的管家基因gyrB、groL、gltA、metG、ppsA、recA等位基因編號分別為729、668、357、741、646、379，其ST型為899。通過GrapeTree分組聚類分析發(fā)現(xiàn)，ST型為899的分離菌株W23與ST型為1985的維氏氣單胞菌聚為一支（圖4-C），表明二者親緣關(guān)系較近。

2. 3 毒力基因檢測結(jié)果

如圖5所示，分離菌株W23可檢測到whiB3、Fla、Act、Lip、Aer、Ela共6種維氏氣單胞菌毒力基因，表明分離菌株W23攜帶相關(guān)毒力因子。

2. 4 耐藥基因檢測結(jié)果

如圖6所示，分離菌株W23可檢測到blaTEM、tetA、qnrS共3種耐藥基因，表明分離菌株W23攜帶相關(guān)耐藥因子。

2. 5 生物學(xué)特性測定結(jié)果

進(jìn)行生物被膜形成能力測定發(fā)現(xiàn)，分離菌株W23在培養(yǎng)12 h后OD590 nm為0.430，而空白對照組OD590 nm為0.260，表明此時分離菌株W23生物被膜形成能力較弱，在培養(yǎng)24 h后，分離菌株W23的OD590 nm達(dá)頂峰，生物被膜形成能力強(qiáng)（圖7-A和圖7-B）。生長曲線（圖7-C）顯示，分離菌株W23在接種后5～9 h生長速度明顯加快，為對數(shù)生長期，隨后趨于平緩。采用掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，分離菌株W23為鈍圓形的短桿菌，部分菌體外部表面有凹痕且緊密相連（圖7-D）。

2. 6 藥敏試驗結(jié)果

藥敏試驗結(jié)果（表3）表明，分離菌株W23對多黏菌素 B、四環(huán)素、氧氟沙星、頭孢哌酮、卡那霉素、哌拉西林、頭孢他啶、頭孢曲松、萬古霉素和丁胺卡那10種抗生素敏感，占53%；對頭孢氨芐和復(fù)方新諾明2種抗生素中度敏感，占11%；對苯唑西林、青霉素、頭孢唑林、氨芐西林、慶大霉素、麥迪霉素和克林霉素7種抗生素具有耐藥性，占37%。

2. 7 中藥抑菌試驗結(jié)果

2. 7. 1 抑菌圈試驗結(jié)果 18種中藥對分離菌株W23的抑菌圈直徑測定結(jié)果如表4所示，分離菌株W23對烏梅高度敏感，抑菌圈直徑為17 mm；五倍子、蘇木和五味子3種中藥對分離菌株W23的抑制效果較好，抑菌圈直徑分別為15、12和11 mm，均為中度敏感；沙棘對分離菌株W23的抑制效果一般，抑菌圈直徑為8 mm；分離菌株W23對其余中藥不敏感。2. 7. 2 MIC測定結(jié)果 18種中藥的MIC測定結(jié)果如表5所示，烏梅和五倍子對分離菌株W23的抑制作用最強(qiáng)，MIC均為31.25 g/mL；石榴皮、地榆、訶子、蘇木、五味子和黃連次之，MIC均為62.50 g/mL；沙棘、半枝蓮和黃芩的MIC較低，均為250.00 g/mL；其余中藥的MIC均大于500.00 g/mL，無抑菌作用。2. 7. 3 MBC測定結(jié)果 18種中藥的MBC測定結(jié)果如表5所示，烏梅對分離菌株W23的抑制作用最強(qiáng)，MBC為31.25 g/mL；五倍子和石榴皮次之，MBC均為62.50 g/mL；地榆、訶子、蘇木、五味子和黃連的MBC較低，均為125.00 g/mL；其余中藥的MBC均大于500.00 g/mL，無抑菌作用。

3 討論

3. 1 寬體金線蛭源維氏氣單胞菌的分離鑒定

維氏氣單胞菌是一種人畜共患的傳染病病原菌，具有危害人體健康的潛在威脅。本研究中，患病寬體金線蛭臨床癥狀主要表現(xiàn)為軀體水腫、發(fā)白，體腔內(nèi)有大量積液；軀體末端或中部有結(jié)節(jié)，且逐漸壞死、僵硬并蔓延至整個軀體，疑似感染維氏氣單胞菌，從患病寬體金線蛭的病變組織中分離到菌株W23，通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性鑒定初步判定為維氏氣單胞菌，通過16S rRNA序列分析進(jìn)一步證實分離菌株W23是維氏氣單胞菌。經(jīng)MLST鑒定發(fā)現(xiàn)，分離菌株W23的ST型為899，根據(jù)PubMLST已發(fā)布的記錄，2016年從上海豬群首次分離到該ST型的維氏氣單胞菌菌株，本研究首次分離到ST型為899的寬體金線蛭源維氏氣單胞菌菌株。

3. 2 寬體金線蛭源維氏氣單胞菌的毒力與致病性

維氏氣單胞菌的致病能力與其攜帶的毒力因子緊密相關(guān)（楊超，2022）。本研究檢測到分離菌株W23攜帶whiB3、Fla、Act、Lip、Aer、Ela共6種毒力基因，這些毒力基因顯著提升了細(xì)菌的致病能力。其中，Aer基因被認(rèn)為是最關(guān)鍵的毒力基因之一，對維氏氣單胞菌的致病性起核心作用（Ran et al.，2018）。韓語等（2022）從泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）體內(nèi)分離出的20株維氏氣單胞菌中，Aer基因檢測陽性率高達(dá)100%，Aer基因與維氏氣單胞菌的致病性間存在密切關(guān)聯(lián)。王興麗等（2016）認(rèn)為，Aer基因可作為判斷維氏氣單胞菌是否具有致病性的關(guān)鍵標(biāo)志之一。此外，本研究中分離菌株W23感染的寬體金線蛭體表和身體各組織均有明顯病變，體腔內(nèi)有大量積液，嚴(yán)重個體呈透明狀，與王海華等（2023）的研究結(jié)果相似。通過對寬體金線蛭病理組織的觀察發(fā)現(xiàn)，腸道病變主要是腸絨毛脫落，腸道內(nèi)有充血現(xiàn)象，腸腔內(nèi)可見死亡細(xì)胞。病變肌肉組織中細(xì)胞排列分散、紊亂，細(xì)胞間隙較大。上述結(jié)果表明，分離菌株W23具有較高致病性。

3. 3 寬體金線蛭源維氏氣單胞菌的藥物敏感性

從不同物種和養(yǎng)殖環(huán)境中分離的維氏氣單胞菌對抗生素的耐藥性可能不同，雷寧等（2022）從浙江省湖州市大口黑鱸體內(nèi)分離的維氏氣單胞菌對頭孢曲松、氯霉素、氟苯尼考、強(qiáng)力霉素、復(fù)方新諾明、四環(huán)素和左氧氟沙星敏感。本研究結(jié)果表明，寬體金線蛭源維氏氣單胞菌對多黏菌素B、四環(huán)素、氧氟沙星、頭孢哌酮、卡那霉素、哌拉西林、頭孢他啶、頭孢曲松、萬古霉素和丁胺卡那10種抗生素敏感，對頭孢氨芐和復(fù)方新諾明2種抗生素中度敏感，對苯唑西林、青霉素、頭孢唑林、氨芐西林、慶大霉素、麥迪霉素和克林霉素7種抗生素具有耐藥性，與耿昕穎等（2015）的部分研究結(jié)果一致。僅有少數(shù)藥物在不同菌株間表現(xiàn)出相同的敏感性，菌株間的耐藥性差異可能與抗生素的使用歷史、用藥劑量、用藥頻率及養(yǎng)殖環(huán)境等多種因素有關(guān)。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，抗生素是治療細(xì)菌性疾病的常用藥物，但對抗生素的不當(dāng)使用可能導(dǎo)致細(xì)菌對藥物的敏感性降低甚至產(chǎn)生耐藥性（羅君等，2022）。

3. 4 中藥對寬體金線蛭源維氏氣單胞菌的抑制效果

中藥種類豐富，作為天然藥物，其含有多種抑制細(xì)菌繁殖的活性成分，中藥的抑菌效果受到大量學(xué)者關(guān)注，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中極具應(yīng)用潛力（陳嘉聲等，2023；勞錦程等，2023；陳希平，2024）。相較于抗生素，中藥具有不易產(chǎn)生耐藥性、無毒副作用、無殘留、不造成環(huán)境污染等優(yōu)勢（郭煥裕等，2022）。抑菌圈試驗結(jié)果表明，烏梅、五倍子、蘇木、五味子和沙棘5種中藥對維氏氣單胞菌具有抑制作用。因抑菌圈試驗對中藥抑菌能力的解釋力度稍顯不足，故綜合考慮抑菌圈直徑、MIC和MBC測定結(jié)果，篩選出抑菌效果較好的中藥為烏梅、五倍子、五味子和蘇木。本研究結(jié)果與王寶屯等（2021）的研究結(jié)果一致，但與許瑞平等（2023）研究中石榴皮和半枝蓮的抑菌效果不同?？赡苁歉鱾€地區(qū)中藥的有效成分及藥材的處理和提取方法存在差異，導(dǎo)致藥材對病原菌的抑制效果不同。

4 結(jié)論

維氏氣單胞菌是引起湖北省荊州市太湖養(yǎng)殖基地寬體金線蛭急性死亡的病原菌，其攜帶6種毒力基因（whiB3、Fla、Act、Lip、Aer、Ela）和3種耐藥基因（blaTEM、tetA、qnrS），具有較高的致病性。在寬體金線蛭養(yǎng)殖過程中可選用烏梅、五倍子、五味子和蘇木對維氏氣單胞菌感染引起的疾病進(jìn)行防治。

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（責(zé)任編輯 劉可丹）