免疫性血小板減少癥患者外周血淋巴細(xì)胞亞群變化的研究

王志強(qiáng)

[摘要] 目的 研究免疫性血小板減少癥（ITP）患者外周血淋巴細(xì)胞亞群的變化，探討其在疾病診斷、治療與預(yù)后方面的作用。 方法 以2012年1月～2014年1月鄂爾多斯市中心醫(yī)院血液科收治的78例ITP患者作為ITP組，同時(shí)選擇30例健康體檢者作為對(duì)照組。檢測(cè)兩組外周血淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)值和血小板計(jì)數(shù)，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果 ITP組與對(duì)照組比較，CD3+ T細(xì)胞、CD3+CD4+ T細(xì)胞、CD4+/CD8+ T細(xì)胞比值、CD16+56+ NK細(xì)胞絕對(duì)值降低，CD3+CD8+ T細(xì)胞、CD19+ B細(xì)胞絕對(duì)值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；ITP組治療后淋巴細(xì)胞亞群的變化早于血小板的變化。 結(jié)論 淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)對(duì)ITP的輔助診斷及治療效果的評(píng)估有較好的應(yīng)用價(jià)值。

[關(guān)鍵詞] 免疫性血小板減少癥；淋巴細(xì)胞亞群；流式細(xì)胞術(shù)

[中圖分類號(hào)] R446.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2015）08（c）-0120-03

[Abstract] Objective To study the changes of peripheral blood lymphocyte subsets in patients with immune thrombocytopenia and to discuss the role in the diagnosis，treatments and prognostic. Methods 78 patients with immune thrombocytopenia reduction who were treated in the department of hematology of erdos central hospital from January 2012 to January 2014 were selected as ITP group.At the same time，30 healthy subjects were chosen as control group.The absolute value of peripheral blood lymphocyte subsets and the platelet counts between two groups was detected respectively.The statistical analysis was performed by SPSS 13.0 statistical software. Results Compared with ITP group and the control group，the number of CD3+ T cells，CD3+CD4+ T cells，CD4+/CD8+ T cells and CD16+56+ NK cells was decreased respectively，while the number of CD3+CD8+ T cells and CD19+ B cells was increased respectively，with statistical difference（P<0.05）.The changes in ITP group after treatment was earlier in lymphocyte subsets than platelet. Conclusion The detection of lymphocyte subsets has good application values for diagnosis and evaluation of the effect on the treatment to immune thrombocytopenia.

[Key words] Immune thrombocytopenia；Lymphocyte subsets；Flow cytometry

免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenia，ITP）是以外周血血小板計(jì)數(shù)減少、骨髓巨核細(xì)胞數(shù)目正?；蛟龆唷⒀獕K收縮不良、出血時(shí)間延長(zhǎng)為主要特點(diǎn)的一種疾病。年發(fā)病率為0.25萬(wàn)～0.50萬(wàn)，高發(fā)年齡約為5歲[1]，一年四季均可發(fā)病，性別無(wú)明顯差異。關(guān)于ITP的病因，國(guó)內(nèi)外學(xué)者大多認(rèn)為其與發(fā)病前期的感染和（或）疫苗接種密切相關(guān)。Cines等[2]研究認(rèn)為，ITP患兒發(fā)病前1～4周，通常有病毒感染史，如流行性腮腺炎、水痘、風(fēng)疹、麻疹等。雖然誘發(fā)ITP發(fā)生的病因至今尚未明確，近年越來(lái)越多的研究表明，ITP患者除了體液免疫異常外，還存在細(xì)胞免疫的異常，尤其與T淋巴細(xì)胞亞群、細(xì)胞因子表達(dá)及功能改變有密切聯(lián)系[3]。本研究通過(guò)對(duì)免疫性血小板減少患者外周血淋巴細(xì)胞亞群的變化進(jìn)行分析，探討其在疾病診斷、治療效果評(píng)估方面的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

ITP組：選擇2012年1月～2014年1月鄂爾多斯市中心醫(yī)院血液科收治的78例免疫性血小板減少患者，其中男50例，女28例，年齡2～74歲，均為初次發(fā)病，診斷依據(jù)為張之南第3版《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》。對(duì)照組：選擇30例鄂爾多斯中心醫(yī)院體檢中心無(wú)任何過(guò)敏史的健康者作為對(duì)照組，其中男19例，女11例，年齡19～80歲。

1.2 儀器與試劑

淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)值測(cè)定用單克隆四色抗體（MultiTEST CD3/CD8/CD45/CD4，CD3/CD16+56/CD45/CD19，美國(guó)BD）；溶血素（FACS Lysing Solution，美國(guó)BD）；低速離心機(jī)（KD640，科大創(chuàng)新股份有限公司）；螺旋震蕩器（TW3，姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司）；流式細(xì)胞儀（FACS Calibur，美國(guó)BD）；微量移液器（20 μl；200 μl；1000 μl，德國(guó)VITLAB）；絕對(duì)值計(jì)數(shù)管（美國(guó)BD）；5分類全自動(dòng)血液分析儀（Sysmex XE5000，日本希森美康）。

1.3 標(biāo)本采集

ITP組和對(duì)照組的檢測(cè)標(biāo)本均在空腹?fàn)顟B(tài)下無(wú)菌采集外周靜脈血，EDTA抗凝，無(wú)凝血、溶血，每管2 ml（2管），室溫存放（20～25℃），分別用作血小板計(jì)數(shù)和淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)值的檢測(cè)，在4 h內(nèi)完成檢測(cè)。

1.4 方法

1.4.1 治療前兩組淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè) 診斷為ITP的78例患者治療前空腹采集2 ml EDTA抗凝靜脈血檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)值計(jì)數(shù)。取2支淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)值計(jì)數(shù)專用試管，編號(hào)為1、2號(hào)。用反向加樣的方式用微量移樣器在1、2號(hào)管加入抗凝全血各50 μl，然后在1號(hào)管中加入20 μl MultiTEST CD3/CD8/CD45/CD4，2號(hào)管中加入20 μl MultiTEST CD3/CD16+56/CD45/CD19，螺旋震蕩儀上充分混勻，室溫下避光孵育15 min。然后在1、2號(hào)管各加入溶血素450 μl，充分混勻，避光裂解10 min紅細(xì)胞。最后上機(jī)檢測(cè)。對(duì)照組的淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)方法同ITP組。

1.4.2 治療后ITP組血小板與淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè) ITP組的78例患者治療后10 d、20 d、1個(gè)月分別采集2管EDTA抗凝靜脈血。一管用流式細(xì)胞儀檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)值，另一管用五分類全自動(dòng)血液分析儀檢測(cè)血小板計(jì)數(shù)。按照治療標(biāo)準(zhǔn)選出治療有效的患者進(jìn)行研究。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，正態(tài)分布的測(cè)得值均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，符合正態(tài)分布的兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療前兩組淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)值的比較

ITP組與正常對(duì)照組之間淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)值比較，CD3+ T細(xì)胞、CD3+CD4+ T細(xì)胞、CD16+56+ NK細(xì)胞減少，CD4+/CD8+ T細(xì)胞比值降低、CD3+CD8+ T細(xì)胞、CD19+ B細(xì)胞增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

2.2 治療后ITP組血小板與淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)值計(jì)數(shù)的比較

根據(jù)臨床診斷與療效標(biāo)準(zhǔn)，78例ITP患者1個(gè)月后治療有效的為63例。63例患者治療10 d時(shí)，血小板計(jì)數(shù)與入院時(shí)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)值計(jì)數(shù)中CD3+ T細(xì)胞、CD3+CD4+ T細(xì)胞、CD4+/CD8+ T細(xì)胞比值升高，CD3+CD8+ T細(xì)胞降低，與入院時(shí)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表2）。

3 討論

ITP是一種獲得性免疫紊亂所導(dǎo)致的以單純性血小板減少為特征的疾病，外周血小板計(jì)數(shù)<100×109/L[4]，關(guān)于ITP的病因及發(fā)病機(jī)制至今尚未明確，但近年來(lái)隨著免疫學(xué)的發(fā)展、各種抗體的發(fā)現(xiàn)，更多的淋巴細(xì)胞表面標(biāo)記檢測(cè)越來(lái)越方便。長(zhǎng)期以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者認(rèn)為單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)中體液免疫介導(dǎo)的血小板破壞增加、骨髓巨核細(xì)胞功能異常使血小板降低[5-8]。Roark JH等[9-12]研究表明，抗血小板抗體是通過(guò)抗原驅(qū)動(dòng)誘導(dǎo)和體細(xì)胞突變導(dǎo)致有限數(shù)量的B細(xì)胞克隆增值而產(chǎn)生。

流式細(xì)胞術(shù)（FCM）因其具有采血量少、靈敏、快速及重復(fù)性好等特點(diǎn)，使國(guó)內(nèi)外大量研究采用此種方式檢測(cè)免疫性血小板抗體減少并應(yīng)用于臨床。隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)除體液免疫外，細(xì)胞免疫在ITP的發(fā)病機(jī)制中的作用也不容忽視，一系列研究證實(shí)，B細(xì)胞產(chǎn)生抗血小板抗體的免疫過(guò)程需要抗原特異性CD4+ T細(xì)胞的協(xié)助，因此T細(xì)胞可能也參與了ITP疾病的發(fā)生。Kuwana等[13]通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，在一些ITP患者中，T細(xì)胞在GPⅡb/Ⅲa受體碎片暴露的情況下可刺激抗體的合成，而對(duì)于天然蛋白質(zhì)并不會(huì)出現(xiàn)此現(xiàn)象。BORNE等[14]研究認(rèn)為，CD4+ T細(xì)胞的降低也可促進(jìn)自身反應(yīng)性B細(xì)胞的增值，產(chǎn)生血小板抗體，破壞血小板，提示ITP的發(fā)病機(jī)制可能既存在淋巴細(xì)胞表型的異常，又存在著淋巴細(xì)胞功能的異常。CD4+ T細(xì)胞具有輔助、誘導(dǎo)細(xì)胞及體液免疫的作用，CD8+ T細(xì)胞對(duì)細(xì)胞及體液免疫起抑制作用，因此CD4+/CD8+ T細(xì)胞比值是免疫功能狀態(tài)重要的檢測(cè)指標(biāo)，李美玲等[15]認(rèn)為，其比值的降低與免疫系統(tǒng)損傷的程度相關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)中，ITP組與對(duì)照組比較，CD4+/CD8+ T細(xì)胞比值下降，同時(shí)CD4+ T細(xì)胞絕對(duì)值數(shù)也有不同程度的降低，與研究報(bào)道較符合。研究表明NK細(xì)胞對(duì)B細(xì)胞有抑制分化的作用，還能調(diào)理抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用和吞噬作用。本實(shí)驗(yàn)中ITP組較對(duì)照組NK細(xì)胞絕對(duì)值數(shù)下降，提示其對(duì)B細(xì)胞的抑制分化作用能力下降，從而使B細(xì)胞異?；罨l(fā)生過(guò)強(qiáng)的免疫反應(yīng)。在本實(shí)驗(yàn)中，ITP組的淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)值計(jì)數(shù)與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)值計(jì)數(shù)可以輔助診斷ITP。同時(shí)治療有效的ITP患者外周血淋巴細(xì)胞亞群中CD3+ T細(xì)胞、CD3+CD4+ T細(xì)胞、CD3+CD8+ T細(xì)胞、CD4+/CD8+ T細(xì)胞比值的改變均早于血小板計(jì)數(shù)，在臨床上對(duì)于ITP的預(yù)后判斷優(yōu)于血小板計(jì)數(shù)。

綜上所述，細(xì)胞免疫與體液免疫紊亂在ITP發(fā)病中發(fā)揮重要作用，淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)值計(jì)數(shù)對(duì)ITP的輔助診斷和預(yù)后優(yōu)于血小板計(jì)數(shù)。血小板計(jì)數(shù)和淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)值檢測(cè)的聯(lián)合應(yīng)用對(duì)ITP的診斷及療效評(píng)估有較好的實(shí)用價(jià)值，在治療上應(yīng)注意糾正免疫失衡，運(yùn)用免疫調(diào)節(jié)手段治療ITP。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Bennett J.Acquired platelet function defects[M].Cambridge：J Vermylen Cambridge University Press，2002：689-706.

[2] Cines DB，Blanchetie VS.Immune thrombocytopenic purpura[J].N Engl J Med，2002，346（13）：995-1008.

[3] Blair A，Baker CL，Pamphilon DH，et al.Ex vivo expansion of megakaryocyte progenitor cells from normal bone marrow and peripheral blood and from patients with haematological malignancies[J].Br J Haematol，2002，116（4）：912-919.

[4] Provan D，Stasi R，Newland AC，et al.International consensus report on the investigation and management of primary immune thrombocytopenia[J].Blood，2010，115（2）：168-186.

[5] Stasi R，Del Poeta G，Stipa E，et al.Response to B-cell depleting therapy with rituximab reverts the abnormalities of T cell subsets in patients with idiopathic thrombocytopenic purpura[J].Blood，2007，110（8）：2924-2930.

[6] 楊毓，黃兵，郭景慧.肝硬化患者外周血血小板參數(shù)和單核細(xì)胞參數(shù)的變化及臨床意義[J].中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥，2015， 22（15）：106-108.

[7] Rodeghero F，Stasi R，Gernsheimer T，et al.Standardization of terminology，definitions and outcome criteria in immune thrombocytopenic purpura of adults and children：report from an international working group[J].Blood，2009，113（11）：2386-2393.

[8] Neunert CE，Bright BC，Buchanan GR.Severe chronic refractory immune thrombocytopenic purpura during childhood：a survey of physician management[J].Pediatr Blood Cancer，2008，51（4）：513-516.

[9] Roark JH，Bussel JB，Cines DB，et al.Genetic analysis of autoantibodies in idiopathic thrombocytopenic purpura reveals evidence of clonal expansion and somatic mutation[J].Blood，2002，100（4）：1388-1398.

[10] Coopamah MD，Garvey MB，F(xiàn)reedman J，et al.Cellular immune mechanisms in autoimmune thrombocytopenic purpura：An update[J].Transfus Med Rev，2003，17（1）：69-80.

[11] Kumar S，Khadwal A，Verma S，et al.Immune thrombocytopenic purpura due to mixed viral infections[J].Indian J Pediatr，2013，80（5）：421-422.

[12] Imbach P，Khne T，Mlier D，et al.Childhood ITP：12 months follow‐up data from the prospective registry I of the Intercontinental Childhood ITP Study Group（ICIS）[J].Pediatr Blood Cancer，2006，46（3）：351-356.

[13] Kuwana M，Kaburaki J，Kitasato H，et al.Immunodominant epitopes on glycoprotein IIb-IIIa recognized by autoreactive T cells in patients with immune thrombocytopenic purpura[J].Blood，2001，98（1）：130-139.

[14] von dem Borne AE，Helmerhorst FM，van Leeuwen EF，et al.Autoimmune thrombocytopenia：detection of platelet autoantibodies with the suspension immunofluorescence test[J].Br J Haematol，1980，45（2）：319-327.

[15] 李美玲，楊林花，朱鐳，等.流式細(xì)胞術(shù)研究特發(fā)性血小板減少性紫癜患者血小板相關(guān)抗體[J].臨床血液學(xué)雜志，2007，20（4）：210-212.

（收稿日期：2015-03-12 本文編輯：王紅雙）