密度梯度離心法和紅細(xì)胞裂解法對小鼠外周血淋巴細(xì)胞表面分子表達(dá)的影響

周揚(yáng)++鐘銳華++唐利波

[摘要] 目的 比較密度梯度離心法和全血紅細(xì)胞裂解法對小鼠外周血淋巴細(xì)胞表面分子表達(dá)的影響。方法 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測密度梯度離心法和全血紅細(xì)胞裂解法獲得的小鼠外周血存活淋巴細(xì)胞比例以及表型分子（CD3、CD4、CD8、CD19和CXCR5）的頻數(shù)。 結(jié)果 密度梯度離心法獲得的小鼠外周血存活淋巴細(xì)胞比例較全血紅細(xì)胞裂解法獲得的存活淋巴細(xì)胞顯著升高（92.70% vs 85.90%，P<0.05）。與密度梯度離心法相比，全血紅細(xì)胞裂解法可使外周血淋巴細(xì)胞中CD3、CD4和CD8表達(dá)顯著下降（60.10% vs 35.90%，P<0.05；42.90% vs 20.30%，P<0.05；24.60% vs 14.80%，P<0.05），而CD19和CXCR5表達(dá)則顯著升高（12.80% vs 35.30%，P<0.05；15.00% vs 35.10%，P<0.05）。結(jié)論 密度梯度離心法獲得的小鼠外周血淋巴細(xì)胞活力強(qiáng)且表型穩(wěn)定，可作為分離此類細(xì)胞的優(yōu)選方法。

[關(guān)鍵詞] 流式細(xì)胞術(shù)；小鼠外周血；淋巴細(xì)胞；密度梯度離心法；全血紅細(xì)胞裂解法

[中圖分類號] R446 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-0742（2017）05（b）-0031-03

[Abstract] Objective To compare the effect of density gradient centrifugation and red blood cell lysis method on the expression of peripheral blood lymphocytes surface molecules in rats. Methods The frequency of survival lymphocyte ratio and surface molecules （CD3， CD4， CD8， CD19 and CXCR5） in rats were tested by the density gradient centrifugation and red blood cell lysis method. Results The peripheral blood survival lymphocytes ratio tested by the density gradient centrifugation was obviously increased compared with that of red blood cell lysis method （92.70% vs 85.90%，P<0.05）， and the red blood cell lysis method could make the CD3， CD4 and CD8 in the peripheral blood lymphocytes obviously decreased compared with that of density gradient centrifugation （60.10% vs 35.90%， P<0.05； 42.90% vs 20.30%，P<0.05；24.60% vs 14.80%， P<0.05）， but the expressions of CD19 and CXCR5 obviously increased （12.80% vs 35.30%， P<0.05； 15.00% vs 35.10%， P<0.05）. Conclusion The vigor of peripheral blood lymphocytes of rats obtained by the density gradient centrifugation is strong with steady phenotype， which can be used as the preferred method in isolating this type of cells.

[Key words] Flow cytometry； Peripheral blood of rats； Lymphocytes； Density gradient centrifugation； Red blood cell lysis method

小鼠全血樣品制備的質(zhì)量可影響流式細(xì)胞術(shù)免疫檢測的結(jié)果，目前在臨床和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究中廣泛應(yīng)用商品化紅細(xì)胞裂解液以達(dá)到去除紅細(xì)胞的效果。雖然既往報道商品化紅細(xì)胞裂解液對小鼠淋巴細(xì)胞表面分子表達(dá)無影響[1]，但人群中研究顯示紅細(xì)胞裂解液會影響造血干細(xì)胞CD34表達(dá)[2]。該研究采用密度梯度離心法和全血紅細(xì)胞裂解法制備小鼠外周血淋巴細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測這兩種方法獲得的淋巴細(xì)胞的活力以及表面分子表達(dá)頻數(shù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

小鼠淋巴細(xì)胞分離液（貨號：LTS1092），Live/Dead（貨號：L10119），BD Pharm LyseTM溶液（10x，貨號：555899）、抗鼠CD3（貨號：555275）、抗鼠CD4（貨號：553651）、抗鼠CD8-PECY7（貨號：552877）、抗鼠CD19（貨號：552854）、抗鼠 CXCR5（貨號：560615）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

野生型C57 BL/6小鼠（6～8周齡）15只。

1.3 制備小鼠淋巴細(xì)胞懸液

小鼠眼眶靜脈叢取300 μL肝素鈉抗凝血，200 μL用于密度梯度離心法制備細(xì)胞懸液，100 μL用紅細(xì)胞裂解液制備細(xì)胞懸液。

1.4 細(xì)胞活力檢測

取100 μL細(xì)胞懸液恒溫孵箱培養(yǎng)3 d后，采用Live/Dead染色，流式檢測細(xì)胞活力。

1.5 細(xì)胞免疫表型檢測

取1×106 個細(xì)胞采用Live/Dead染色后，加入CD3、CD4、CD8、CD19和CXCR5流式抗體，避光孵育30 min，1 mL PBS洗滌后棄上清，100 uL PBS重懸，流式檢測。

1.6 統(tǒng)計方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行處理。組間比較采用兩獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 密度梯度離心法獲得的淋巴細(xì)胞活力較好。

采用AIM-V培養(yǎng)外周血免疫細(xì)胞3 d，標(biāo)記Live/Dead后采用流式檢測。結(jié)果表明，與密度梯度離心獲得的淋巴細(xì)胞相比，全血紅細(xì)胞裂解獲得的淋巴細(xì)胞活力顯著降低（85.90% vs 92.70%，P<0.05），可見紅細(xì)胞裂解法獲得的淋巴細(xì)胞活力欠佳，不適宜于體外長期培養(yǎng)，見圖1。

2.2 淋巴細(xì)胞表面分子表達(dá)頻數(shù)的檢測

密度梯度離心法和全血紅細(xì)胞裂解法獲得的淋巴細(xì)胞標(biāo)記CD3、CD4、CD8、CD19以及CXCR5，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與密度梯度離心法相比較，全血紅細(xì)胞裂解法獲得的外周血淋巴細(xì)胞CD3、CD4和CD8表達(dá)頻數(shù)顯著下降（60.10% vs 35.90%，P<0.05；42.90% vs 20.30%，P<0.05；24.60% vs 14.80%，P<0.05；圖2），而CD19和CXCR5表達(dá)頻數(shù)則顯著升高（12.80% vs 35.30%，P<0.05；15.00% vs 35.10%，P<0.05；見圖2）。

3 討論

動態(tài)檢測小鼠外周血淋巴細(xì)胞的表型和功能對于了解小鼠體內(nèi)免疫應(yīng)答狀況具有重要參考價值。小鼠外周血淋巴細(xì)胞的檢測結(jié)果可受抗體類型、圈門策略以及熒光素等因素的影響[3-4]，另外，獲得淋巴細(xì)胞的分離方法也可對檢測結(jié)果產(chǎn)生直接影響[5-6]。

細(xì)胞亞群的功能檢測對于了解體內(nèi)免疫狀態(tài)和探討機(jī)制有著重要意義，而細(xì)胞活力是檢測的先決條件[7-8]。該研究結(jié)果顯示紅細(xì)胞裂解液所獲得的細(xì)胞培養(yǎng)3 d后活細(xì)胞比例雖然可維持在80%左右，但較密度梯度離心法所得細(xì)胞的活力已明顯下降?？梢姡t細(xì)胞裂解液會導(dǎo)致淋巴細(xì)胞活力下降，此影響在細(xì)胞長期培養(yǎng)時更加明顯。紅細(xì)胞裂解液除了影響淋巴細(xì)胞活力，重要的是其會導(dǎo)致淋巴細(xì)胞亞群比例偏倚，表現(xiàn)為T細(xì)胞亞群比例下降而B細(xì)胞亞群比例升高。該研究中使用紅細(xì)胞裂解液獲得的小鼠外周血淋巴細(xì)胞CD3、CD4和CD8分子表達(dá)中位數(shù)分別為35.90%、20.30%以及14.80%，和既往研究相一致[1]。雖然此試劑不含有固定劑成分，但其在裂解紅細(xì)胞同時可能也會干擾淋巴細(xì)胞表面分子的表達(dá)，因此細(xì)胞亞群表達(dá)比例失調(diào)將會對免疫分析產(chǎn)生不可忽視的影響。相對而言，小鼠淋巴細(xì)胞分離液獲取的外周血淋巴細(xì)胞是應(yīng)用密度梯度離心法，此方法獲得的淋巴細(xì)胞表面抗原表達(dá)受外源性物質(zhì)干擾較小，更能真實(shí)反映各個細(xì)胞亞群的特點(diǎn)。

綜上所述，該研究認(rèn)為小鼠外周血淋巴細(xì)胞抗原表達(dá)的檢測應(yīng)慎重選擇使用紅細(xì)胞裂解液。密度梯度離心法獲得的淋巴細(xì)胞長時間體外培養(yǎng)仍具有較強(qiáng)活力且各細(xì)胞亞群表型穩(wěn)定，密度梯度離心法可作為小鼠外周血淋巴細(xì)胞分離的優(yōu)選方法應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究。

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（收稿日期：2017-02-09）