芽孢桿菌Ya-1的定殖特性及其對辣椒根際細(xì)菌多樣性的影響

摘要：【目的】研究芽孢桿菌Ya-1（簡稱Ya-1）在辣椒根際、根和葉中的定殖特性及其對辣椒根際細(xì)菌多樣性的影響，為微生態(tài)調(diào)控防治辣椒枯萎病及芽孢桿菌的開發(fā)利用提供參考依據(jù)?！痉椒ā恳宰匀煌?蛭石（Ns）和滅菌土+蛭石（Ss）2組基質(zhì)盆栽辣椒為試驗材料，采用利福平標(biāo)記法，分別對2組基質(zhì)設(shè)接種無菌水（A）、接種抗200 μg/mL利福平的Ya-1突變株（Ya-1-200）發(fā)酵液（B）、接種辣椒枯萎病菌SMPLJLD-1孢子懸浮液（C）和接種Ya-1-200發(fā)酵液+辣椒枯萎病菌SMPLJLD-1孢子懸浮液（D）4個處理，接種后0、1、2、3、7、10和20 d，測定Ya-1在根際、根和葉片的定殖量的，并結(jié)合絕對定量PCR驗證Ya-1的定殖規(guī)律。同時利用高通量測序技術(shù)對接種0、10、20 d根際細(xì)菌多樣性及其群落結(jié)構(gòu)差異進(jìn)行比較分析?！窘Y(jié)果】稀釋分離法檢測Ya-1在辣椒植株及根際中的定殖情況結(jié)果顯示，接種3 d 后，B、D處理下根際和葉中Ya-1的定殖量逐漸下降，20 d后趨于穩(wěn)定，定殖量均大于1×104 CFU/g。絕對定量PCR檢測結(jié)果顯示，B、D處理后，辣椒根際、根和葉中Ya-1單位樣本拷貝數(shù)呈先增加后減少的變化趨勢，接種3 d后達(dá)到峰值，并在20 d后穩(wěn)定在1.0×105 copies/g以上?；诟咄繙y序分析結(jié)果顯示，Ns組接種10 d與接種20 d相比，B處理ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)顯著降低（Plt;0.05，下同），而C和D處理2個指數(shù)顯著升高。辣椒根際細(xì)菌群落中相對豐度大于4%的優(yōu)勢菌門包括放線菌門、酸桿菌門、擬桿菌門、綠彎菌門、芽單胞菌門和變形菌門。接種10 d時，C處理辣椒根際細(xì)菌群落中芽單胞菌門相對豐度最低（4.07%），B處理該菌門的相對豐度最高（6.77%）。與A處理相比，B處理在接種10和20 d時貪銅菌屬、Aquicella、Trinickia、Crenobacter、產(chǎn)堿桿菌屬、戴氏菌屬、假單胞菌屬、Pseudogulbenkiania、芽孢桿菌屬、羅河桿菌屬和Vogesella均明顯富集；接種10 d后，與A處理相比，B處理鞘氨醇單胞菌屬的相對豐度明顯升高，Gp6、假甲基桿菌屬的相對豐度明顯降低。【結(jié)論】Ya-1可在辣椒根際、根和葉中有效定殖，接種該菌后能改變辣椒根際細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)，提高辣椒根際中具有抗病促生和改善辣椒品質(zhì)等相關(guān)功能細(xì)菌的相對豐度。推測Ya-1具有開發(fā)應(yīng)用的

潛力。

關(guān)鍵詞：芽孢桿菌；利福平標(biāo)記；絕對定量PCR；定殖；根際細(xì)菌多樣性

中圖分類號：S641.306 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2024）11-3346-12

Colonization characteristics of Bacillus sp. Ya-1 and its effects on rhizosphere bacterial diversity of pepper

ZHAO Zhi-xiang， LI Dao-min， TAN Shi-meng， YAN Wan-rong， WANG Bao， XIAO Tong-bin*

（Institute of Plant Protection， Hainan Academy of Agricultural Sciences/Research Center for the Quality Safety and Standards of Agricultural Products， Hainan Academy of Agricultural Sciences/Hainan Key Laboratory for

Control of Plant Diseases and Insect Pests/Scientific Observation and Experiment Station of Crop Pests in Haikou， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Haikou， Hainan 571100， China）

Abstract：【Objective】To investigate the colonization characteristics of Bacillus sp. Ya-1 in rhizosphere，root and leaf of pepper and its effects on rhizosphere bacterial diversity，so as to provide reference for the control of pepper wilt disease by microecological regulation and the further development and utilization of Bacillus sp.【 Method】Natural soil + vermicu‐lite（ Ns） and sterilized soil + vermiculite（ Ss） matrix potted pepper were used as experimental materials. Using rifampi‐cin labeling method，the 2 groups of matrix were inoculated with sterile water（ A）， inoculated with Ya-1 mutant（ Ya-1-200） fermentation broth that was resistant to 200 μg/mL rifampicin（ B）， inoculated with spore suspension of pepper fu‐sarium wilt bacteria SMPLJLD-1（ C）， and inoculated with YA-1-200 fermentation broth + spore suspension of pepper fu‐sarium wilt bacteria SMPLJLD-1（ D）. At 0， 1， 2， 3， 7， 10 and 20 d after inoculation， the colonization amounts of Ya-1 in rhizosphere， root and leaf were determined， and the colonization rule of Ya-1 was verified by absolute quantitative PCR. At the same time， the diversity and community structure difference of rhizosphere bacteria at 0， 10 and 20 d after ino-culation were compared and analyzed by high-throughput sequencing technology.【 Result】The results of the detection of Ya-1 colonization in pepper plants and rhizosphere using rifampicin labeling method showed that after 3 d of inoculation，the colonization amount of Ya-1 in rhizosphere soil and leaves under treatments B and D gradually decreased， and tended to be stable after 20 d， and it was above the level of 1×104 CFU/g after 20 d. The results of absolute quantitative PCR showed that after B and D treatment， the copy number of Ya-1 unit samples in rhizosphere， root and leaf of pepper in‐creased first and then decreased， reached the peak after 3 d of inoculation， and stabilized above 1.0×105 copies/g after 20 d. Analysis based on high throughput sequencing showed that comparing with 10 and 20 d after inoculation in Ns group，ACE index and Chao1 index in B treatment were significantly decreased（ Plt;0.05， the same below）， while the 2 indexes in C and D treatments were significantly increased. The dominant bacterial phyla with relative abundances more than 4% in the rhizosphere of pepper included Actinobacteria，Acidobacteria，Bacteroidetes，Chloroflexi，Gemmatimonadetes and Proteobacteria. At 10 d after inoculation，the relative abundance of Gemmatimonadetes in the rhizosphere soil bacterial community of pepper was the lowest（ 4.07%） in treatment C，while it was the highest（ 6.77%） in treatment B. Compared with treatment A，treatment B showed obvious enrichment of Cupriavidus，Aquicella，Trinickia，Crenobacter，Alcaligenes，Devosia，Pseudomonas，Pseudogulbenkiania，Bacillus，Rhodobacter and Vogesella at 10 and 20 d after inoculation，after 10 d of inoculation， the relative abundance of Sphingomonas was greatly higher in treatment B than in treatment A， while the relative abundances of Gp6 and Methylobacillus were significantly decreased in treatment B. 【Conclusion】Ya-1 can colonize in the rhizosphere， root， and leaf of pepper， and can affect the Alpha diversity of pepper rhizosphere bacteria， increase the relative abundance of bacteria with disease resistance，growth promotion and quality improvement functions in the rhizosphere soil of pepper. It is speculated that Bacillus sp. Ya-1 has the potential for further development and appli‐cation.

Key words： Bacillus sp.； rifampicin marker； absolute quantitative PCR； colonization； rhizosphere bacteria diversity

Foundation items： High-level Talent Project of Hainan Natural Science Foundation（324RC537）； Hainan Provincial Scientific Research Institute Technology Research and Development Project（FW20230002）； Technical System Project of Winter Melon and Vegetable Industry in Hainan（HNARS-05-ZJ04）； Innovative Team Project of Hainan Academy of Agricultural Sciences（HAAS2023TDYD12）

0 引言

【研究意義】辣椒是我國產(chǎn)業(yè)規(guī)模最大的蔬菜作物（鄒學(xué)校等，2022），也是海南主要的冬種北運蔬菜之一，其種植面積占冬種瓜菜總面積的10%，產(chǎn)量占出島瓜菜總量的1/3，已成為海南地方經(jīng)濟(jì)發(fā)展的支柱產(chǎn)業(yè)（丁莉和劉海清，2018）。然而，隨著種植面積不斷擴(kuò)大，土地復(fù)種指數(shù)不斷提高，連作障礙日趨嚴(yán)重，導(dǎo)致土壤退化、土傳病害猖獗，嚴(yán)重影響辣椒產(chǎn)業(yè)的健康和可持續(xù)發(fā)展（王立浩等，2021）。由辣椒尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. capsici）侵染引起的枯萎病是辣椒生產(chǎn)上最常見的土傳病害之一（El-Abeid et al.，2020）。該病原菌為土壤習(xí)居菌，隱蔽性強(qiáng)，化學(xué)藥劑不能從根本上防治，且對生態(tài)環(huán)境和人畜健康產(chǎn)生不利影響（Gabrekiristo and Demiyo，2020）。因此，開發(fā)生物防治、微生態(tài)調(diào)控等環(huán)境友好型辣椒枯萎病防治技術(shù)，通過接種生防菌在根際定殖并調(diào)節(jié)微生物群落結(jié)構(gòu)，降低病原菌豐度，對微生態(tài)調(diào)控防治辣椒枯萎病及辣椒的清潔生產(chǎn)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】芽孢桿菌因其能夠防治多種土傳病原物而廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，定殖能力的檢測是判斷芽孢桿菌是否具有開發(fā)應(yīng)用潛力的前提。目前檢測的主要方法有綠色熒光標(biāo)記法（馮丹等，2022；祁山顏等，2023）和抗生素標(biāo)記法（王藝茹等，2024），二者均能對環(huán)境樣本中的原有菌株和標(biāo)記的生防芽孢桿菌進(jìn)行區(qū)分。其中，抗生素標(biāo)記法以操作簡單快捷，不改變菌株原有重要特性等優(yōu)點獲得廣泛應(yīng)用。王軍強(qiáng)等（2016）采用抗鏈霉素和利福平雙抗標(biāo)記法，測定海洋多黏類芽孢桿菌L -91在黃瓜根部及幼苗中的定殖情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌在根表土壤中的定殖量最高，且在黃瓜外根際、根際、根表土壤和黃瓜組織中的定殖動態(tài)基本一致。宋露洋等（2024）通過采用抗利福平標(biāo)記法，發(fā)現(xiàn)接種貝萊斯芽孢桿菌ZB36 28 d后能在苦瓜根、莖和葉組織中穩(wěn)定定殖，并對苦瓜枯萎病具有較好的防治效果。此外，謝強(qiáng)等（2022）、陳夢多等（2023）采用利福平標(biāo)記法分別研究了巨大芽孢桿菌Bm、多粘類芽孢桿菌HQ1-2在煙草根際、葉面和黃瓜根際的定殖規(guī)律。外源生防菌接種后在根際中有效定殖，對根際微生物產(chǎn)生積極影響，是評價該外源生防菌是否具有防治土傳病害開發(fā)潛力的關(guān)鍵指標(biāo)。根際微生物被認(rèn)為植物“第二基因組”，其群落結(jié)構(gòu)與植物生長密切相關(guān)（Li et al.，2019）。土傳病害暴發(fā)是根際微生物群落結(jié)構(gòu)失衡的結(jié)果（陳巧環(huán)等，2021）。根際微生物群落演替與植物免疫息息相關(guān)，也是土壤健康的重要評價指標(biāo)（Jiang et al.，2022）。相關(guān)研究表明，鐮刀菌侵染對辣椒根和莖微生物群落的影響大于果實。辣椒發(fā)病后，病土中貪噬菌屬（Variovorax）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizo‐bium）、假單胞菌屬（Pseudomonas）和鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）等降解自毒物質(zhì)的細(xì)菌丟失，并招募了Conexibacter、厭氧粘細(xì)菌屬（Anaeromyxobacter）、蛭弧菌屬（Bdellovibrio）、黃桿菌屬（Flavobacterium）和芽單胞菌屬（Gemmatimonas）等代謝小分子糖和酸的細(xì)菌（Wen et al.，2022）。余賢美等（2014）研究發(fā)現(xiàn)在棗樹根際中定殖枯草芽孢桿菌Bs-15能提高細(xì)菌和放線菌的多樣性指數(shù)和整體活性，說明外源益生菌的施入對提高根際細(xì)菌多樣性和降低病原物的豐度起至關(guān)重要的作用。Zhao等（2018）研究發(fā)現(xiàn)向根際中施入含解淀粉芽孢桿菌JDF35的生物有機(jī)肥不僅能調(diào)節(jié)土壤pH，提高有效氮、磷、鉀的濃度和土壤酶活性，還能提高根際細(xì)菌多樣性，降低根際真菌多樣性和鐮刀菌豐度，從而構(gòu)建對鐮刀菌具有抗病力的土壤生態(tài)環(huán)境；Luo等（2023）研究發(fā)現(xiàn)接種外源益生菌PSB06，能提高根際細(xì)菌Alpha多樣性，增加Nitrososphaera、單胞菌屬（Arenimonas）、藤黃色單胞菌屬（Luteimonas）、分枝乳桿菌屬（Ramli‐bacter）等物種豐度，降低土傳病原物豐度并促進(jìn)辣椒生長?！颈狙芯壳腥朦c】本課題組前期研究表明，芽孢桿菌Ya-1對生姜青枯病菌和辣椒枯萎病菌等均具有較強(qiáng)的抑制效果。在對生姜青枯病菌的室內(nèi)平板拮抗測試中，接種48 h后，平均抑菌圈直徑為23 mm（趙志祥等，2015）；在對辣椒枯萎病的盆栽防效評價中，接種芽孢桿菌Ya-1 20 d后，對辣椒枯萎病的防病效果高達(dá)77.26%，且根際真菌多樣性和枯萎病菌的豐度均發(fā)生改變（趙志祥等，2023）。但有關(guān)芽孢桿菌Ya-1定殖規(guī)律及對根際細(xì)菌多樣性的具體影響機(jī)制尚不清楚，且針對該菌不同時間段的定殖量和引起優(yōu)勢細(xì)菌種屬的豐度變化尚未見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以盆栽辣椒為研究對象，采用利福平標(biāo)記法和絕對定量PCR研究芽孢桿菌Ya-1在辣椒根際、根和葉中的定殖規(guī)律，并結(jié)合利用高通量測序分析技術(shù)研究該菌對辣椒根際細(xì)菌多樣性的影響，為微生態(tài)調(diào)控防治辣椒枯萎病及芽孢桿菌的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試芽孢桿菌為Bacillus sp. Ya-1，簡稱Ya-1，由海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所保存提供。供試?yán)苯房菸【隇镕usarium oxysporum SMPLJLD-1，簡稱SMPLJLD-1，由本課題組分離、純化并保存。供試?yán)苯菲贩N為乾隆大椒，種子購自海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所。主要試劑：磁珠法土壤 amp; 糞便基因組DNA抽提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；FastDNA? Spin Kit for Soil試劑盒購自美國Mpbio公司。主要儀器設(shè)備：Qubit 4.0熒光計購自美國ABI公司。

1. 2 試驗方法

辣椒種子經(jīng)5%次氯酸鈉溶液表面消毒10 min后，無菌水沖洗3～4次，置于無菌培養(yǎng)皿中保濕催芽3～5 d，播種于營養(yǎng)缽，栽培基質(zhì)為土壤和蛭石，二者體積比為8∶2。其中，土壤分為自然土和滅菌土，均采自大田中健康辣椒根際和根圍0～25 cm處，采集后過80目篩。每缽播種2顆辣椒種子，待苗長至4葉1心時接種備用。

1. 2. 1 利福平標(biāo)記 首先將Ya-1在LB固體培養(yǎng)基上劃線，31 ℃過夜培養(yǎng)，挑單菌落轉(zhuǎn)入含5 μg/mL利福平的LB液體培養(yǎng)基，31 ℃下200 r/min搖菌培養(yǎng)24 h后，在含利福平5 μg/mL的LB培養(yǎng)基上劃線，31 ℃過夜培養(yǎng)，挑單菌落轉(zhuǎn)入含10 μg/mL利福平LB液體培養(yǎng)基，31 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h。重復(fù)上述過程直到標(biāo)記出抗利福平200 μg/mL的突變株，命名Ya-1-200，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 2 Ya-1發(fā)酵液及SMPLJLD-1孢子懸浮液制備 將Ya-1-200在含200 μg/mL利福平的LB固體培養(yǎng)基上劃線，31 ℃過夜培養(yǎng)。挑單菌落接種于含相應(yīng)濃度利福平的LB液體培養(yǎng)基中，31 ℃下200 r/min培養(yǎng)48～72 h，用含相應(yīng)濃度利福平的LB液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)OD600 nm為0.6～0.8或菌懸體濃度為1×107 CFU/mL，即制得利福平標(biāo)記的Ya-1-200發(fā)酵液，備用。另挑辣椒枯萎病菌SMPLJLD-1菌絲塊接種于PDA培養(yǎng)基，28 ℃下倒置培養(yǎng)7～10 d，打菌餅接種于PDA液體培養(yǎng)基，28 ℃下180 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，鏡檢，并用無菌PDA液體培養(yǎng)基調(diào)整孢子懸浮液濃度為1×107孢子/mL，備用。

1. 2. 3 接種及樣品采集 分自然土+蛭石（Ns）和滅菌土+蛭石（Ss）兩組盆栽辣椒。每組分別設(shè)接種無菌水（A）、接種Ya-1-200發(fā)酵液（B）、接種辣椒枯萎病菌SMPLJLD-1孢子懸浮液（C）和接種Ya-1-200發(fā)酵液+辣椒枯萎病菌SMPLJLD-1孢子懸浮液（D）共4個處理，每處理3次重復(fù)，接種方法參考趙志祥等（2023）的方法。ANs、BNs、CNs、DNs分別代表自然土+蛭石盆栽辣椒下A、B、C、D處理，ASs、BSs、CSs、DSs分別代表滅菌土+蛭石盆栽辣椒下A、B、C、D處理。分別于接種前（0 d）和接種后1、2、3、7、10、20 d采集辣椒根際、根和葉樣本，每樣本采集1.0 g。另BNs和DNs在上述時間段的土壤樣品均重復(fù)采集1.0 g，用于基因組DNA提取和絕對定量PCR檢測。1. 2. 4 稀釋分離法測定Ya-1的定殖情況 將BNs、DNs和BSs、DSs處理的根際、根和葉樣品分別加入滅菌研缽中，加入10 mL PBS緩沖液（pH 7.0），研磨3～5 min后，轉(zhuǎn)入250 mL三角瓶中，另取90 mL上述PBS緩沖液，沖洗研缽并轉(zhuǎn)入相對應(yīng)的三角瓶中，31 ℃下200 r/min振蕩培養(yǎng)30 min，取100 μL上述各懸浮液，補(bǔ)足無菌水至1 mL，混勻，得到10-3樣本懸浮液。重復(fù)上述過程，依次得到10-4、10-5樣本懸浮液。取各懸浮液100 μL，均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基（含終濃度為200 μg/mL的利福平），31 ℃下培養(yǎng)48 h，各樣本和各濃度梯度重復(fù)3次，以僅涂布無菌水為對照，觀察并記錄各培養(yǎng)基菌落數(shù)量。

1. 2. 5 絕對定量PCR檢測Ya-1的定殖情況 首先，按照磁珠法土壤 amp; 糞便基因組DNA提取試劑盒說明，提取BNs和DNs處理0、1、3、7、10和20 d的根際、根和葉基因組總DNA。取2 μL各DNA樣本，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分析條帶亮度和雜質(zhì)污染程度。然后，根據(jù)高通量測序結(jié)果，Ya-1部分序列為OTU_567，設(shè)計引物OTU_567-F和OTU_567-R進(jìn)行絕對定量PCR并統(tǒng)計單位樣本拷貝數(shù)，經(jīng)Ste‐pOne Software和BioRadCFXmanager分析，明確各樣本中Ya-1的定殖能力。引物信息見表1。

1. 2. 6 根際基因組DNA提取和高通量測序 收集Ns接種0、10、20 d的根際樣本各1.0 g，用FastDNA? Spin Kit for Soil試劑盒提純根際總DNA，以DNA為模板，采用16S rDNA的V3～V4區(qū)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增（Guo et al.，2018）。反應(yīng)體系50.0 μL：2×Taq Mas‐terMix 25.0 μL，10 μmol/L 上、下游引物各2.0 μL，1.0 μg/μL DNA模板1.0 μL，ddH2O補(bǔ)足至50.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，進(jìn)行34個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。12 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物采用Qubit 4.0熒光計定量并完成建庫。檢測合格的文庫送武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司HiSeq/Miseq平臺進(jìn)行PE250測序。

1. 3 統(tǒng)計分析

測序數(shù)據(jù)經(jīng)Tags拼接、Tags過濾和嵌合體去除，最終得到有效序列（Effective tags）后再開展操作分類單元（OTU）聚類等分析（Yan et al.，2013）。采用Uparse算法基于97%相似性將有效序列聚類為OTUs，并計算各樣品中每個OTU的絕對豐度和相對信息（Edgar，2013）。在RDP Classifier中，使用Silva嵌合體數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋，得到OTU代表序列門水平和屬水平上的物種分類信息。為方便計算Alpha多樣性指數(shù)，將各樣本OTU豐度抽平到統(tǒng)一值（OTU豐度最低值），并計算門優(yōu)勢種群的相對豐度。將抽平后的OTU計算Alpha多樣性指數(shù)，包括Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)等。

采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性分析；使用Excel 2007制圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 稀釋分離法檢測Ya-1在辣椒根際、根和葉中的定殖量

由圖1可知，接種0 d所有處理均未檢測出Ya-1，說明基質(zhì)中本身不含Ya-1。接種1 d時，BNs、DNs、BSs和DSs處理下，根際和根均能檢測出Ya-1定殖量，并隨著接種時間的延長，定殖量呈逐漸升高后逐漸降低的變化趨勢。BSs處理根中Ya-1的定殖量在接種2 d時達(dá)到峰值，為6.11×105 CFU/g；BNs、DNs和DSs處理根中Ya-1定殖量均在接種第3 d時達(dá)到峰值，分別為4.53×105、4.27×105和5.03×105 CFU/g。BNs、DNs、BSs和DSs處理下根際中Ya-1定殖量在接種第3 d時達(dá)到最大值，分別為7.22×105、5.64×105、8.46×105和6.29×105 CFU/g；而葉片中接種第3 d才能檢測出Ya-1，且此時該菌定殖量為峰值，分別為3.68×105、3.40×105、4.52×105、4.13×105 CFU/g。3 d后，4個處理下根際和葉中Ya-1的定殖量逐漸下降，20 d后趨于穩(wěn)定，定殖量均大于1×104 CFU/g。除BSs處理外，同一處理、同一接種時間下Ya-1定殖量排序為根際gt;根gt;葉。

2. 2 絕對定量PCR檢測辣椒根際、根和葉中Ya-1單位樣本拷貝數(shù)

2. 2. 1 BNs處理 如圖2所示，辣椒根際、根和葉在BNs處理下，樣本中Ya-1單位樣本拷貝數(shù)隨接種時間增加呈先增加后減少的變化趨勢，接種3 d后達(dá)到峰值，并在接種20 d穩(wěn)定在1.0×105 copies/g以上。辣椒根際、根和葉中Ya-1單位樣本拷貝數(shù)在接種3 d后分別為19.0×106、4.8×106和1.2×106 copies/g，接種20 d后降低至5.4×106、2.0×106和0.3×106 copies/g。此外，同一接種時間下Ya-1單位樣本拷貝數(shù)排序均為根際gt;根gt;葉。說明Ya-1能在辣椒根際、根和葉中有效定殖，且定殖量呈先增加后減少的變化趨勢，接種3 d后達(dá)到最大值，20 d后趨于穩(wěn)定。

2. 2. 2 DNs處理 通過絕對定量PCR檢測結(jié)果（圖3）可知，辣椒根際、根和葉經(jīng)D處理0 d時，單位樣本拷貝數(shù)為0；辣椒根際和根中Ya-1單位樣本拷貝數(shù)在接種1 d時開始增加，接種3 d時增加至峰值，分別為15.0×106和2.4×106 copies/g；葉中Ya-1樣本拷貝數(shù)在接種3 d時才能檢測到，且為不同接種天數(shù)下葉中Ya-1位樣本拷貝數(shù)的峰值。辣椒根、葉及根際中Ya-1單位樣本拷貝數(shù)于接種20 d后趨于穩(wěn)定，此時根際、根和葉片中Ya-1單位樣本拷貝數(shù)分別為3.7×106、1.3×106和0.1×106 copies/g。同一接種時間下Ya-1單位樣本拷貝數(shù)排序均為根際gt;根gt;葉。說明DNs處理下，Ya-1也可在辣椒根際、根部和葉片中有效定殖。2. 3 不同處理對Ns組辣椒根際細(xì)菌多樣性及其群落結(jié)構(gòu)的影響

2. 3. 1 根際細(xì)菌測序結(jié)果 由圖4可知，Ns組接種前共得到714214條原始序列，A、B、C、D處理10 d的辣椒根際樣本中共獲得563853～718414條原始序列，處理20 d的辣椒根際樣本中共獲得555290～709216條原始序列。去除沒有重疊（Overlap）的讀長（Reads）和未通過Tag過濾的Tags以及嵌合體序列，最終獲得502029～671963條有效序列，序列長度為251～491 bp，平均序列長458.12 bp，各樣本覆蓋率均大于99%，表明樣本中細(xì)菌16S rDNA序列檢出概率高，該高通量測序能真實反映細(xì)菌群落多樣性。根據(jù)97%序列相似性分類水平，對有效序列進(jìn)行分類，共得到91883個細(xì)菌OTUs，歸類到57門128綱206目403科880屬1670種。

2. 3. 2 不同處理下辣椒根際細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)

由圖5可知，A、B、C、D處理下根際細(xì)菌群落的ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)在接種0～20 d的變化趨勢不同。接種0～20 d時，A處理下ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)逐漸下降，B處理下2個指數(shù)均呈先升高后降低的變化趨勢，C和D處理下2個指數(shù)均呈先降低后升高的變化趨勢。與接種10 d相比，接種20 d B處理下ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)顯著降低（Plt;0.05，下同），而C和

D處理下2個指數(shù)均顯著升高。

與A處理相比，B處理10 d時辣椒根際細(xì)菌的ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)顯著增加；B處理20 d時根際細(xì)菌ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)無顯著變化（Pgt;0.05，下同）；C和D處理10 d時辣椒根際細(xì)菌的ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)顯著降低，20 d時，C和D處理下的2個指數(shù)顯著增加。處理10和20 d D處理下ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)雖較C處理有所提高，但未達(dá)到顯著水平。2. 3. 3 門分類水平上不同處理對辣椒根際細(xì)菌群落組成的影響 由圖6可知，辣椒根際細(xì)菌群落中相對豐度大于4%的優(yōu)勢菌門包括放線菌門（Acti‐nobacterioa）、酸桿菌門（Acidobacterioa）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）和變形菌門（Proteobacteria）。變形菌門、酸桿菌門和芽單胞菌門在所有處理中均屬于優(yōu)勢菌群。接種10和20 d時，A處理下變形菌門的相對豐度為4個處理中最低，其中接種10 d時該菌的相對豐度為 41.97%，接種20 d時為47.95%，D處理下變形菌門的相對豐度最高，接種10 d該菌門的相對豐度為54.08%，接種20 d為53.05%。A處理下辣椒根際細(xì)菌群落中酸桿菌門的相對豐度最高，其中接種10 d該菌門的相對豐度為18.04%，接種20 d為16.15%。D處理下酸桿菌門的相對豐度最低，接種10 d時該菌門的相對豐度為12.08%，接種20 d為10.98%。C處理10 d時辣椒根際細(xì)菌群落中芽單胞菌門相對豐度最低（4.07%），B處理該菌門的相對豐度最高（6.77%）；接種20 d時，B處理芽單胞菌門的相對豐度最低（5.38%），A處理該菌門的相對豐度最高（5.73%）。與C處理相比，D處理10 d時明顯提高了變形菌門、放線菌門和芽單胞菌門的相對豐度，降低了酸桿菌門和綠彎菌門的相對豐度；D處理20 d時明顯提高了變形菌門、擬桿菌門和放線菌門的相對豐度，降低了酸桿菌門、綠彎菌門和芽

單胞菌門的相對豐度。

在屬分類水平上，利用Lefse對屬分類水平上不同處理下辣椒根際細(xì)菌群落優(yōu)勢屬富集情況進(jìn)行分析，由圖7可知，與A處理相比，B處理10和20 d時貪銅菌屬（Cupriavidus）、Aquicella、Trinickia、Creno‐bacter、產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）、戴氏菌屬（Dyella）、假單胞菌屬、Pseudogulbenkiania、芽孢桿菌屬、羅河桿菌屬（Rhodanobacter）和Vogesella均明顯富集；與C處理相比，D處理10和20 d 時Trinickia、Creno‐bacter、產(chǎn)堿桿菌屬、戴氏菌屬、假單胞菌屬、Pseu‐dogulbenkiania、羅爾斯通菌屬（Ralstonia）、芽孢桿菌屬和Vogesella均明顯富集。

對不同處理下辣椒根際細(xì)菌群落10個優(yōu)勢細(xì)菌屬的相對豐度進(jìn)行分析，結(jié)果（圖8）表明，不同處理間優(yōu)勢菌屬群落發(fā)生明顯差異。接種10 d時，與A處理相比，B處理鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）的相對豐度明顯升高，Gp6、假甲基桿菌屬（Pseudo‐methylobacillus）的相對豐度顯著降低；C處理Sac‐charibacteria genera incertae sedis的相對豐度顯著升高，Gp1、Gp3、Gp6的相對豐度顯著降低。接種10 d后，與C處理相比，D處理下假甲基桿菌屬的相對豐度顯著降低。接種20 d時，與A處理相比，B處理下10個優(yōu)勢菌屬無顯著差異；C處理假甲基桿菌屬的相對豐度顯著升高。與C處理相比，D處理假甲基桿菌屬的相對豐度顯著降低。

3 討論

細(xì)菌定殖對建立植物—細(xì)菌相互作用至關(guān)重要，而此相互作用是決定植物健康及其生產(chǎn)力的關(guān)鍵因素（Knights et al.，2021）。對生防細(xì)菌而言，其定殖能力的強(qiáng)弱與抵御病原菌侵染和促進(jìn)植物健康生長呈正相關(guān)（Zou et al.，2023）。定殖不僅發(fā)生在植物根際，也可定殖在植物的根、莖、葉和果實等組織中。余賢美等（2014）研究發(fā)現(xiàn)接種枯草芽孢桿菌Bs-15 28 d后，在棗樹根際中的定殖量達(dá)104 CFU/g以上；李健等（2021）研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌L1-21可在柑橘葉片和果實中定殖，且對果實綠霉病有較好的防治效果。本研究通過利福平標(biāo)記法和絕對定量PCR驗證了Ya-1的定殖能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ya-1能在辣椒根際、根和葉中有效定殖，且在自然土和滅菌土條件下，定殖趨勢均呈先增加后減少的變化規(guī)律，Ya-1數(shù)量整體上在3 d 時達(dá)到峰值，20 d 后趨于平穩(wěn)，并維持在1×104 CFU/g水平。絕對定量PCR法檢測辣椒植株及根際中Ya-1定殖規(guī)律與利福平標(biāo)記法一致。3 d 后單位樣本拷貝數(shù)增加到峰值，20 d后趨于穩(wěn)定，并維持在1.0×105 copies/g水平。2種方法均證實Ya-1能夠定殖在辣椒根際、根和葉中，且定殖量能維持在較高水平，具有開發(fā)利用的潛力。然而，單位樣本拷貝數(shù)因操作誤差，統(tǒng)計誤差導(dǎo)致結(jié)果與菌落數(shù)并不相等，此外，樣本DNA濃度，標(biāo)準(zhǔn)品制作，定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的差異，也會導(dǎo)致單位樣本拷貝數(shù)和菌落數(shù)不一致。

細(xì)菌—細(xì)菌相互作用普遍存在于根際，通過代謝交換、分泌抗菌化合物等影響細(xì)菌的持久性和根際定殖，并形成特定的根際微生物群（Knights et al.，2021）。根際微生物群通過各種機(jī)制對植物健康和生產(chǎn)力產(chǎn)生積極影響，包括增強(qiáng)養(yǎng)分獲取、啟動植物防御和控制植物病原體（Trivedi et al.，2020）。近年，宏基因組研究表明大量微生物棲息于不同根生態(tài)位，且細(xì)菌是根際微生物群中最普遍的存在（Uroz et al.，2010）。

本研究自然土+蛭石組中，接種Ya-1-200發(fā)酵液在前10 d時辣椒根際細(xì)菌的ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)較接種無菌水顯著增加，接種20 d也有所增加，但未達(dá)到顯著水平；接種辣椒枯萎病菌SMPLJLD-1孢子懸浮液和Ya-1-200發(fā)酵液+辣椒枯萎病菌SMPLJLD-1孢子懸浮液處理在接種10 d辣椒根際細(xì)菌的ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)顯著降低，接種20 d時，2個處理下根際細(xì)菌ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)顯著增加。說明隨著接種天數(shù)增加，接種Ya-1-200發(fā)酵液和Ya-1-200發(fā)酵液+辣椒枯萎病菌SMPLJLD-1孢子懸浮液根際細(xì)菌多樣性增加；接種辣椒枯萎病菌SMPLJLD-1孢子懸浮液則顯著降低了根際細(xì)菌Alpha多樣性。

盡管土壤中細(xì)菌種類繁多，但放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門細(xì)菌是根際微生物主要組成（Uroz et al.，2010）。然而，植物由于受多種生物和非生物脅迫，導(dǎo)致根際微生物在屬分類和種分類水平上的分類組成差異很大（Tkacz et al.，2020）。本研究中，各處理辣椒根際優(yōu)勢細(xì)菌為酸桿菌門、放線菌門、擬桿菌門、綠彎菌門、芽單胞菌門和變形菌門。接種后10和20 d時，與接種無菌水相比，接種Ya-1-200發(fā)酵液+辣椒枯萎病菌SMPLJLD-1孢子懸浮液處理變形菌門的相對豐度明顯提高，而酸桿菌門相對豐度明顯降低。在接種后10 d時，與接種辣椒枯萎病菌SMPLJLD-1孢子懸浮液相比，接種Ya-1-200發(fā)酵液處理下芽單胞菌門相對豐度明顯增加；20 d時，接種Ya-1（B）組芽單胞菌門的相對豐度最低。與接種辣椒枯萎病菌SMPLJLD-1孢子懸浮液相比，接種Ya-1-200發(fā)酵液+辣椒枯萎病菌SMPLJLD-1孢子懸浮液在10 d時變形菌門、擬桿菌門、放線菌門和芽單胞菌門的相對豐度均明顯提高，酸桿菌門和綠彎菌門的相對豐度則降低；20 d時變形菌門、擬桿菌門和放線菌門相對豐度均明顯提高，酸桿菌門、綠彎菌門和芽單胞菌門的相對豐度則降低，與張慧等（2021）用草假單胞菌HT1處理蠶豆根部，結(jié)果發(fā)現(xiàn)厚壁菌門、放線菌門、擬桿菌門和變形菌門的相對豐度顯著提高的研究結(jié)果基本一致。Lee等（2021）研究發(fā)現(xiàn)放線菌門、厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門與植物土傳病害生物防治相關(guān)。本研究接種Ya-1改變了根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，推測接種該菌能提高抗辣椒枯萎病的能力。

本研究中與接種無菌水相比，接種Ya-1-200發(fā)酵液在接種10和20 d時貪銅菌屬、Aquicella、Trinickia、Crenobacter、產(chǎn)堿桿菌屬、戴氏菌屬、假單胞菌屬、Pseudogulbenkiania、芽孢桿菌屬、羅河桿菌屬和Vogesella均明顯富集；研究表明，芽孢桿菌屬（李健等，2021）、假單胞菌屬（張慧等，2021）、產(chǎn)堿桿菌屬（麥靖雯等，2018）和鞘氨醇單胞菌屬（Matsumoto et al.，2021）等均與植物抗病促生相關(guān)，是組成植物根圍促生細(xì)菌的主要類群。Vogesella是水稻土中的主要菌群，可以降解苯、甲苯、五氯酚、DDT等多種有機(jī)污染物，減少有機(jī)污染物被植物吸收，提高農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全（牟山，2017）。本研究中，接種Ya-1-200發(fā)酵液Vogesella相對豐度較高，推測與海南稻—菜輪作耕作模式有關(guān)。盆栽試驗土樣采自于田間種植過水稻的土壤，其中Vogesella得到富集，而接種Ya-1-200發(fā)酵液后，Vogesella進(jìn)一步在根際發(fā)揮益生菌的作用。

4 結(jié)論

Ya-1能在辣椒根際、根和葉中有效定殖，接種該菌后能改變辣椒根際細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)，提高辣椒根際中具有抗病促生和改善辣椒品質(zhì)等相關(guān)功能細(xì)菌的相對豐度。推測Ya-1具有開發(fā)應(yīng)用的潛力。

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（責(zé)任編輯 李洪艷）