兒童急性淋巴細(xì)胞白血病微小殘留病的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分析

陳彥明　戴鳳燕

[摘要] 目的 探討流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)微小殘留病（MRD）在兒童急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL）治療中的臨床價(jià)值。 方法 用多種四色熒光抗體組合檢測(cè)50例正常兒童骨髓，據(jù)此建立雙參數(shù)點(diǎn)圖分析模型，500例ALL初發(fā)患兒行流式細(xì)胞分析，選出異于正常骨髓細(xì)胞免疫表型組合來檢測(cè)MRD，根據(jù)確定好的免疫表型組合對(duì)105例患兒誘導(dǎo)治療結(jié)束及后續(xù)治療中的骨髓標(biāo)本行MRD監(jiān)測(cè)，同步行細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)和PCR檢測(cè)。 結(jié)果 流式細(xì)胞術(shù)檢出462例有效MRD免疫表型組合，PCR檢出142例判斷MRD的融合基因或IgH/T淋巴細(xì)胞受體基因重排；細(xì)胞形態(tài)學(xué)對(duì)誘導(dǎo)治療后的患兒的MRD陽性檢出率為66.67%，流式細(xì)胞術(shù)的MRD陽性檢出率為91.43%。 結(jié)論 流式細(xì)胞術(shù)能對(duì)ALL患兒治療期間的MRD作出準(zhǔn)確評(píng)估，具有較好的覆蓋面和敏感性，值得臨床應(yīng)用。

[關(guān)鍵詞] 急性淋巴細(xì)胞白血??；微小殘留?。涣魇郊?xì)胞術(shù)

[中圖分類號(hào)] R733.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1674-4721（2014）02（a）-0171-03

急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphoblastic leuke- mia，ALL）嚴(yán)重影響患兒健康發(fā)育，3～4歲是其高發(fā)年齡，發(fā)熱、貧血、肝脾腫大等是其早期癥狀。臨床報(bào)道指出個(gè)體化治療對(duì)ALL患者尤為重要[1]，治療強(qiáng)度應(yīng)當(dāng)同其復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)相適應(yīng)。微小殘留?。╩inimal residual disease，MRD）是經(jīng)過誘導(dǎo)化療或骨髓移植治療后體內(nèi)仍殘留的白血病細(xì)胞形態(tài)，它是誘發(fā)白血病復(fù)發(fā)的根源，逐漸被納入指導(dǎo)個(gè)體化治療的關(guān)鍵性指標(biāo)[2]。目前聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和流式細(xì)胞術(shù)是MRD兩種檢查方法，本研究探討分析流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MRD在兒童ALL治療中的臨床價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機(jī)選取2009年1月～2012年12月于本院接受誘導(dǎo)緩解治療的500例ALL患兒，男性296例，女性204例，年齡1～8歲，平均（4.2±1.2）歲，上述病例經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)等方法確診，B淋巴細(xì)胞白血病465例，T淋巴細(xì)胞白血病35例。同期行健康檢查的正常兒童50例，男性28例，女性22例，年齡1～10歲，平均（4.5±1.5）歲。

1.2 儀器和試劑

主要儀器：O-Rid Cycler定量PCR儀（美國(guó)Bio-Rid公司），F(xiàn)ACSCalibur 型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；D10-藻紅蛋白（PE）、CD22-TC、CD13-異硫氰酸熒光素（FITC）、CD38-FITC、CD33-FITC、CD66c（KOR-SA3544）-FITC、CD58-FITC、透膜劑IntraPrep（法國(guó)Immunotech公司）；CD45-FITC、CD19-APC、CD33-APC、CD5-PE、CD34-PerCP、HLA-DR-APC、CD3-PerCP、溶血?jiǎng)〧ACSLysing（美國(guó)Becton Dickin-son公司）；TdT-FITC（美國(guó)Supertechs公司）。

1.3 檢測(cè)方法

采集50例正常兒童的骨髓細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)運(yùn)用多種四色熒光抗體組合進(jìn)行檢測(cè)，建立其雙參數(shù)點(diǎn)圖分析模型，所得結(jié)果同文獻(xiàn)[3-4]相符。根據(jù)正常兒童的雙參數(shù)點(diǎn)圖分析模型對(duì)500例ALL初發(fā)患兒行流式細(xì)胞分析，比較兩者的免疫表型組合的差異，選出異于正常骨髓細(xì)胞免疫表型組合來檢測(cè)MRD，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行存檔。從中選取誘導(dǎo)治療結(jié)束及后續(xù)治療的患兒的骨髓標(biāo)本（105例）行流式細(xì)胞術(shù)，調(diào)用先前存檔比較相同病例的數(shù)據(jù)，雙參數(shù)點(diǎn)圖原白血病細(xì)胞位置仍出現(xiàn)細(xì)胞則可判定白血病殘留細(xì)胞，殘留細(xì)胞占骨髓有核細(xì)胞總數(shù)比例記為MRD檢測(cè)值。500例患兒同時(shí)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查和PCR檢查，按照儀器操作說明進(jìn)行，將結(jié)果同流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

流式細(xì)胞術(shù)檢出462例有效MRD免疫表型組合，PCR檢出142例判斷MRD的融合基因或IgH/T淋巴細(xì)胞受體基因重排，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；細(xì)胞形態(tài)學(xué)對(duì)誘導(dǎo)治療后的患兒的MRD陽性檢出率為66.67%，35例未檢測(cè)出MRD，流式細(xì)胞術(shù)的MRD陽性檢出率為91.43%，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=19.43，P<0.01）。

3 討論

MRD對(duì)兒童ALL的臨床療效和預(yù)后判定有重要價(jià)值[5]，以往檢測(cè)MRD的方法包括形態(tài)學(xué)檢查、染色體核型分析、熒光原位雜交技術(shù)、異倍體細(xì)胞技術(shù)等，但上述方法的有效覆蓋范圍和敏感性均較差，不適于作為MRD的檢測(cè)手段[6]。隨著科技的發(fā)展，流式細(xì)胞術(shù)和PCR逐漸應(yīng)用于該病灶的檢測(cè)[7]。成年急性非淋巴細(xì)胞白血病的MRD檢測(cè)中，融合基因覆蓋面較廣，體內(nèi)存在也較穩(wěn)定，因此PCR對(duì)其檢測(cè)效果較好[8]，但兒童ALL的融合基因缺乏特異性，單基因的覆蓋面相對(duì)較小，因此其在兒童ALL中的應(yīng)用價(jià)值存在一定的局限性[9]。本次檢測(cè)結(jié)果顯示500例患兒PCR后僅142例檢測(cè)出MRD，流式細(xì)胞術(shù)462例檢測(cè)出MRD，明顯多于PCR，此結(jié)果說明流式細(xì)胞術(shù)具有較廣的覆蓋面。本研究建立了科學(xué)的檢測(cè)方法，通過異常免疫表型特征與正常細(xì)胞間的區(qū)別來檢測(cè)MRD，白血病細(xì)胞的某些抗原表達(dá)質(zhì)和量均存在較大的差異，通過抗原表達(dá)同正常細(xì)胞間的差異就可以對(duì)MRD進(jìn)行區(qū)分[10]，聯(lián)合多種抗原檢測(cè)更增強(qiáng)了兩者間的差異性。本文通過對(duì)105例患兒誘導(dǎo)治療結(jié)束及后續(xù)治療中的骨髓標(biāo)本行MRD監(jiān)測(cè)，進(jìn)一步證實(shí)形態(tài)學(xué)檢查對(duì)MRD的敏感性遠(yuǎn)低于流式細(xì)胞術(shù)，和相關(guān)報(bào)道基本相符[11]。白血病治療過程中部分患者會(huì)發(fā)生抗原表達(dá)改變，因此采取多個(gè)免疫表型組合來檢查MRD能夠較好地避免假陽性[12]。另外需要加強(qiáng)標(biāo)本的處理，對(duì)細(xì)胞數(shù)、抗體量、孵育時(shí)間及離心速度等做到標(biāo)準(zhǔn)化，降低其對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，提高檢出效果[13]。

綜上所述，流式細(xì)胞術(shù)能對(duì)ALL患兒治療期間的MRD作出準(zhǔn)確評(píng)估，具有較好的覆蓋面和敏感性，值得臨床應(yīng)用。

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（收稿日期：2013-12-02 本文編輯：魏玉坡）