不明原因反復(fù)流產(chǎn)患者外周血T淋巴細胞亞群及NK細胞的變化

馬超++馮文華

[摘要]目的 探討原因不明反復(fù)流產(chǎn)（URSA）患者外周血中T淋巴細胞亞群和NK細胞的變化。方法 選取2014年3月～2016年3月遼寧省計劃生育科研院附屬醫(yī)院門診確診為不明原因流產(chǎn)患者50例作為觀察組，并選取同期就診的30例健康早孕婦女作為對照組。采用流式細胞儀檢測兩組婦女的外周血T淋巴細胞亞群和NK細胞水平。結(jié)果 觀察組外周血中CD4+和CD4+/CD8+比率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而兩組CD3+和CD8+比率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。觀察組外周血中NK細胞比率也明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 URSA患者外周血中CD4+、CD4+/CD8+和NK細胞比率的升高，打破了正常的妊娠免疫微環(huán)境而引發(fā)流產(chǎn)。

[關(guān)鍵詞]原因不明反復(fù)流產(chǎn)；T淋巴細胞亞群；自然殺傷細胞；流式細胞術(shù)

[中圖分類號] R714.21 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）04（a）-0087-03

Molecular Genetics Laboratory，Liaoning Province Research Institute of Family Planning，Shenyang 110031，China

[Abstract]Objective To explore the changes of T lymphocytes sub-types and NK cells in patients with unexplained recurrent abortion.Methods The patients were collected in the Liaoning Province Research Institute of Family Planning from March 2014 to March 2016. The 50 patients with URSA were selected as the observation group and 30 patients with voluntary abortion were selected as the control group.Flow cytometry was used to measure the number of T lymphocytes sub-types and NK cells in the two groups.Results The percentages of CD4+ and ratio of CD4+/CD8+ was significantly increased in peripheral blood of unexplained recurrent abortion patients （P<0.05），while there was no significantly differences in CD3+ and CD8+ （P>0.05）.The level of NK cell was also significantly increased in peripheral blood of unexplained recurrent patients（P<0.05）.Conclusion The increasing level of CD4+，CD4+/CD8+ and NK cells in peripheral blood of recurrent abortion patients is harmful to maintain pregnancy even induced abortion.

[Key words]Unexplained recurrent abortion；T lymphocytes sub-types；NK cells；Flow cytometry

反復(fù)自然流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指連續(xù)發(fā)生了2次或2次以上的自然流產(chǎn)，是一種常見的妊娠并發(fā)癥[1]。其主要原因有染色體異常、感染、內(nèi)分泌失調(diào)和凝血異常，而排除這些因素后，其中有40%～80%的患者原因不明，稱為不明原因反復(fù)自然流產(chǎn)（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）[2]。正常妊娠需要母體建立起一個對胎兒局部免疫耐受的環(huán)境，如果免疫微環(huán)境失調(diào)則會導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生[3]。URSA是育齡婦女常見的妊娠并發(fā)癥，已經(jīng)成為困擾育齡婦女和臨床工作者的一大難題，其發(fā)病機制目前尚不清楚。免疫因素在維持正常妊娠起著關(guān)鍵作用，T淋巴細胞亞群及自然殺傷細胞（natural killer，NK）在妊娠免疫中越來越受到重視，本研究通過比較URSA患者與健康早孕婦女外周血中T淋巴細胞亞群和NK細胞比率，探討URSA患者外周血中免疫細胞的變化，同時為URSA患者治療提供理論依據(jù)，避免流產(chǎn)的發(fā)生。

1資料與方法

1.1一般資料

選擇2014年3月～2016年3月于遼寧省計劃生育科研院附屬醫(yī)院門診診斷為URSA患者50例，同期健康早期妊娠并且自愿要求人工流產(chǎn)的患者30例。觀察組50例URSA患者平均年齡（30.12±6.73）歲，平均孕齡（8.01±3.13）周，平均月經(jīng)周期（28.32±3.22）d，平均體重指數(shù)（23.27±3.15）kg/m2。對照組30例早孕婦女中，平均年齡（29.42±5.58）歲，平均孕齡（8.32±3.45）周，平均月經(jīng)周期（29.01±4.73）d，平均體重指數(shù)（23.24±3.14）kg/m2。兩組患者的年齡、孕齡、月經(jīng)周期和體重指數(shù)等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。所有患者在組織收集前均簽署知情同意書并經(jīng)遼寧省計劃生育科研院醫(yī)學(xué)倫理委員會通過。觀察組納入標準：①符合URSA診斷標準：有2次或2次以上的自然流產(chǎn)病史，夫婦雙方染色體正常；②內(nèi)分泌功能正常；③母兒血型不和，抗心磷抗體、抗核抗體均為陰性；④丈夫男科檢查均正常。排除標準：合并生殖道感染、畸形。對照組排除標準：①既往有流產(chǎn)史；②合并內(nèi)分泌、染色體和自身免疫抗體異常；③合并生殖道感染、畸形。

1.2方法

淋巴細胞亞群檢測1.2號管均加入女方全血50 μl，然后于1號管中加入10 μl FITC-CD3/PE-CD8/PerCP-CD45/APC-CD4混合單克隆熒光抗體（BD公司；批號：340503），2號管加入10 μl FITC-CD3/PE-CD16+ CD56/PerCP-CD45/APC-CD19混合單克隆熒光抗體（BD公司；批號：340503），振蕩混勻，室溫避光20 min；加入紅細胞裂解液（BD公司；批號：5154719）1 ml，震蕩混勻，室溫避光10 min；磷酸鹽緩沖液洗1次，500 μl懸液上樣檢測。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗和檢驗分析；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 兩組T淋巴細胞亞群及CD4+/CD8+比率的比較

URSA患者外周血中CD4+細胞百分率和CD4+/CD8+比率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；兩組CD3+和CD8+細胞的百分率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 兩組NK細胞百分率的比較

URSA患者外周血中NK細胞的百分率為（18.09±2.32）%，明顯高于對照組的（14.36±3.21）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

3討論

妊娠是一個復(fù)雜的生理過程，是一個特殊的半同種異體移植過程，主要是母體免疫耐受來維持正常妊娠過程，一但母體與胎兒的免疫平衡被破壞，會造成病理性流產(chǎn)的發(fā)生[4-5]。各種免疫的失衡均可導(dǎo)致URSA：封閉抗體的缺乏、T淋巴細胞亞群的改變、CD4+/CD8+失衡、Th1/Th2失衡、CD56+CD16+/CD56+CD16-NK細胞亞群比例失調(diào)、細胞因子、趨化因子等表達異常[6-8]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，URSA的患者多是免疫狀態(tài)相對異常，其中T淋巴細胞、NK細胞越來越受到關(guān)注。胎兒對于母體而言，屬于同種異體移植物，其抗原不是存在于母體中樞免疫器官內(nèi)，妊娠免疫耐受本質(zhì)主要是外周免疫耐受。根據(jù)T淋巴細胞表面的特征性分子不同，可將成熟T細胞分為兩個亞群，即CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞。CD4+T淋巴細胞可輔助B淋巴細胞轉(zhuǎn)化為淋巴母細胞而產(chǎn)生抗體，CD8+T淋巴細胞抑制這一過程使CD4+T淋巴細胞的作用不至于過強，兩者比例的平衡是維持生理功能正常和免疫反應(yīng)正常應(yīng)答的基礎(chǔ)。URSA與母體的免疫狀態(tài)有很大的相關(guān)性，反復(fù)流產(chǎn)患者表現(xiàn)為免疫系統(tǒng)呈現(xiàn)免疫過度表達的狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，URSA患者外周中CD4+和CD4+/CD8+比率明顯高于正常早孕的婦女，這與以往的研究相符[9-10]。CD4+T淋巴細胞為輔助性T淋巴細胞，其比率升高，使機體免疫功能增強，對胚胎的免疫排斥加強，導(dǎo)致妊娠不能繼續(xù)[11]。正常早孕的婦女外周血中CD4+T淋巴細胞明顯低于非懷孕的健康婦女，說明CD4+T淋巴細胞在外周血中表達降低，是正常妊娠維持的一個必要條件。正常妊娠早期，CD4+/CD8+的比值降低，有利于胚胎免于遭受母體免疫系統(tǒng)的排斥。CD4+/CD8+的比值在正常情況下始終保持著動態(tài)平衡，當二者比例失調(diào)，則會引起免疫紊亂，造成流產(chǎn)的發(fā)生。在URSA患者外周中CD4+/CD8+的比值升高，提示早期流產(chǎn)患者淋巴細胞亞群失調(diào)，細胞免疫功能過度，導(dǎo)致妊娠不能繼續(xù)。當URSA經(jīng)過主動免疫治療后，CD4+/CD8+的比值下降，利于妊娠的維持[12]。

NK細胞存在于先天性免疫系統(tǒng)的一類淋巴細胞，主要分布于外周血中，不需要預(yù)先致敏就能殺傷靶細胞，能產(chǎn)生細胞毒效應(yīng)。NK細胞在妊娠的維持過程中具有重要作用。在胚胎植入和妊娠早期，子宮蛻膜細胞中NK細胞的比例占70%以上，主要對胎兒滋養(yǎng)層細胞產(chǎn)生免疫耐受作用，提供主要的免疫防御作用。子宮蛻膜中的NK細胞與胚胎滋養(yǎng)細胞直接接觸，當其細胞活性過度表達會對胚胎的發(fā)育有害，從而引起胚胎損傷乃至流產(chǎn)的發(fā)生。目前國內(nèi)外研究認為CD56+CD16+T細胞等NK細胞與URSA發(fā)病機制密切相關(guān)[13-14]，外周血高水平的NK細胞預(yù)示著染色體核型正常的妊娠可能發(fā)生生化妊娠或自然流產(chǎn)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)URSA患者相比較正常早孕婦女的外周血中NK細胞比率明顯升高，提示NK細胞參與了URSA的形成。NK細胞可能發(fā)揮作用的機制是NK細胞的殺傷功能啟動，釋放穿孔素及絲氨酸酯酶，導(dǎo)致胚胎的損傷，引發(fā)流產(chǎn)。另外URSA患者外周中NK細胞的增多，改變了細胞因子表達，打破了母胎界面Th1/Th2的平衡，也可以引發(fā)流產(chǎn)[16]。

綜上所述，CD4+、CD4+/CD8+以及NK細胞比率在URSA患者外周血中升高與早期自然流產(chǎn)的發(fā)生相關(guān)，免疫因素是URSA流產(chǎn)的重要原因，筆者以T淋巴細胞亞群和NK細胞為研究URSA疾病的切入點，取得一定的結(jié)果，對臨床URSA的診療具有理論意義和指導(dǎo)價值。

[參考文獻]

[1]張華坤，劉慶芝，謝建生，等.封閉抗體缺失與不同類型復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)關(guān)系分析[J].實用婦產(chǎn)科雜志，2015，31（10）：787-789.

[2]叢林，劉長明，朱立新，等.原因不明復(fù)發(fā)性患者淋巴細胞主動免疫前后亞群的變化[J].中國實用婦科與產(chǎn)科雜志，2012，28（5）：378-380.

[3]Chen JL，Yang JM，Huang YZ，et al.Clinical observation of lymphocyte active immunotherapy in 380 patients with unex？鄄plained recurrent spontaneous abortion[J].Int Immunopharmacol，2016，40：347-350.

[4]吳夢茹，朱玥潔，丁劍冰，等.不明原因自發(fā)流產(chǎn)與免疫細胞失衡的關(guān)系[J].細胞與分子免疫學(xué)雜志，2015，31（8）：1144-1147.

[5]張艷霞，高天暢，李梅清，等.不明原因反復(fù)自然流產(chǎn)婦女蛻膜中樹突狀細胞亞群的變化[J].重慶醫(yī)學(xué)，2015，44（16）：2164-2166.

[6]李曉榮，魏麗娜，王海燕，等.主動免疫治療對URSA患者CD細胞封閉效率及妊娠結(jié)局的影響[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2013，23（9）：2102-2104.

[7]周仕華.復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者T、B淋巴細胞亞群及Th1/Th2指標的變化[J].海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2016，22（7）：686-688.

[8]顧艷，張慧琴.趨化因子及其受體與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)[J].生殖與避孕，2014，34（7）：551-554.

[9]譚秀梅.反復(fù)流產(chǎn)患者外周血T淋巴細胞亞群水平變化研究[J].醫(yī)學(xué)檢驗，2011，18（20）：83.

[10]胡道琴，梁寶珠，陳敏，等.復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者主動免疫治療前后T淋巴細胞亞群的變化[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2013，21（6）：76.

[11]張菱，宮美軒，張亞杰，等.早期自然流產(chǎn)病人外周血T淋巴細胞亞群的檢測[J].齊魯醫(yī)學(xué)雜志，2005，20（4）：324-326.

[12]華月琴，陳瑞華，吳志南，等.主動免疫治療原因不明習慣性流產(chǎn)后外周血免疫球蛋白及淋巴細胞亞群的變化[J].中國婦幼保健，2010，25（19）：2697-2698.

[13]Hosseini S，Zarneni AH，Asgarian-Omran H，et al.Comparative analysis of NK cell subsets in menstrual and peripheral blood of patients with unexplained recurrent spontaneous abortion and fertile subjects[J].J Reprod Immunol，2014，103：9-17.

[14]司斯.不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者外周血T淋巴細胞亞群和NK細胞特征分析[J].臨床軍醫(yī)雜志，2016，44（6）：634-636.

[15]Holmes MA，Li P，Peterdorf EW，et al.Structural studies of allelic diversity of the MHC class I homolog MIC-B，a stress-inducible ligand for the activating immunoreceptor NKG2D[J].Immunol，2002，169（3）：1395-1400.

[16]方志紅，劉華.T淋巴細胞亞群、NK細胞及Th1/Th2細胞因子與先兆流產(chǎn)發(fā)病的關(guān)系[J].江蘇醫(yī)藥，2014，40（9）：1070-1071.

（收稿日期：2017-02-12 本文編輯：任 念）