流式細(xì)胞術(shù)估測胡椒屬植物基因組大小方法的建立及應(yīng)用

伍寶朵 胡麗松 馮楗雄 范睿 郭芬 吉訓(xùn)志 郝朝運 閆林

關(guān)鍵詞：胡椒屬；流式細(xì)胞術(shù)；細(xì)胞核提取液；基因組大小

基因組大小是指某種生物中單倍體細(xì)胞核或配子體中的DNA含量，是物種特有的，稱為C值（C-value），常用重量皮克（10?12g）或核苷酸堿基對數(shù)量（basepair）來表示。基因組大小與物種的進(jìn)化有較強的相關(guān)性，同時與生物學(xué)性狀也有一定的關(guān)系[1]?；蚪M大小測定的方法有多種，如Feulgen染色法、化學(xué)分析法及流式細(xì)胞術(shù)等。Feulgen染色法結(jié)果相對準(zhǔn)確，但是操作過程繁瑣；化學(xué)分析法易受細(xì)胞周期影響，致使測定結(jié)果存在偏差[2]；而新技術(shù)流式細(xì)胞術(shù)（flowcytometry，F(xiàn)CM）具有瞬間準(zhǔn)確分析大量細(xì)胞的特點，是一種測定基因組大小快速且有效的方法[3]。流式細(xì)胞術(shù)在人和動物的臨床和基礎(chǔ)研究中被廣泛應(yīng)用，植物體內(nèi)由于含有大量的多糖、多酚等次生代謝物質(zhì)，嚴(yán)重影響了PI染料的熒光染色強度，降低了測定基因組大小的準(zhǔn)確性[4]。因此明確適合測定物種流式細(xì)胞術(shù)的測定方法對該物種基因組大小研究至關(guān)重要。近年來，流式細(xì)胞術(shù)在植物中被廣泛應(yīng)用。楊轉(zhuǎn)英等[5]采用流式細(xì)胞術(shù)測定不同菠蘿蜜株系基因組大小，發(fā)現(xiàn)不同菠蘿蜜株系之間基因組大小存在顯著差異，且濕苞株系大于干苞株系。柳覲等[6]利用改良OTTO細(xì)胞核提取液檢測出澳洲堅果基因組大小為1.872758×109bp，該研究發(fā)現(xiàn)運用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行澳洲堅果基因組C值測定準(zhǔn)確可靠。

胡椒屬植物是胡椒科（Piperaceae）重要的泛熱帶組成成分，是基部被子植物中最大的屬之一[7]。約有1000多個種，主要分布于南亞、南美洲、中美洲等熱帶和亞熱帶地區(qū)。胡椒屬內(nèi)有許多具有經(jīng)濟(jì)價值和開發(fā)潛力的資源，例如胡椒（P.nigrum）、卡瓦胡椒（P.methysticum）和石楠藤（P.wallichii）等被用來入藥[8]，在亞洲東南部，人們常將蔞葉（P.betle）和檳榔果連同石灰一起咀嚼幫助消化。胡椒野生近緣種眾多，部分資源具有優(yōu)良性狀，例如黃花胡椒（P.flaviflorum）具有較強的抗瘟病性[9]。大葉蒟（P.laetispicum）具有較長的花穗，石楠藤具有較強的抗寒性等[10]。胡椒是人們喜愛的調(diào)味品，素有“香料之王”的美譽。原產(chǎn)于印度，胡椒自1947年引入中國，目前種植面積達(dá)3萬hm2，年總產(chǎn)量超過3萬t，位居世界第5位。我國胡椒栽培品種以熱引1號（P.nigrumcv.Reyin1）為主，存在栽培品種單一和抗逆性弱的問題，嚴(yán)重限制了我國胡椒產(chǎn)業(yè)的良性發(fā)展[11-12]。因此亟待開展胡椒資源挖掘和創(chuàng)新利用工作。胡椒是四倍體植物，染色體數(shù)為2n=4x=52[13]。JOSE等[14]報道胡椒屬不同資源具有不同染色體數(shù)，且胡椒屬植物具有較小的染色體長度（0.56～2.41μm），而染色體倍性分析需要較強的實驗技術(shù)，利用流式細(xì)胞術(shù)可快速測定胡椒屬資源基因組大小，為染色體倍性估測和分析提供基礎(chǔ)。

本研究以4份不同來源地胡椒屬種質(zhì)為材料，通過篩選6種細(xì)胞核提取液和不同部位葉片，明確適合胡椒屬基因組大小的流式細(xì)胞術(shù)測定方法。利用篩選出的適合胡椒流式細(xì)胞術(shù)測定的方法，以黃瓜為標(biāo)樣，測定22份胡椒屬資源的基因組大小。本研究可為胡椒屬資源基因組大小測定提供方法，也將為胡椒屬資源變異、種質(zhì)資源評價及遠(yuǎn)源雜交等研究提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

供試材料為胡椒屬種質(zhì)，胡椒屬種質(zhì)葉片取材于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所的農(nóng)業(yè)農(nóng)村部萬寧胡椒種質(zhì)資源圃。分別取4份來源地不同的胡椒屬種質(zhì)嫩葉用于細(xì)胞核提取液篩選（表1）；取4份種質(zhì)的下位葉、中位葉、倒一葉用于葉片部位篩選；22份胡椒屬資源用于測定基因組大小。以黃瓜（CucumissativusL.）為標(biāo)樣[15]，將黃瓜種子播種于15cm×20cm培養(yǎng)盆中，并在人工氣候室培育，待長出真葉后取嫩葉用于試驗。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞核提取液及DNA熒光染料的配制選取4種已報道的細(xì)胞核提取液（Otto提取液[5]、Tris提取液[16]、LB01提取液[4]和WPB提取液[17]）、1種改良提取液[18]和1種PI試劑盒（廣州吉源生物科技有限公司），細(xì)胞核提取液具體配方見表2。提取液配制完成后過濾、滅菌，并置于4℃冰箱內(nèi)保存。熒光探針是碘化丙啶（PI），PI工作液中碘化丙啶的濃度為1mg/mL。

1.2.2細(xì)胞核懸浮液的制備和染色剪取約20～40mg胡椒葉片放入60mm培養(yǎng)皿中，加入預(yù)冷的細(xì)胞核提取液500μL，讓提取液充分浸沒葉片，用厚度為0.08mm鋒利的雙面刀片迅速切成碎片，傾斜放置5min，再用400～600目濾膜過濾至流式細(xì)胞儀專用上樣管中，在濾液中加入2mL細(xì)胞核提取液或緩沖液、6μLRNaseA（終濃度為40μg/mL）和20μLPI染液，避光靜置30min。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測將制備好的細(xì)胞核懸浮液采用德國Partec公司CyFlow?Cube6流式細(xì)胞儀檢測。流式細(xì)胞儀的氬離子激光發(fā)射器的激發(fā)光波長為488nm，檢測通道為FL2通道590/50[488]，利用流式細(xì)胞儀隨機自帶軟件CyFlowCube15-CFG收集至少5000個細(xì)胞，變異系數(shù)（coefficientofvariation，CV）控制在6%以內(nèi)；每個樣本重復(fù)測定5次。

1.3數(shù)據(jù)處理

利用FlowJo-V10軟件分析數(shù)據(jù)，以標(biāo)樣基因組大小和出峰位置為對照，依據(jù)測定樣品出峰位置計算出其基因組大?。ɑ蚪MC值），計算公式為：待測樣本基因組大小=參考樣本基因組大?。ù郎y樣本熒光均值/參考樣本熒光均值）；使用SPSS16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2結(jié)果與分析

2.1細(xì)胞核提取液的篩選

比較6種細(xì)胞核提取液流式細(xì)胞術(shù)測定結(jié)果可知（圖1），以O(shè)tto提取液為細(xì)胞核提取液時，只有墨西哥胡椒能檢測出信號峰，熱引1號胡椒、黃花胡椒和卡瓦胡椒3份種質(zhì)不能檢測出信號峰。以Tris提取液為細(xì)胞核提取液時，熱引1號胡椒和墨西哥胡椒能檢測出信號峰，但是信號峰碎片較多，CV值均大于6，黃花胡椒和卡瓦胡椒不能檢測出信號峰。以LB01提取液為細(xì)胞核提取液時，熱引1號胡椒、墨西哥胡椒和卡瓦胡椒均能檢測出信號峰，其中熱引1號胡椒和卡瓦胡椒的信號峰都是碎片較多，CV值大于6，墨西哥胡椒信號峰碎片相對少一些，黃花胡椒不能檢測出信號峰。以WPB提取液為細(xì)胞核提取液時，熱引1號胡椒和墨西哥胡椒均能檢測出信號峰，但是檢測出的信號峰都是碎片較多，CV值大于6，黃花胡椒和卡瓦胡椒不能檢測出信號峰。以PI試劑盒為細(xì)胞核提取液時，墨西哥胡椒和卡瓦胡椒能檢測出信號峰，但是卡瓦胡椒信號峰碎片稍多，熱引1號胡椒和黃花胡椒不能檢測出信號峰。以改良提取液為細(xì)胞核提取液時，4份種質(zhì)均能檢測出完整信號峰，CV值小于6?？梢姡牧继崛∫菏沁m合胡椒屬種質(zhì)流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞核提取液。

2.2葉片取樣部位的篩選

為選擇適合胡椒屬種質(zhì)資源流式細(xì)胞檢測的最佳部位葉片，利用篩選出的改良提取液分別對黃花胡椒、熱引1號胡椒、卡瓦胡椒和墨西哥胡椒的下位葉（superiorleaf）、中上位葉（inferiorleaf）和倒一葉（invertedoneleaf）進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測（圖2），結(jié)果表明4份胡椒種質(zhì)使用下位葉和上位葉檢測時，少數(shù)不能形成完整的信號峰，多數(shù)形成了完整的信號峰，但是與倒一葉相比，下位葉和上位葉形成的信號峰碎片較多，細(xì)胞核收集偏少?？梢姡挂蝗~是適宜胡椒屬流式細(xì)胞術(shù)的葉片采樣部位。

2.3胡椒屬資源C值測定

通過比較待測胡椒資源樣品與黃瓜樣品峰值的倍數(shù)關(guān)系（圖3），計算出胡椒資源的基因組大?。ū?）。以熱引1號胡椒為例，其熒光強度是6596，標(biāo)樣黃瓜的熒光強度為3184，ARUMUGANATHAN等[15]報道利用流式細(xì)胞術(shù)測定的黃瓜基因組大小為367Mb，依據(jù)基因組大小計算公式，計算出熱引1號胡椒基因組大小為759.69Mb，HU等[19]通過全基因組測序估測的熱引1號胡椒基因組大小為761.2Mb，二者誤差較小，說明該方法準(zhǔn)確可靠。利用同樣的方法，估測了22份胡椒資源基因組大小，檢測的胡椒種質(zhì)基因組大于900Mb的種質(zhì)有石楠藤、卡瓦胡椒和山蒟；基因組在600～800Mb的種質(zhì)有熱引1號、柬埔寨小葉種、班尼約爾1號、古晉、Aman胡椒、EMAS胡椒、73F5、雜交種、復(fù)毛胡椒、華山蒟、蔞葉和篳菝；基因組小于600Mb的種質(zhì)有海南蒟、假蒟、大葉蒟、尖峰嶺胡椒、斜葉蒟、黃花胡椒和墨西哥胡椒。綜上可見，胡椒屬不同種質(zhì)間基因組大小差異較大。

3討論

植物體內(nèi)含有大量的多糖、多酚等次生代謝物質(zhì)，嚴(yán)重影響了PI染料的熒光染色強度，降低了測定基因組大小的準(zhǔn)確性。胡椒屬植物是遍布于熱帶地區(qū)的重要作物，胡椒葉片具有較厚的蠟質(zhì)層，葉片硬度較高，細(xì)胞中具有較復(fù)雜的次生代謝物質(zhì)，研究表明胡椒葉中DPPH清除能力、多酚含量及氧自由基清除能力均高于胡椒果實，可能含有高抗氧化因子[20]。本研究嘗試采用已報道植物流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞核提取液（Otto、Tris、LB01、WPB提取液和PI試劑盒）測試胡椒屬植物，均不能得到滿意效果，因此，明確適合胡椒屬植物流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞核提取液及測定方法對胡椒屬植物基因組大小研究至關(guān)重要。

本研究發(fā)現(xiàn)，與Otto、Tris、LB01、WPB提取液和PI試劑盒相比較，以改良提取液為細(xì)胞核提取液檢測胡椒屬植物時，噪音峰能夠與信號峰較好分離，碎片相對較少，CV值也符合流式細(xì)胞術(shù)分析要求，是適合胡椒屬植物基因組大小測定的細(xì)胞核提取液。本研究選用的6種提取液配方差異較大，以改良提取液檢測胡椒屬植物效果最好，LB01提取液效果次之。比較改良提取液和LB01提取液配方發(fā)現(xiàn)，二者共有的成分有Tritonx-100、Cl-和Tris，改良提取液特有的成分是NaHSO3，而LB01提取液特有的成分是spermine·4HCl。分析另外3種已知配方提取液發(fā)現(xiàn)，Tritonx-100、Cl-和Tris這3種成分在Tris和WPB提取液中也同時存在。說明NaHSO3和spermine·4HCl可能適用于作為胡椒屬植物流式細(xì)胞術(shù)檢測的提取液配方，尤其是NaHSO3更適合，當(dāng)然，它們需與其他成分相互作用才能更好地發(fā)揮作用。本研究只測試了改良提取液在胡椒屬植物中的應(yīng)用，還適用于哪些植物需要進(jìn)一步試驗證明。

分析不同種質(zhì)信號峰檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同種質(zhì)檢測出信號峰的難易程度差異較大。如：熱引1號胡椒在2種提取液中能檢測出完整信號峰，3種提取液中能檢測的信號峰不能與噪音峰分離；黃花胡椒除在改良提取液中能檢測出完整信號峰，其他的均不能；而墨西哥胡椒在4種提取液中均能檢測出完整信號峰，另外2種的信號峰不能與噪音峰分離。說明利用流式細(xì)胞術(shù)檢測胡椒屬內(nèi)不同種資源時也具有特異性，這可能與不同種資細(xì)胞內(nèi)次生代謝物質(zhì)不同有關(guān)。

本研究選用的栽培種胡椒有7份。古晉、Aman和EMAS胡椒都是馬來西亞育成品種，其中EMAS胡椒是由Balancotta（印度品種）和古晉雜交并回交選育而成，Aman胡椒是由從哥斯達(dá)黎加引種的品種CATIERow1-1的無性系選育而來[21]。經(jīng)測試發(fā)現(xiàn)，古晉、Aman和EMAS胡椒的基因組大小分別為708.31、667.94、719.32Mb；熱引1號是由從印度尼西亞引種的品種南榜的無性系經(jīng)長期選育而來，班尼約爾1號是從印度引進(jìn)的品種，73F5是熱引1號和班尼約爾1號的雜交后代，柬埔寨小葉種是從柬埔寨引進(jìn)的小葉種胡椒品種。熱引1號、柬埔寨小葉種、班尼約爾1號和73F5的基因組大小分別為759.69、759.69、770.70、785.38Mb。綜上可見，本研究中測定的7份栽培種胡椒的基因組大小存在差異。JOSE等[14]報道栽培種班尼約爾1號、Cheriakaniakadan和Karimunda的總?cè)旧w長度分別為67.04、51.48、56.66μm，因此不同栽培種之間基因組大小也會存在差異。本研究中，來源于馬來西亞的品種與來源于印度尼西亞、印度、柬埔寨的品種基因組大小也具有差異。

JOSE等[14]認(rèn)為胡椒屬資源的染色體基數(shù)是n=13（P.cubeba除外），研究發(fā)現(xiàn)，栽培胡椒、蔞葉、蓽菝和卡瓦胡椒的染色體數(shù)分別為2n=4x=52、2n=2x=52、2n=2x=52和2n=10x=130[14，22-23]。本研究測定卡瓦胡椒基因組大小大于900Mb，明顯大于另外3種染色體數(shù)為52的種質(zhì)，此外，石楠藤和山蒟的基因組也大于900Mb，依據(jù)前面結(jié)論推測石楠藤和山蒟的染色體條數(shù)應(yīng)該是大于52且為13的倍數(shù)[14]。本研究中7份栽培胡椒染色體數(shù)都是52，基因組大小范圍為667.94～785.38Mb，SAMUEL等[22]研究中報道，3份染色體數(shù)為52的種質(zhì)（P.nigrum、P.ornatum和P.porphyrophyllum）染色體長度為52.32～72.18μm，其中P.nigrum的染色體長度最長，推斷基因組大小在600～800Mb范圍內(nèi)的種質(zhì)染色體數(shù)可能也是52條。雜交種是一個未知種，從表型和進(jìn)化上來看，該種具有與栽培胡椒和黃花胡椒相近的表型，本研究發(fā)現(xiàn)，其基因組大小幾乎等于栽培胡椒和黃花胡椒的平均值，因此推測雜交種可能是栽培胡椒和黃花胡椒的雜交后代。