腦脊液流式細(xì)胞術(shù)在兒童中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病早期診斷中的意義

安美玉+陳芬

[摘要] 目的 探討腦脊液流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）在診斷兒童中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病（Central Nervous System Leukemia，CNSL）中的意義。方法 采用單克隆抗體雙重直接免疫熒光素標(biāo)記法對(duì)2015年1 月—2016 年3月期間該院收治的45例可疑中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤(rùn)患兒的腦脊液進(jìn)行細(xì)胞免疫表型分析，同時(shí)進(jìn)行腦脊液細(xì)胞形態(tài)學(xué)（Conventional Cytology，CC）檢測(cè)，比較兩種方法的差異。結(jié)果 45例患兒中，F(xiàn)CM有15例發(fā)現(xiàn)異常免疫表型，陽(yáng)性率為33.33%，CC發(fā)現(xiàn)9例存在原始幼稚細(xì)胞，陽(yáng)性率為20%，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論 腦脊液FCM在兒童CNSL的診斷中具有重要的臨床意義。

[關(guān)鍵詞] 流式細(xì)胞術(shù)；細(xì)胞形態(tài)學(xué)；腦脊液；中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病

[中圖分類號(hào)] R725.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2016）10（b）-0042-03

[Abstract] Objective To evaluate the value of flow cytometric of cerebrospinal fluid cells in the diagnosis of central nervous system leukemia in children. Methods Used Double immunofluorescence staining with monoclonal antibodies，45 cerebrospinal fluid samples who had central nervous system involvement was analyzed with flow cytometric immunophenotyping and conventional cytology in January 2015 to March 2016，the results of flow cytometry were compared with conventional cytology. Results The results showed that 33.33% children had abnormal cells by flow cytometry and 20% children had abnormal cells by conventional cell morphology in 45 cases。The difference had statistical significance （P < 0.01）. Conclusion Flow cytometriy analysis of cerebrospinal fluid has important clinical significance in the diagnosis of CNSL in children。

[Key words] Flow cytometry；Conventional cytology；Cerebrospinal fluid；Immunophenotyping；Central nervous system leukemia

隨著化療方案的改進(jìn)，我國(guó)兒童急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cutelymphoblastic leukemia，ALL）的療效獲得了顯著改善，兒童ALL誘導(dǎo)緩解率高達(dá)91%～94%，5年無(wú)事件生存（EFS）率達(dá)70%～80%[1-3]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血?。–entral Nervous System Leukemia，CNSL）是導(dǎo)致白血病化療失敗的主要原因之一，如何早期診斷CNSL具有重要意義。該文將對(duì)2015年1月—2016年3月期間45例急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋcute Lymphoblastic Leukemia，ALL）的腦脊液進(jìn)行分析，以研究腦脊液FCM在CNSL診斷中的意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

根據(jù)2014年制定的兒童 ALL診療建議（第四次修訂）為診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，以明確診斷急性淋巴細(xì)胞性白血病的患兒為對(duì)象，方便選取該院收治的臨床疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤(rùn)45例進(jìn)行腦脊液CC及FCM檢測(cè)。符合以下任何一項(xiàng)，并除外其他原因?qū)е碌臉猩窠?jīng)系統(tǒng)病變時(shí)，列為可疑中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤(rùn)病例：①有神經(jīng)系統(tǒng)癥狀；②腦脊液常規(guī)白細(xì)胞計(jì)數(shù)大于5×106 個(gè)/L時(shí)；③頭顱核磁或CT提示影像學(xué)病變。

1.2 腦脊液細(xì)胞常規(guī)計(jì)數(shù)

將留取無(wú)菌新鮮腦脊液標(biāo)本2 mL充入細(xì)胞計(jì)數(shù)板，高倍鏡下計(jì)數(shù)有核細(xì)胞數(shù)。

1.3 腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查

吸取 2～3 mL腦脊液，標(biāo)本離心后涂片，干燥后進(jìn)行瑞氏染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)原始幼稚細(xì)胞則判定結(jié)果陽(yáng)性。

1.4 FCM分析

采用單克隆抗體雙重直接免疫熒光素（FITC/PE）標(biāo)記法。留取2～3 mL新鮮腦脊液于無(wú)菌試管中，離心（1 400 r/min，5 min）后棄上清，留取100 μL，加入相應(yīng)抗體，充分混勻，在室溫、避光條件下孵育15 min，加入1 mL溶血素1 mL，混勻后避光，室溫放置8 min，離心（1 400 r/min，5 min）棄上清，用PBS洗滌細(xì)胞，離心（1 400 r/min，5 min）后，棄上清，加入約3 mL PBS洗滌細(xì)胞，離心后棄上清，加入約100 μL PBS后，震蕩混勻，立即上機(jī)檢測(cè)。流式細(xì)胞儀及所有抗體來(lái)自美國(guó)BD公司。含六種熒光抗體標(biāo)記：FICT、PE、APC、PerCP、APC-Cy7、PE-Cy7。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)表示，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。陽(yáng)性率指所檢查標(biāo)本中陽(yáng)性結(jié)果所占比例。

2 結(jié)果

2.1 45例兒童ALL的臨床特點(diǎn)

可疑中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤(rùn)者45例，所有病例均進(jìn)行FCM及CC檢測(cè)，其中男性28例， 女性17例， 年齡1～18歲，平均年齡（9.09±5.41）歲，其中B系20例，T系25例。45例病例中3例患兒有頭痛、嘔吐表現(xiàn)，44例患兒腦脊液常規(guī)白細(xì)胞計(jì)數(shù)≥5×106個(gè)/L，未發(fā)現(xiàn)頭顱核磁及CT的影像學(xué)改變。兩組檢測(cè)方法在年齡、性別、免疫型、白細(xì)胞計(jì)數(shù)及神經(jīng)系統(tǒng)癥狀方面，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

2.2 FCM與CC兩種方法對(duì)45例ALL腦脊液異常細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果

45例懷疑中樞神經(jīng)系統(tǒng)侵潤(rùn)者的腦脊液細(xì)胞，其中FCM有15例發(fā)現(xiàn)異常免疫表型，其中B系6例，T系9例，陽(yáng)性率為33.33%，CC發(fā)現(xiàn)9例存在原始幼稚細(xì)胞，其中B系3例，T系6例，陽(yáng)性率為20%，兩者檢測(cè)方法的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)表2。

3 討論

兒童CNSL發(fā)病率在2%～10%之間[5]，目前CNSL診斷金標(biāo)準(zhǔn)仍是腦脊液細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)現(xiàn)異常幼稚細(xì)胞，但腦脊液標(biāo)本細(xì)胞數(shù)量少，離體環(huán)境下容易發(fā)生自溶，受主觀經(jīng)驗(yàn)性判斷影響大，容易出現(xiàn)CNSL的誤診及漏診，假陰性率高達(dá)20%～60%[6]，單純依靠腦脊液細(xì)胞學(xué)檢查并不能完全排除CNSL的診斷。FCM的細(xì)胞免疫分型是檢測(cè)微量異常細(xì)胞非常敏感的方法，通過(guò)細(xì)胞表面標(biāo)記片段確定各細(xì)胞群性質(zhì)，受細(xì)胞形態(tài)變化影響小，亦不易受主觀影響，能夠準(zhǔn)確的檢測(cè)惡性腫瘤細(xì)胞，已廣泛用于腦脊液檢查中。

早期CNSL可無(wú)臨床表現(xiàn)、影像學(xué)陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)，甚至腦脊液常規(guī)檢查也無(wú)細(xì)胞數(shù)增高。蔣能剛等[7]報(bào)道，多參數(shù)FCM 分析在細(xì)胞數(shù)量較少情況下，顯示出明顯優(yōu)越性。該次130例腦脊液中，發(fā)現(xiàn)1例細(xì)胞數(shù)為4×106 個(gè)/L的ALL（T系），CC-FCM+發(fā)現(xiàn)異常細(xì)胞群，異常細(xì)胞群占總細(xì)胞的54.14%，表達(dá)CD5。在45例懷疑CNSL的腦脊液中，15例診斷CNSL的病例中白細(xì)胞數(shù)在4～100×106個(gè)/L之間有6例，其中FCM+有4例，CC+有2例。腦脊液白細(xì)胞計(jì)數(shù)越高，形態(tài)學(xué)及FCM越容易發(fā)現(xiàn)異常細(xì)胞，其中細(xì)胞形態(tài)學(xué)更為明顯。而腦脊液白細(xì)胞數(shù)少時(shí)，F(xiàn)CM相較于CC更敏感。此外，有報(bào)道指出[8]，當(dāng)行FCM及CC檢測(cè)時(shí)，CC容易受到FCM結(jié)果影響。該次研究也存在類似問(wèn)題，有2例腦脊液發(fā)現(xiàn)FCM陽(yáng)性結(jié)果后，CC更改了起初陰性結(jié)果的判讀，可見(jiàn)，細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析對(duì)于良惡性細(xì)胞的判斷主觀性仍較強(qiáng)。

腦脊液FCM在CNSL診斷中，具有很高的靈敏度和特異性。Mitri Z等[8]報(bào)道，腦脊液流式細(xì)胞術(shù)和CC的特異性均為100%，但前者的敏感性明顯高于CC，接近100%。Ranta S等[9-11]研究顯示，在高度懷疑中樞神經(jīng)系統(tǒng)侵潤(rùn)的淋巴瘤中，F(xiàn)CM的CNSL檢出率是細(xì)胞形態(tài)學(xué)的2～3倍。該研究對(duì)70例ALL患兒，共130例次腦脊液標(biāo)本進(jìn)行FCM及CC檢測(cè)，其中45例懷疑有CNSL可能，CC陽(yáng)性檢出率為 20%（9/45），F(xiàn)CM的陽(yáng)性檢出率為33.33%（15/45），是CC檢出率的1.67倍，與報(bào)道類似。建議對(duì)懷疑有中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變的患者，在進(jìn)行腦脊液細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)的同時(shí)，進(jìn)行FCM的評(píng)估，以提高早期診斷CNSL的陽(yáng)性率。

綜上所述，腦脊液FCM 的陽(yáng)性檢出率及準(zhǔn)確性明顯高于傳統(tǒng)腦脊液CC方法，對(duì)CNSL的診斷具有極大的應(yīng)用價(jià)值，是診斷CNSL方法的重要補(bǔ)充。由于CNSL發(fā)病率較低，對(duì)于FCM及CC診斷的一致性仍需要今后大樣本進(jìn)一步研究論證。

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（收稿日期：2016-07-16）