熒光原位雜交和流式細胞術(shù)結(jié)合FISH—FCM對肉食品中腸桿菌科細菌的快速定量檢測

汪沐　謝鵬　唐夢君

摘要：為建立一種新的熒光原位雜交與流式細胞術(shù)相結(jié)合（FISH-FCM）的方法，以快速鑒定肉食品中的腸桿菌科細菌，采用與腸桿菌科細菌16S rRNA保守序列互補的探針Enter1432并驗證其特異性。結(jié)果表明：6種腸桿科細菌與探針Enter1432雜交率均在90%以上，而5種非腸桿菌科細菌與探針雜交率均低于1%；與SN/T 0738—1997《出口食品中腸桿菌科檢驗方法》傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比，F(xiàn)ISH-FCM定量檢測法全程約需4～5 h，檢測8份豬肉樣品中腸桿菌科細菌數(shù)為1.4萬～640萬個/g，4份雞肉樣品中腸桿菌科細菌數(shù)為5.0萬～21萬個/g，檢出率為100%。綜上所述，研究建立的FISH-FCM法可快速檢測肉品中的腸桿菌科細菌，適于食品衛(wèi)生、臨床實驗室推廣使用。

關(guān)鍵詞：熒光原位雜交；流式細胞術(shù)；腸桿菌科；快速定量檢測

中圖分類號： TS207.4 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0336-03

腸桿菌科（Enterobacteriaceae）細菌是一類分布極為廣泛的革蘭氏陰性菌，包括對人致病性較強的埃希菌屬、志賀菌屬、沙門菌屬、耶爾森菌屬細菌[1]。腸桿菌作為歐盟各國食品衛(wèi)生檢查中重要的指標細菌，是國際間食品微生物學實驗室質(zhì)量控制、水平測試的必測項目之一。目前，我國仍以大腸菌群、糞大腸菌群作為食品衛(wèi)生指標菌。以腸桿科菌替代大腸菌群、糞大腸菌群作為檢測指標可消除因后者產(chǎn)氣特性隨檢驗方法、試驗條件不同而造成結(jié)果的不準確性[2]。由于我國農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)管理不當，出口畜禽產(chǎn)品中腸桿菌科細菌檢測超標現(xiàn)象時有發(fā)生，易被歐盟發(fā)達國家市場拒絕，進而形成所謂的貿(mào)易壁壘。我國進出口商檢局經(jīng)過多次修訂，制定了針對畜禽等農(nóng)產(chǎn)品中腸桿菌檢測的行業(yè)標準SN/T 0738—1997《出口食品中腸桿菌科檢驗方法》。該標準以傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)方法為基礎(chǔ)，包括分離培養(yǎng)、生化判定，其步驟繁瑣，時間冗長，工作量大，得到報告結(jié)果通常需要3 d左右。過長的檢驗時間使得生產(chǎn)部門延誤時間，增加成本，造成一定的經(jīng)濟損失，而且無法應(yīng)對緊急情況。因此，各級食品衛(wèi)生防疫部門迫切需要一種快速準確定量檢測腸桿菌的方法。本研究通過利用熒光原位雜交與流式細胞術(shù)相結(jié)合（FISH-FCM）對畜禽肉產(chǎn)品中腸桿菌科細菌進行定量檢測，并與傳統(tǒng)行標方法進行比較，探討FISH-FCM在食品安全衛(wèi)生領(lǐng)域中應(yīng)用的可行性。

1 材料與方法

1.1 待檢樣品

本試驗檢測的8份豬肉樣品、4份雞肉鮮樣品分別隨機取自江蘇省揚州市A、B、C、D等4個不同的農(nóng)貿(mào)市場。

1.2 菌種

本試驗中所采用的部分細菌（大腸桿菌、福氏志賀氏菌、宋氏志賀氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、普通變形桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌）由中國農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所唐夢君老師、龔建森老師提供。

1.3 寡核苷酸探針

根據(jù)Sghir等報道[3]，試驗采用腸桿科細菌特異性探針Enter1432，序列為5′-CTTTTGCAACCCACT-3′。其中5′端由異硫氰酸酯熒光素FITC（Abs/Em=494/520）標記，由寶生物工程（大連）有限公司合成并標記探針。

1.4 FISH-FCM法驗證探針的特異性

將大腸桿菌、福氏志賀氏菌、宋氏志賀氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、普通變形桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、嗜水氣單胞菌、屎腸球菌11種菌株按照常規(guī)劃線培養(yǎng)法獲得單菌落，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將細菌濃度調(diào)整為0.1億個/mL，雜交方法參照Vaahtovuo等的報道[4-5]并有所改進：（1）取200 μL菌液，用等體積8%多聚甲醛溶液于4 ℃固定1 h；（2）固定完畢后，將樣品于12 000 g高速離心10 min，用PBS緩沖液洗滌3次；（3）取 10 μL 固定的菌液，加入85 μL預(yù)熱的雜交緩沖液（0.9 mol/L NaCl，pH值7.2的20 mmol/L Tris-HCl，0.1% SDS）中，加入5 μL 100 ng/μL 探針，50 ℃雜交2 h；（4）在1 mL PBS緩沖液中加入50 μL雜交溶液，渦旋振蕩；（5）將溶液上流式細胞儀（BD FACSCaliburTM，Becton Dickinson，美國），對每個樣品分析2 000 個物體。

1.5 FISH-FCM法檢測樣品

鮮肉樣品前處理步驟同SN/T 0738—1997《出口食品中腸桿菌科檢驗方法》，制備成稀釋10倍的肉樣液。取1 mL肉樣液，80 g低速離心1 min，去除雜質(zhì)。其余雜交方法同上，制備“1.4”節(jié)步驟（5）中的液體，加入10 μL 0.5 mg/mL 碘化丙啶，37 ℃避光孵育20 min。加入50 μL 1 000個/μL熒光微球（CountBringhtTM，Invitrogeon，美國）。混合溶液上樣于流式細胞儀分析，每個樣品分析10 000個物體。

1.6 培養(yǎng)法檢測樣品

按照SN/T 0738—1997《出口食品中腸桿菌科檢驗方法》中相應(yīng)方法檢測樣品。

1.7 試驗方法

用CellQuest Pro軟件（版本5.2.1，Becton Dickinson，美國）分析。在dot plot 圖上，x軸表示雜交結(jié)合熒光探針的目的細菌的熒光強度，y軸表示DNA染料的熒光強度。按照以下公式計算肉樣品中的細菌數(shù)量：

AB×CD×104=測定樣本的細菌濃度。

式中：A為目的細菌所占比例，%；B為熒光微球所占比例，%；C為測定樣本中的熒光的數(shù)量，個；D為測定樣本的體積或質(zhì)量，g/μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 FISH-FCM法驗證探針Enter1432的有效性

由圖1-A可知，目標菌株幾乎未與探針Enter1432結(jié)合，在dot plot散點圖上處于Q4區(qū)域，呈陰性結(jié)果；由圖1-B可知，目標菌株大部分與探針Enter1432結(jié)合，在dot plot散點圖上處于Q3區(qū)域，呈陽性結(jié)果。由表1可知，6種腸桿科細菌與探針Enter1432的雜交率為91.9%～95.7%，而5種非腸桿科細菌與探針的雜交率均低于1%。

2.2 FISH-FCM法與傳統(tǒng)培養(yǎng)法比較檢測肉樣品中的腸桿科細菌

由圖2、表2可知，按照SN/T 0738—1997《出口食品中腸桿菌科檢驗方法》傳統(tǒng)培養(yǎng)方法檢測8份豬肉樣品中腸桿科細菌數(shù)量為0.63萬～53萬CFU/g，4份雞肉樣品中腸桿科細菌數(shù)量為0.10萬～1.5萬CFU/g。用FISH-FCM法檢測8份豬肉樣品中腸桿科細菌數(shù)量為1.4萬～640萬個/g，4份雞肉樣品中腸桿科細菌數(shù)量為5.0萬～21萬個/g。

3 結(jié)論與討論

熒光原位雜交（FISH）法鑒定微生物最初應(yīng)用于醫(yī)學領(lǐng)域[6-8]，熒光素標記的核酸探針可與目的細菌結(jié)合，使其在熒光顯微鏡下顯示出相應(yīng)顏色，該方法具有特異性高、直觀的特點，但是由于通常情況下為保證統(tǒng)計結(jié)果的準確性，操作人員需要選擇多達數(shù)10個視野進行分析，這無疑增加了工作量，降低了試驗效率。流式細胞術(shù)是一種能夠?qū)渭毎蚱渌锪Ｗ舆M行理化、免疫及分子生物學等多參數(shù)性狀檢測的現(xiàn)代分析技術(shù)，具有速度快、精度高、準確性好等優(yōu)點。已有研究將FISH與FCM相結(jié)合用于分析活性淤泥、海水樣品中目標菌群的數(shù)量變化[9-10]。此外，近年來研究人員通過FISH-FCM法分析人體或動物排出糞樣中有害菌、有益菌的數(shù)量變化，以監(jiān)測其健康[11-12]。環(huán)境中的物質(zhì)及人或動物的腸道內(nèi)容物十分復雜，不僅含有大量細菌，還含有許多非細菌物質(zhì)，包括食物殘渣、有機碎屑以及脫落細胞等。雖然目前FISH-FCM尚未被應(yīng)用于食品安全領(lǐng)域的檢測，但是該技術(shù)可應(yīng)用于上述如此復雜成分物質(zhì)的微生物分析檢測，筆者認為對于食品而言，該項技術(shù)應(yīng)該存在較強的可行性，并具有廣闊的應(yīng)用前景。

在本試驗中Enter1432探針與6種腸桿科細菌雜交率均在90%以上，而與非腸桿科細菌的雜交率均在1%以內(nèi)，說明Enter1432探針在鑒定腸桿科細菌上具有較高的特異性，這與前人的研究結(jié)果[4，13]一致。在檢測豬、雞鮮肉樣品中腸桿菌科細菌數(shù)量方面，經(jīng)SN/T 0738—1997《出口食品中腸桿菌科檢驗方法》法檢測發(fā)現(xiàn)，12份樣品中均檢測到腸桿菌科細菌，檢出率為100%，且腸桿菌科細菌數(shù)量在0.1萬～53萬CFU/g 之間，不同樣品檢測結(jié)果差異較大。根據(jù)瑞士聯(lián)邦獸醫(yī)局1981年的標準，生碎肉制品中腸桿科細菌含量的上限是500萬CFU/g，而近年歐盟對豬胴體的腸桿科細菌作出了更加嚴格且上限為3 lg CFU/cm2的規(guī)定，由此可見本試驗中部分樣本腸桿菌科細菌污染較為嚴重。筆者推測，由于本試驗中所采集的鮮肉樣本均來自傳統(tǒng)集市商販，肉品在經(jīng)過屠宰、加工、運輸?shù)雀鱾€環(huán)節(jié)中均存在污染的可能。由于歐盟對動物屠宰過程的衛(wèi)生要求較高，對其加工過程控制進行可追溯且肉品包裝后須急凍處理，從而抑制細菌繁殖，后期肉品多經(jīng)大型超市出售給消費者，而我國目前大多數(shù)以攤販為主要特征的集市貿(mào)易手段在上述各個環(huán)節(jié)中對肉品的衛(wèi)生控制程度不高，細菌的繁殖滋生現(xiàn)象可能較為明顯，因此本試驗采集的肉樣品存在較高的腸桿菌科細菌檢出率、檢出數(shù)量。

本試驗采用FISH-FCM法檢測肉樣品中的腸桿科細菌數(shù)量值是SN/T 0738—1997《出口食品中腸桿菌科檢驗方法》中相應(yīng)檢測法的8.1～20.7倍。由于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法只針對活的目標細菌，對于已死亡或者弱活力細菌在培養(yǎng)操作過程中無法檢測出，而FISH-FCM法針對目標細菌的DNA進行定量，因此無論細菌的生存狀態(tài)如何，其均能被檢測出。其次，由于單個細菌、若干同類細菌在培養(yǎng)過程中均能形成單一菌落，而FISH-FCM針對的是細菌數(shù)?；谏鲜鲈?，F(xiàn)ISH-FCM法檢測出的細菌數(shù)要比培養(yǎng)法檢測出的菌落數(shù)高。

綜上所述，鑒于傳統(tǒng)的培養(yǎng)法耗時長、工作量大的特點，本研究建立的FISH-FCM法可快速檢測肉品中的腸桿菌科細菌，適于食品衛(wèi)生和臨床實驗室推廣使用。

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