植物根部內(nèi)生細(xì)菌多樣性及其生防作用研究進(jìn)展

曹焜+王曉楠+孫宇峰+李振偉+潘冬梅+趙越

摘 要：植物內(nèi)生細(xì)菌廣泛存在于植物的根、莖、葉、花、果實(shí)、種子等組織器官中，研究植物內(nèi)生細(xì)菌多樣性在物種資源開發(fā)與利用等方面具有重要意義，近年來內(nèi)生細(xì)菌的作用逐漸受到科研工作者的重視。本文針對(duì)植物根部內(nèi)生細(xì)菌多樣性、定殖過程及其生防作用等幾方面進(jìn)行綜述，旨在深入了解植物根部內(nèi)生細(xì)菌資源，為植物內(nèi)生菌資源開發(fā)利用提供參考。

關(guān)鍵詞：根；內(nèi)生細(xì)菌；多樣性；定殖；生防作用

中圖分類號(hào)：S182 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20170931001

植物內(nèi)生菌（endophyte）指能夠在健康植物活組織中生存而不引起寄主植物明顯病變的一大類微生物，是一個(gè)生態(tài)學(xué)概念，主要包括細(xì)菌、真菌和放線菌[1]。其中，內(nèi)生細(xì)菌（endophytic bacteria）是內(nèi)生菌的重要組成部分，廣泛存在于植物的根、莖、葉、花、果實(shí)、種子等組織中[1-3]，而根部的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量遠(yuǎn)超過其他組織。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細(xì)菌具有固氮、促進(jìn)植物生長、增強(qiáng)植物抗性、生物防治[4-6]等方面的作用。隨著農(nóng)業(yè)耕作模式的改革、有機(jī)食品需求量增大、人們環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)，化肥農(nóng)藥減量的同時(shí)，生物防治的優(yōu)勢(shì)也不斷突顯出來。目前，王志偉等[7]已從宏觀角度對(duì)植物內(nèi)生菌研究的發(fā)展及其意義進(jìn)行總結(jié)分析，也有內(nèi)生菌多樣性、內(nèi)生菌生防作用[8，9]等方面的專題報(bào)道，而本文更加細(xì)化地從植物根部內(nèi)生細(xì)菌多樣性及其生物防治作用2方面進(jìn)行綜述分析，為深入了解內(nèi)生細(xì)菌和生防微生物提供理論參考

1 植物根部內(nèi)生細(xì)菌多樣性

植物體內(nèi)存在大量微生物，其中很大一部分為內(nèi)生細(xì)菌。為此，研究內(nèi)生細(xì)菌多樣性不僅可以解析植物內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)、變化規(guī)律，還能為功能菌株篩選和鑒定提供理論依據(jù)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展，很大程度上提高微生物檢測(cè)方法的靈敏度，使得多樣性研究成為內(nèi)生細(xì)菌研究的重要組成部分。

內(nèi)生細(xì)菌多樣性不僅表現(xiàn)在寄主植物多樣性上，還體現(xiàn)在內(nèi)生細(xì)菌種類多樣性方面。目前已從水稻[2]、小麥[10]、甜菜[11]等不同植物根組織中發(fā)現(xiàn)多種內(nèi)生細(xì)菌，對(duì)比發(fā)現(xiàn)不同寄主類型和寄主生長環(huán)境是影響內(nèi)生細(xì)菌多樣性的2個(gè)因素。在甜菜生長的幼苗期、葉叢快速生長期、塊根增長期和糖分積累期時(shí)，根部內(nèi)生細(xì)菌的類群數(shù)目分別為66 OTUs、109 OTUs、146 OTUs和95 OTUs[11]，可見在相同環(huán)境下生長的同種植物根部，內(nèi)生細(xì)菌的多樣性也會(huì)隨寄主生長階段的變化而變化。

研究植物根部內(nèi)生細(xì)菌多樣性常采用2種方法，分別為培養(yǎng)法和非培養(yǎng)的分子生物學(xué)方法。培養(yǎng)法通過選擇不同培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件篩選出相應(yīng)的目的微生物，張瑞杰等[12]通過分離純化法研究香蒲根內(nèi)生細(xì)菌多樣性，發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)菌屬是假單胞菌屬（Pseudomonas）和拉恩氏菌屬（Rahnella）。由于培養(yǎng)法僅能獲得環(huán)境中1 %～10 %的微生物[13]，即培養(yǎng)法會(huì)人為降低植物根部內(nèi)生細(xì)菌多樣性。因此，需要結(jié)合非培養(yǎng)的分子生物學(xué)方法進(jìn)行研究才能獲得更大的突破。Zhang等[14]用T-RFLP和克隆文庫技術(shù)發(fā)現(xiàn)α-變形菌和β-變形菌是大豆根部的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌類群，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)一些未知細(xì)菌類群。盡管經(jīng)典的DGGE、T-RFLP和克隆文庫等非培養(yǎng)法能用于分析內(nèi)生細(xì)菌多樣性和相對(duì)豐度，但受其分辨率的制約[15]，一些微量及痕量內(nèi)生細(xì)菌很難被發(fā)現(xiàn)。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，一些高準(zhǔn)確性、高通量、高靈敏度的檢測(cè)技術(shù)被應(yīng)用在內(nèi)生細(xì)菌多樣性檢測(cè)中。Yu等[16]采用LNA-PCR和454高通量測(cè)序方法發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬（Pseudomonas）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）和黃桿菌屬（Flavobacterium）是大豆內(nèi)生細(xì)菌的主要成員，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)一些數(shù)目較少的不可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌，進(jìn)一步說明大豆根內(nèi)生細(xì)菌多樣性豐富。

2 植物根內(nèi)生細(xì)菌的定殖

許多細(xì)菌不僅存在土壤中，也定殖在植物根部，特定的選擇機(jī)制使得他們向根際移動(dòng)并定殖于適宜的植物根部，因此認(rèn)為根際土壤是植物內(nèi)生細(xì)菌的主要來源[17]。根際土壤中潛在內(nèi)生菌先吸附在根組織表面[18]，通過自然孔口和傷口等多種孔洞進(jìn)入根部[17]，通常定殖于木質(zhì)部導(dǎo)管和細(xì)胞間隙中[18]?？蒲泄ぷ髡邆兺ㄟ^抗生素標(biāo)記法、免疫學(xué)方法、基因標(biāo)記法以及同位素示蹤、組織染色等方法檢測(cè)內(nèi)生細(xì)菌的定殖過程。其中綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記技術(shù)以其性能穩(wěn)定、表達(dá)與受體細(xì)胞無關(guān)、方便檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)被許多研究者所采用[19]。郝慧娟等[19]采用GFP法研究枯草芽孢桿菌BSD-2在黃瓜植株內(nèi)定殖及傳導(dǎo)過程，認(rèn)為枯草芽孢桿菌通過占據(jù)有利的生態(tài)位而阻止病原菌的進(jìn)入，從而防止病害的發(fā)生。明確內(nèi)生細(xì)菌侵染定殖規(guī)律對(duì)于相關(guān)菌劑的開發(fā)與應(yīng)用是至關(guān)重要的，同時(shí)也能從分子和細(xì)胞水平闡述內(nèi)生細(xì)菌與寄主植物間的互作關(guān)系。

3 植物根部內(nèi)生細(xì)菌生物防治作用

生物防治就是利用某種生物或其產(chǎn)物抑制有害生物的方法。其中利用有益微生物，通過生物間競(jìng)爭(zhēng)作用、拮抗作用、寄生作用、溶菌作用及誘導(dǎo)抗性等，來抑制某些病原物的方法是微生物防治。筆者認(rèn)為微生物防治主要可以分為“菌-病”和“寄主-病”2個(gè)方面。

所謂“菌-病”就是指利用有益微生物通過競(jìng)爭(zhēng)、抗生、寄生、溶菌等作用去抑制或殺死某些病原物的方式。如表1中的芽孢桿菌，不僅能產(chǎn)β-1，3-葡聚糖酶、蛋白酶、幾丁質(zhì)酶等分解酶去降解病害真菌的細(xì)胞壁；同時(shí)還能產(chǎn)生嗜鐵素，競(jìng)爭(zhēng)性抑制病原菌吸收鐵元素，從而達(dá)到抑制病原菌生長的目的[20]。隨著研究的深入，Xu等[21]通過反轉(zhuǎn)錄技術(shù)、ptsI載體構(gòu)建和基因敲除法對(duì)蠟樣芽胞桿菌進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)ptsI基因能促進(jìn)蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus strain 0–9）的生物膜形成，增加其在小麥根際的生存和定殖能力，最終促進(jìn)其對(duì)紋枯病菌的抑制作用；同時(shí)也證明野生型蠟樣芽胞桿菌0–9是防治小麥紋枯病的理想生防菌。因?yàn)閄u等[21]的試驗(yàn)是在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行的，所以還需在盆栽或大田條件下對(duì)野生型蠟樣芽胞桿菌0–9的生防能力進(jìn)一步的檢測(cè)分析。目前，生防菌通過產(chǎn)生抗菌素、蛋白酶、纖維素酶、嗜鐵素等物質(zhì)在抑制葡萄霜霉病、梨樹腐爛病、煙草黑脛病等[22]方面取得一定突破。但防效單一、需菌量大、環(huán)境依賴強(qiáng)等缺點(diǎn)也制約著微生物防治的發(fā)展。endprint

而“寄主-病”是指拮抗微生物誘發(fā)植物自身抗病機(jī)制從而增強(qiáng)植物的抗病能力。如表1中沙雷氏菌[24]，能誘導(dǎo)黃瓜產(chǎn)生系統(tǒng)抗性（induced systemic resistance， ISR）抵抗黃瓜炭疽菌、腐敗病等病害。自從Chester[25]于1933年首次報(bào)道誘導(dǎo)植物產(chǎn)生免疫力后，ISR作為植物保護(hù)的一種新機(jī)制逐漸引起人們重視。到目前為止，已有許多植物免疫誘抗劑方面的報(bào)道[26]。

4 展望

利用細(xì)菌16s rDNA及一些功能基因作為分子標(biāo)記對(duì)植物根部內(nèi)生菌多樣性研究取得一定進(jìn)展。通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)：16S rDNA是一段耐受環(huán)境脅迫的保守序列，一般可鑒定到亞屬或?qū)僖陨系姆诸悊挝?。通過對(duì)16S rDNA的序列對(duì)比分析，基本上可以分析出植物根部內(nèi)生細(xì)菌的豐度。若要進(jìn)一步分析某個(gè)屬內(nèi)的細(xì)菌組成，則需要結(jié)合該屬細(xì)菌的特異性功能基因[28]。

大量研究發(fā)現(xiàn)，不同內(nèi)生細(xì)菌在植物根部的定殖規(guī)律各不相同，同時(shí)也說明內(nèi)生細(xì)菌在定殖能力、分布位點(diǎn)和定殖數(shù)量等方面均有較大差異。也有人將內(nèi)生細(xì)菌與病原菌結(jié)合研究，發(fā)現(xiàn)他們之間具有很多相似之處，為更加合理利用內(nèi)生細(xì)菌的生防功效提供理論途徑。但上述研究大多集中在內(nèi)生細(xì)菌的定殖過程及后續(xù)的傳導(dǎo)途徑部分，尚未對(duì)其在寄主體內(nèi)的傳導(dǎo)機(jī)制、增殖的影響因素及防病機(jī)理等部分做深入研究。

與其他土壤微生物相比，內(nèi)生細(xì)菌長期生活在植物體內(nèi)，使得其具有更多的生態(tài)優(yōu)勢(shì)和適應(yīng)能力[29]。但內(nèi)生細(xì)菌的生物防治過程十分復(fù)雜，受病害類型、自然環(huán)境、植物種類等多種因素影響。目前，關(guān)于生防菌制劑防效差、用量大、用法復(fù)雜等問題大量出現(xiàn)。因此，需要在內(nèi)生細(xì)菌定殖、生防能力評(píng)價(jià)、與寄主關(guān)系等方面進(jìn)行研究；在篩選生防菌時(shí)，應(yīng)當(dāng)以多種病原菌作為篩選條件，篩選出高效、穩(wěn)定、易推廣的菌株，并將多種菌劑合理的復(fù)配使用，來提高內(nèi)生細(xì)菌的綜合防效；同時(shí)還應(yīng)結(jié)合盆栽及田間試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，為生防微生物制劑的開發(fā)與推廣奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]Hallmann J，Quadt-Hallmann A，Mahaffee W F，et al. Bacterial endophytes in agricultural crops[J].Canadian Journal of Microbiology，1997，43（10）：895-914.

[2]Sun L，Qiu F，Zhang X，et al. Endophytic bacterial diversity in rice （Oryza sativa L.） roots estimated by 16S rDNA sequence analysis[J].Microbial ecology，2008，55（3）：415-424.

[3]Romero F M，Marina M，Pieckenstain F L. The communities of tomato （Solanum lycopersicum L.） leaf endophytic bacteria，analyzed by 16S-ribosomal RNA gene pyrosequencing[J].FEMS microbiology letters，2014，351（2）：187-194.

[4]Kandel S L，Herschberger N，Kim S H，et al. Diazotrophic endophytes of poplar and willow for growth promotion of rice plants in nitrogen-limited conditions[J].Crop Science，2015，55（4）：1765-1772.

[5]Ramamoorthy V，Viswanathan R，Raguchander T，et al. Induction of systemic resistance by plant growth promoting rhizobacteria in crop plants against pests and diseases[J].Crop protection，2001，20（1）：1-11.

[6]Rangeshwaran R，Wasnikar A R，Prasad R D，et al. Isolation of endophytic bacteria for biological control of wilt pathogens[J].Journal of biological control，2002，16（2）：125-134.

[7]王志偉，紀(jì)燕玲，陳永敢. 植物內(nèi)生菌研究及其科學(xué)意義[J].微生物學(xué)通報(bào)，2015，42（2）：349-363.

[8]徐亞軍. 植物內(nèi)生菌資源多樣性研究進(jìn)展[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，38（24）：149-152.

[9]陳澤斌，靳松，張永福，等. 植物內(nèi)生菌生物防治研究進(jìn)展及存在的問題[J].昆明學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，36（3）：40-42.

[10]Durán P，Acu?a J J，Jorquera M A，et al. Endophytic bacteria from selenium-supplemented wheat plants could be useful for plant-growth promotion，biofortification and Gaeumannomyces graminis biocontrol in wheat production[J].Biology and fertility of soils，2014，50（6）：983-990.endprint

[11]Shi Y W，Yang H，Zhang T，et al. Illumina-based analysis of endophytic bacterial diversity and space-time dynamics in sugar beet on the north slope of Tianshan mountain[J].Applied microbiology and biotechnology，2014，98（14）：6375-6385.

[12]張瑞杰，張瓊瓊，黃興如，等. 基于分離培養(yǎng)方法的香蒲根內(nèi)生細(xì)菌多樣性[J].濕地科學(xué)，2016（2）：201-211.

[13]Ward D M，Weller R，Bateson M M. 16S rRNA sequences reveal numerous uncultured microorganisms in a natural community [J].Nature，1990，345（6270）：63-65.

[14]Zhang Y Z，Wang E T，Li M，et al. Effects of rhizobial inoculation，cropping systems and growth stages on endophytic bacterial community of soybean roots[J].Plant and soil，2011，347（1-2）：147-161.

[15]Kirk J L，Beaudette L A，Hart M，et al. Methods of studying soil microbial diversity[J].Journal of microbiological methods，2004，58（2）：169-188.

[16]Yu J，Yu Z H，F(xiàn)an G Q，et al. Isolation and Characterization of Indole Acetic Acid Producing Root Endophytic Bacteria and Their Potential for Promoting Crop Growth[J].Journal of Agricultural Science and Technology，2016，18（5）：1381-1391.

[17]Rosenblueth M，Martínez-Romero E. Bacterial endophytes and their interactions with hosts[J].Molecular plant-microbe interactions，2006，19（8）：827-837.

[18]Tombolini R，Unge A，Davey M E，et al. Flow cytometric and microscopic analysis of GFP-tagged Pseudomonas fluorescens bacteria[J].FEMS Microbiology Ecology，1997，22（1）：17-28.

[19]郝慧娟，劉洪偉，尹淑麗，等. 枯草芽孢桿菌BSD-2的GFP標(biāo)記及其在黃瓜上的定殖研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2016，31（4）：106-111.

[20]Szilagyi-Zecchin V J，Ikeda A C，Hungria M，et al. Identification and characterization of endophytic bacteria from corn （Zea mays L.） roots with biotechnological potential in agriculture[J].AMB Express，2014，4（1）：26.

[21] Xu Y B，Chen M，Zhang Y，et al. The phosphotransferase system gene ptsI in the endophytic bacterium Bacillus cereus is required for biofilm formation，colonization，and biocontrol against wheat sharp eyespot[J].FEMS microbiology letters，2014，354（2）：142-152.

[22] 程超，趙延存，李紅旭，等. 產(chǎn)酶溶桿菌OH11代謝產(chǎn)物HSAF對(duì)梨樹腐爛病的防治效果[J].中國生物防治學(xué)報(bào)，2017，33（1）：114-120.

[23] Debode J，Maeyer K D，Perneel M，et al. Biosurfactants are involved in the biological control of Verticillium microsclerotia by Pseudomonas spp[J].Journal of applied microbiology，2007，103（4）：1184-1196.

[24] Press C M，Loper J E，Kloepper J W. Role of iron in rhizobacteria-mediated induced systemic resistance of cucumber[J].Phytopathology，2001，91（6）：593-598.

[25] Chester K S. The problem of acquired physiological immunity in plants[J].The Quarterly Review of Biology，1933，8（3）：275-324.

[26]邱德文. 我國植物免疫誘導(dǎo)技術(shù)的研究現(xiàn)狀與趨勢(shì)分析[J].植物保護(hù)，2016，42（5）：10-14.

[27]Abdallah R A B，Mokni-Tlili S，Nefzi A，et al. Biocontrol of Fusarium wilt and growth promotion of tomato plants using endophytic bacteria isolated from Nicotiana glauca organs[J].Biological Control，2016（97）：80-88.

[28]Chun J，Bae K S. Phylogenetic analysis of Bacillus subtilis and related taxa based on partial gyrA gene sequences[J].Antonie van Leeuwenhoek，2000，78（2）：123-127.

[29] Pathak K V，Keharia H. Characterization of fungal antagonistic bacilli isolated from aerial roots of banyan （Ficus benghalensis） using intact‐cell MALDI‐TOF mass spectrometry （ICMS）[J].Journal of applied microbiology，2013，114（5）：1300-1310.

作者簡(jiǎn)介：曹焜，黑龍江鶴崗人，碩士，研究實(shí)習(xí)員，研究方向?yàn)闈h麻育種及漢麻內(nèi)生菌；王曉楠，黑龍江綏化人，博士，副研究員，研究方向?yàn)闈h麻育種及組學(xué)研究。endprint