生防芽孢桿菌VD18R19在香草蘭上定殖動(dòng)態(tài)及其對香草蘭根莖腐病的田間生防效果

高圣風(fēng) 劉愛勤 桑利偉 茍亞峰 孫世偉 王政 孟倩倩

摘 要 為考察生防菌株Bacillus subtilis VD18R19在香草蘭上的定殖動(dòng)態(tài)及其對香草蘭根（莖）腐病的田間生防效果。首先通過熒光顯微鏡觀測VD18R19在香草蘭上定殖位點(diǎn)的空間分布情況，然后采用菌落計(jì)數(shù)方法分析該菌株在香草蘭上定殖數(shù)量的時(shí)間變化動(dòng)態(tài)；最后通過田間試驗(yàn)檢測VD18R19在自然發(fā)病的條件下對香草蘭根（莖）腐病的生防效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：（1） VD18R19菌株在香草蘭根系定殖數(shù)量最多，在葉片表面較少，在莖蔓表面最少；（2） 在灌根處理后的45 d中，該菌株在香草蘭根系上定殖數(shù)量變動(dòng)不大，定殖密度保持在106 CFU/g水平。（3） 在自然發(fā)病的情況下，該菌株對苗圃中香草蘭根（莖）腐病的防效達(dá)67.08%，顯著好于多菌靈和清水對照。此外，生防菌處理能夠顯著促進(jìn)香草蘭生長，新抽莖蔓長度相對清水對照增長70.34%?？傊?，生防芽孢桿菌VD18R19可以在香草蘭根際長期高水平定殖，能夠有效防控香草蘭根（莖）腐病并對香草蘭生長具有明顯促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞 枯草芽孢桿菌 ；香草蘭 ；定殖 ；生物防治 ；促生長

中圖分類號 S476 ；S435.73 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.07.012

Abstract This study aimed to monitor the colonization dynamics of B. subtilis VD18R19 in vanilla and analyzed the biocontrol effect of the strain VD18R19 against fusarium wilt disease infecting vanilla. The colonization site distribution of the strain VD18R19 was monitored by fluorescence microscopy using Green Fluorescent Protein （GFP） mark. The temporal dynamic change of colonizing populations in vanilla were detected by plate count. The biocontrol of the strain VD18R19 against Fusarium wilt disease infecting vanilla naturally was tested in the field. The results showed that the most fluorescent cells of the strain VD18R19 were observed on the surface of the roots of vanilla， much less on the leaves， and few on the stem. The strain VD18R19 was colonized on the rhizosphere of vanilla at a high population level （106 CFU/g） without much change in the experiment within 45 days of treatment. In the nursery test， the disease severity in the strain VD18R19 treatment was significantly reduced when compared with that of the carbendazim treatment and water control， and it had a controlling efficiency of upto 67.08%. In addition， the strain VD18R19 treatment improved the vine growth of vanilla by 70.34%， as compared with the water control. In conclusion， the strain VD18R19 was well colonized in the root and performed good biocontrol activity against fusarium wilt disease infecting vanilla.

Keywords Bacillus subtilis ； vanilla ； colonization ； biocontrol ； growth promotion

生防芽孢桿菌具有廣譜、高效、對逆境耐受性強(qiáng)、對環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前生防微生物的重要組成部分。研究發(fā)現(xiàn)，生防芽孢桿菌的防病效果與其在作物根際的定殖能力密切相關(guān)[1-2]。生防菌田間應(yīng)用時(shí)，因?yàn)楦H定殖能力差導(dǎo)致的病害防效下降或防治失敗的現(xiàn)象常有發(fā)生[3]；Kamilova 等[4]報(bào)道熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）PCL1751的在番茄根際定殖能力下降后均對番茄根腐病的防效顯著降低。Chinawoeng 等[5]發(fā)現(xiàn)對病原菌具有良好拮抗效果的綠針假單胞菌（P. chlororaphis）PCL1391在番茄根際定殖能力是該菌株發(fā)揮生防效果的前提條件之一。高圣風(fēng)等和高毓晗等[6-7]分別研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 168在被修復(fù)了sfp基因后，定殖能力顯著上升，對番茄細(xì)菌性枯萎病和黃瓜鐮刀菌枯萎病的防效均大幅上升。根際定殖能力已成為生防芽孢桿菌大規(guī)模商品化的重要制約因子[8]。

香草蘭（Vanilla planifolia Andrews）是一種天然食品香料植物，被廣泛應(yīng)用于高端香煙、酒水、茶葉、香水等食品和化妝品行業(yè)，經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高[9]。近年來，香草蘭根（莖）腐病為害日益嚴(yán)重，嚴(yán)重影響了香草蘭產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[10-11]。由于化學(xué)農(nóng)藥防治容易造成環(huán)境污染和農(nóng)藥殘留等問題，不利于可持續(xù)型生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展，利用綠色高效的生防菌防控香草蘭病害是減少化學(xué)農(nóng)藥用量的良好選擇。Ramalingam 等[12]從香草蘭根系中分離出多個(gè)產(chǎn)生拮抗物質(zhì)的生防菌株，發(fā)現(xiàn)這些菌株在田間和溫室中對香草蘭根（莖）腐病具有良好的防效。曾會才等[13]從3株枯草芽孢桿菌（B. subtills）和3株木霉（Trichodema）中篩選到2株拮抗效果良好的生防菌，在室內(nèi)盆栽試驗(yàn)中對香草蘭根（莖）腐病和香草蘭疫病均有著良好的防治效果。本研究室從香草蘭根際分離出生防菌株B. subtills VD18R19，發(fā)現(xiàn)該菌株在對峙培養(yǎng)試驗(yàn)中對香草蘭根（莖）腐病菌（Fusarium oxysporum）具有良好拮抗效果[14]，在香草蘭病害生物防治上具有極佳的應(yīng)用潛力。

但是，至今尚未有生防枯草芽孢桿菌在香草蘭上定殖情況的報(bào)道。之前，我們已經(jīng)將綠色熒光蛋白基因（gfp）轉(zhuǎn)入生防菌B. subtills VD18R19，發(fā)現(xiàn)GFP標(biāo)記在該菌株能夠正常表達(dá)和穩(wěn)定遺傳[15]。本研究利用GFP標(biāo)記檢測了生防芽孢桿菌VD18R19在香草蘭上的定殖位點(diǎn)和定殖數(shù)量；并通過田間試驗(yàn)分析該菌株在自然發(fā)病條件下對香草蘭根（莖）腐病的生防效果。本研究揭示生防芽孢桿菌在香草蘭上定殖狀態(tài)及田間應(yīng)用效果，有助于理解“生防菌-香草蘭”互作形態(tài)，對高效生防菌的開發(fā)有積極意義。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用生防菌B. subtilis VD18R19是本研究室自主分離鑒定獲得[14]，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（China General Microbiological Culture Collection Center， CGMCC）；VD18R19-gfp菌株是本研究室將GFP表達(dá)載體pAD43-25轉(zhuǎn)入VD18R19而成，氯霉素抗性5 μg/mL[15]，保存于本研究室-80℃超低溫冰箱中。

1.2 方法

1.2.1 在香草蘭上的定殖情況分析

將長寬高分別為80、40、15 cm的塑料中轉(zhuǎn)箱洗凈后在底部打2個(gè)直徑2 cm的孔備用。將椰糠與蛭石按1∶1比例混合后澆透水，121℃條件下滅菌30 min，冷卻后裝入中轉(zhuǎn)箱中作為種植基質(zhì)，基質(zhì)深度約5 cm。將健康香草蘭扦插苗定植于基質(zhì)上，每箱10株。放置于日光溫室中培養(yǎng)，及時(shí)澆水保濕，生長1個(gè)月后備用。將GFP標(biāo)記的生防菌株VD18R19-gfp接種到含氯霉素5 μg/mL 的LB培養(yǎng)基（酵母粉5 g，胰蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，去離子水1 000 mL，121℃滅菌20 min）中37℃ 200 r/min條件培養(yǎng)12 h。菌液在8 000 g條件下離心2 min，棄上清，用無菌水懸浮菌體；重復(fù)離心懸浮一次，充分去除培養(yǎng)基。將菌懸液用無菌水稀釋為濃度約為107 CFU/mL的處理液，對香草蘭苗進(jìn)行灌根和表面噴霧處理，每箱500 mL處理液。處理48 h后采集根、莖、葉，剪成小段放在載玻片上制成臨時(shí)裝片，使用倒置熒光顯微鏡（奧林巴斯IX73）在波長約498 nm的藍(lán)色激光下檢測生防菌在香草蘭上的定殖情況，每個(gè)位置至少檢測3個(gè)玻片，每個(gè)玻片至少檢測5個(gè)視野。另外，分別于處理后 1、3、5、10、15、20、25、30、35、40和45 d時(shí)間點(diǎn)各取3株香草蘭苗，分別將每株根系收集在一起用無菌水輕輕沖洗干凈后稱重，研磨均勻后通過稀釋涂平板方法檢測生防菌在香草蘭根系的定殖數(shù)量。定殖數(shù)量檢測所用平板均為含氯霉素5 μg/mL 的LB固體培養(yǎng)基。

1.2.2 田間生防效果分析

生防菌VD18R19菌種接種于LB培養(yǎng)基中，在37℃ 200 r/min條件下震蕩培養(yǎng)12 h制備種子菌。種子菌以3%比例接種于Landy培養(yǎng)基（葡萄糖10 g， L-谷氨酸5 g，磷酸二氫鉀1 g，七水合硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g， L-苯丙氨酸2 μg，硫酸錳5 μg， 五水合硫酸銅0.16 μg， 七水合硫酸亞鐵0.15 μg，去離子水1 000 mL，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0，121℃滅菌20 min）中，在30℃ 180 r/min條件下發(fā)酵36 h 形成發(fā)酵液。將發(fā)酵液用無菌水稀釋10倍，稀釋液活菌濃度約為107 CFU/mL備用。選取香草蘭苗圃作為試驗(yàn)場所，在香草蘭莖蔓扦插于苗床7 d后，用生防菌VD18R19處理液對香草蘭表面及其周圍土壤進(jìn)行噴霧處理，3個(gè)月后重復(fù)處理1次。分別以清水處理和80%多菌靈可濕性粉劑（生產(chǎn)廠家：上海鄉(xiāng)村季風(fēng)生物科技有限公司）1 000倍稀釋液處理作為對照。每個(gè)處理均包含獨(dú)立的3畦苗床，每畦育苗約60株，每畦為1個(gè)重復(fù)。每個(gè)重復(fù)每次處理液用量為5 L。按常規(guī)方法進(jìn)行日常管理，每半個(gè)月檢查自然發(fā)病植株，記錄后及時(shí)清除病株。6個(gè)月后統(tǒng)計(jì)發(fā)病率、香草蘭在苗圃期間新生莖蔓長度及新生莖蔓第2節(jié)的直徑。每重復(fù)發(fā)病率=每畦發(fā)病株數(shù)÷每畦總株數(shù)×100%，每處理發(fā)病率=（重復(fù)1發(fā)病率+重復(fù)2發(fā)病率+重復(fù)3發(fā)病率）÷3×100%；防效=（對照發(fā)病率-處理發(fā)病率）÷對照發(fā)病率×100%。促生率=（處理平均值-對照平均值）÷對照平均值×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌在香草蘭上的定殖動(dòng)態(tài)

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生防菌VD18R19在香草蘭根系和莖葉表面均可定殖；在根系根毛區(qū)和干枯氣生根定殖數(shù)量最多，菌體聚集成片分布；葉表定殖數(shù)量較少，主要集中于葉片褶皺處和氣孔位置，多以單菌體散列分布；在莖表面定殖數(shù)量很少，多以單個(gè)菌體定殖在細(xì)胞間隙處（圖1）。對處理45 d內(nèi)生防菌在香草蘭根系上定殖菌量分析發(fā)現(xiàn)，定殖密度呈先略微上升再緩慢下降趨勢，在處理后第10 天定殖密度最大（9.54×106 CFU/g），整個(gè)45 d的定殖密度均維持在106 CFU/g水平（圖2）。

2.2 生防菌田間生防效果

結(jié)果顯示，生防菌VD18R19處理的香草蘭苗在成活率和長勢上均明顯好于多菌靈和清水處理（圖3）。3個(gè)處理間的病害發(fā)生率均存在顯著差異（p≤0.05），相對于清水對照，生防菌處理對香草蘭根（莖）腐病的防效達(dá)67.08%，多菌靈處理僅為34.34%（表1）。此外，生防菌能夠顯著促進(jìn)香草蘭苗莖蔓生長，該處理的新抽莖蔓長度比清水對照增長70.34%，而多菌靈處理與清水對照間差異不顯著。在莖蔓直徑上，生防菌處理比清水對照略有增強(qiáng)，但差異不顯著。

3 討論與結(jié)論

有效定殖是生防菌在田間應(yīng)用時(shí)發(fā)揮作用的重要前提。Sha等[16]發(fā)現(xiàn)，2株枯草芽孢桿菌應(yīng)用于水稻后的20 d內(nèi)，在葉片上定殖水平保持在5×106 CFU/g水平，并且能夠提高水稻對抗稻瘟病能力。Fan 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，用枯草芽孢桿菌9407浸泡處理剛萌發(fā)的西瓜種子，20 d后該菌株在西瓜根系和葉片內(nèi)部的定殖水平分別在104 和103 CFU/g水平，對西瓜細(xì)菌性果斑病的防效達(dá)57.8%。Han等[18]發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌Tpb55主要定殖于煙草根系的分裂區(qū)和伸長區(qū)，偏好于在細(xì)胞間隙定殖，在處理后30 d內(nèi)該菌株在煙草根系的定殖水平保持在106 CFU/g左右，對煙草黑脛病的田間防效達(dá)59.34%。本研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌VD18R19在香草蘭的根毛區(qū)定殖數(shù)量最多，偏好于細(xì)胞間隙位置（圖3），與前人在馬鈴薯、黃瓜、番茄等作物上的報(bào)道一致[19-21]。生防菌VD18R19在香草蘭根系的定殖量遠(yuǎn)高于葉片，與之前研究該生防菌在胡椒上定殖情況一致[15]，說明該菌株適合生存于植株根部，為枯草芽孢桿菌VD18R19應(yīng)用提供方向指導(dǎo)?？莶菅挎邨U菌在植物根際定殖是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及到菌株的趨化、運(yùn)動(dòng)和產(chǎn)生生物膜等過程[22-24]，生防菌VD18R19在香草蘭根系的定殖機(jī)制還有待于后續(xù)研究。

枯草芽孢桿菌能夠產(chǎn)生多種抑菌次生代謝產(chǎn)物，包括表面活性素（Surfactin）、伊枯草菌素（Iturin）、泛革素（Fengycin）、溶桿菌素（Bacilysin）等，能夠通過拮抗病原菌、誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性（induced systemic resistance， ISR）等機(jī)制防控植物病害。前期研究發(fā)現(xiàn)，生防菌VD18R19對香草蘭根（莖）腐病菌（F. oxysporum）菌絲生長具有良好的拮抗效果[14]。最近，本研究室完成了該菌株的全基因組測序工作，從該菌株的基因組中發(fā)現(xiàn)了6個(gè)編碼抑菌物質(zhì)的基因簇，其拮抗范圍涵蓋真菌、細(xì)菌和病毒。本研究在田間試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，生防菌VD18R19對香草蘭根（莖）腐病的防效達(dá)67.08%（表1），推測拮抗機(jī)制應(yīng)該是其主要防病機(jī)制之一。國內(nèi)外報(bào)道表明，枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的表面活性素（Surfactin）2，3-丁二醇（2，3-butanediol）等次生代謝產(chǎn)物能夠誘導(dǎo)植物ISR[6，25]。但是生防菌VD18R19是否能夠誘導(dǎo)香草蘭ISR還需要在后續(xù)研究中深入探討。

參考文獻(xiàn)

[1] Chowdhury S P， Hartmann A， Gao X W， et al. Biocontrol mechanism by root-associated Bacillus amyloliquefaciens FZB42， a review[J]. Frontiers in Microbiology， 2015， 6（780）： 1-11.

[2] Fan H， Zhang Z， Li Y， et al. Biocontrol of bacterial fruit blotch by Bacillus subtilis 9407 via surfactin-mediated antibacterial activity and colonization[J]. Frontiers in Microbiology， 2017， 8（1 973）： 1-15.

[3] Lugtenberg B， Kamilova F. Plant-growth-promoting rhizobacteria[J]. Annual review of microbiology， 2009， 63： 541-556.

[4] Kamilova F， Validov S， Azarova T， et al. Enrichment for enhanced competitive plant root tip colonizers selects for a new class of biocontrol bacteria[J]. Environmental Microbiology， 2005， 7（11）： 1 809-1 817.

[5] Chinawoeng T F C， Bloemberg G V， Mulders I H M， et al. Root colonization by phenazine-1-carboxamide-producing bacterium Pseudomonas chlororaphis PCL1391 is essential for biocontrol of tomato foot and root rot.[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions， 2000， 13（12）： 1 340-1 345.

[6] Gao S， Wu H， Wang W， et al. Efficient Colonization and Harpins Mediated Enhancement in Growth and Biocontrol of Wilt Disease in Tomato by Bacillus subtilis[J]. Letters in Applied Microbiology， 2013， 57（6）： 526-533.

[7] 高毓晗，李世東，郭榮君. sfp基因轉(zhuǎn)化增強(qiáng)了Bacillus subtilis 168的定殖能力和對黃瓜莖內(nèi)枯萎病菌的抑制作用[J]. 中國生物防治學(xué)報(bào)，2016，32（1）：76-85.

[8] Benizri E， Baudoin E， Guckert A. Root colonization by inoculated plant growth-promoting rhizobacteria[J]. Biocontrol science and technology， 2001， 11（5）： 557-574.

[9] Gallage N J. Vanillin-Bioconversion and Bioengineering of the Most Popular Plant Flavor and Its De Novo Biosynthesis in the Vanilla Orchid.[J]. Molecular Plant， 2015， 8（1）： 40-57.

[10] 劉愛勤. 熱帶特色香料飲料作物主要病蟲害防治圖譜[M]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社， 2013： 1-34.

[11] 高圣風(fēng)，劉愛勤，桑利偉，等. 香草蘭根（莖）腐病病原菌鑒定及其致病性測定[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，35（1）：39-44.

[12] Radjacommare R， Usharani R， Samiyappan R. Genotyping antibiotic producing Fluorescent pseudomonads to select effective rhizobacteria for the management of major vanilla diseases[J]. Annals of Microbiology， 2007， 57（2）： 163-170.

[13] 曾會才，張開明，文衍堂. 香草蘭根腐病生防菌篩選及防治試驗(yàn)[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，1998（2）：65-69.

[14] 高圣風(fēng)，劉愛勤，桑利偉，等. 香草蘭生防細(xì)菌的篩選、分子鑒定及其抑菌機(jī)制的初步研究[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，36（1）：41-46.

[15] 高圣風(fēng)，劉愛勤，桑利偉，等. 枯草芽胞桿菌VD18R19在胡椒上的定殖動(dòng)態(tài)及促生作用和對胡椒瘟病的防治效果[J]. 中國生物防治學(xué)報(bào)，2017，33（5）： 650-657.

[16] Sha Y， Wang Q， Li Y. Suppression of Magnaporthe oryzae， and interaction between Bacillus subtilis， and rice plants in the control of rice blast[J]. Springerplus， 2016， 5（1）： 1 238.

[17] Fan H， Zhang Z， Li Y， et al. Biocontrol of bacterial fruit blotch by Bacillus subtilis 9407 via surfactin-mediated antibacterial activity and colonization[J]. Frontiers in Microbiology， 2017， 8： 1 973.

[18] Han T， You C， Zhang L， et al. Biocontrol potential of antagonist Bacillus subtilis Tpb55 against tobacco black shank[J]. Biocontrol， 2016， 61（2）： 195-205.

[19] 王 穎，楊成德，薛 莉，等. 拮抗內(nèi)生細(xì)菌Bacillus mojavensis ZA1在馬鈴薯根內(nèi)及根際的定殖動(dòng)態(tài)及其對土壤微生物的影響[J]. 中國生物防治學(xué)報(bào)，2016，32（3）： 372-378.

[20] 郝慧娟，劉洪偉，尹淑麗，等. 枯草芽孢桿菌 BSD-2的GFP標(biāo)記及其在黃瓜上的定殖研究[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2016，31（4）：106-111.

[21] 喬俊卿，陳志誼，梁雪杰，等. 枯草芽孢桿菌Bs916在番茄根部的定殖[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，31（6）：1 278-1 283.

[22] Yuan J， Zhang N， Huang Q， et al. Organic acids from root exudates of banana help root colonization of PGPR strain Bacillus amyloliquefaciens NJN-6[J]. Scientific Reports， 2015， 5（13 438）： 121-127.

[23] Gao S， Wu H， Yu X， et al. Swarming motility plays the major role in migration during tomato root colonization by Bacillus subtilis SWR01[J]. Biological Control， 2016， 98： 11-17.

[24] Al-Ali A， Deravel J， Krier F， et al. Biofilm formation is determinant in tomato rhizosphere colonization by Bacillus velezensis FZB42[J]. Environmental Science and Pollution Research， 2017： 1-11.

[25] Yi H S， Ahn Y R， Song G C， et al. Impact of a bacterial volatile 2，3-butanediol on Bacillus subtilis rhizosphere robustness[J]. Frontiers in Microbiology， 2016（7）： 993.