芒果MiNAC7基因的表達(dá)模式及在開花和非生物逆境脅迫應(yīng)答中的功能分析

黃星 徐歡歡 黎開獎 何新華 夏黎明 陸婷婷 梁容真 羅聰

關(guān)鍵詞：芒果；MiNAC7；生物信息學(xué)分析；表達(dá)模式；功能研究

NAC（NAM、ATAF1/2和CUC2）基因家族是最大的植物特有轉(zhuǎn)錄因子家族之一，基因成員數(shù)量龐大[1]。隨著全基因組測序技術(shù)日趨完善，目前已發(fā)現(xiàn)絕大部分物種均存在100個(gè)以上的NAC基因數(shù)量[2]。NAC基因在影響植物生長[3]、調(diào)控植株成花[4]、果實(shí)成熟[5-6]、葉片衰老[7]和應(yīng)對非生物脅迫[8-10]等生理過程中發(fā)揮了重要作用。

NAC基因家族參與多種激素調(diào)控途徑和非生物脅迫應(yīng)答過程。NAC基因參與調(diào)節(jié)ABA信號傳導(dǎo)途徑，如：擬南芥AtNAC016可以結(jié)合ABA依賴性脅迫信號通路中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子脫落酸響應(yīng)元件結(jié)合蛋白1基因（AREB1）的啟動子，通過抑制AREB1的轉(zhuǎn)錄來促進(jìn)對干旱脅迫的反應(yīng)[11]；過表達(dá)水稻ONAC022對外源ABA的敏感性增強(qiáng)，與ABA有關(guān)的調(diào)控基因表達(dá)上調(diào)，即水稻ONAC022通過調(diào)節(jié)ABA信號傳導(dǎo)途徑來提高抗旱和耐鹽脅迫能力[12]；陸地棉GhirNAC2直接與GhNCED3a/3c的啟動子結(jié)合，通過調(diào)節(jié)GhNCED-3a/3c表達(dá)來調(diào)節(jié)ABA生物合成和氣孔關(guān)閉，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植物的抗旱性[13]。NAC基因參與調(diào)節(jié)GA信號傳導(dǎo)途徑，如甘蔗ScNAC23直接與DELLA蛋白ScGAI相互作用調(diào)節(jié)GA信號傳導(dǎo)途徑來促進(jìn)甘蔗開花和葉片衰老[14]。NAC基因還參與調(diào)節(jié)生長素和細(xì)胞分裂素等途徑，如水稻OsNAC2基因可以直接結(jié)合IAA和細(xì)胞分裂素（cytokinin，CK）相關(guān)基因的啟動子來調(diào)節(jié)根發(fā)育過程中的細(xì)胞分裂[15]。另外，甘蔗OsNAC14可以直接與DNA修復(fù)系統(tǒng)中同源重組的關(guān)鍵成分OsRAD51A1啟動子之間相互作用，招募參與DNA損傷修復(fù)和防御反應(yīng)的因子來提高耐旱性[8]；梭梭HaNAC1直接與AtNAC32蛋白相互作用來增強(qiáng)抗旱性[16]。

芒果（MangiferaindicaL.）是重要的熱帶水果，適時(shí)開花有利于芒果生產(chǎn)[17]。前期研究中，課題組從芒果成花基因LEAFY的酵母文庫篩選獲得1個(gè)NAC7基因，而NAC轉(zhuǎn)錄因子參與了植物的逆境脅迫應(yīng)答[18]。目前尚不清楚芒果MiNAC7基因是否參與了芒果的成花與逆境脅迫應(yīng)答。因此，本研究對MiNAC7的生物信息學(xué)、表達(dá)模式和基因功能進(jìn)行分析，明確MiNAC7基因在芒果開花和非生物脅迫中的功能。

1材料與方法

1.1材料

本研究所用芒果品種為四季蜜芒（MangiferaindicaL.cv.SiJiMi），該芒果品種生長于廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院標(biāo)本園中。用于時(shí)間表達(dá)分析的樣本主要為成年期的葉片，采集時(shí)間為2021年9月至2022年5月，每月1日下午5點(diǎn)采集1次。時(shí)間表達(dá)主要分為5個(gè)生長階段，即營養(yǎng)生長期、成花誘導(dǎo)期、花芽分化期、花序伸長和開花期、果實(shí)發(fā)育初期。用于組織表達(dá)分析的樣本主要為童期的葉、莖、芽，采集時(shí)間為2022年2月15日；成年期的葉、莖、花以及幼胚和成熟胚，采集時(shí)間為2021年11月16日。所有樣品采集后立即用液氮冷凍并保存在?80℃冰箱中。本研究中使用的擬南芥為哥倫比亞型擬南芥。

1.2方法

1.2.1生物信息學(xué)分析利用TBtools軟件和cDNA以及DNA文件繪制MiNAC7的DNA序列結(jié)構(gòu)圖[19]；通過NCBI/blastp數(shù)據(jù)庫對芒果MiNAC7編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源查找并預(yù)測其保守結(jié)構(gòu)域，利用DNAMAN軟件對不同物種的NAC蛋白進(jìn)行氨基酸序列比對；利用MEGA7.0軟件構(gòu)建NAC蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹[20]；利用NewPlace數(shù)據(jù)庫對MiNAC7基因前2000bp的啟動子區(qū)進(jìn)行分析并通過TBtools軟件繪制順式元件的分布。

1.2.2MiNAC7的表達(dá)分析芒果樣品RNA采用美基公司的難提植物總RNA小提試劑盒提取，擬南芥樣品RNA采用植物RNA小量提取試劑盒提取。利用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶按照說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。利用在線軟件Primer3.0Plus設(shè)計(jì)特異引物（MiNAC7u：5?-CTGCAGACATAAACGGTGGA-3?，MiNAC7d：5?-TGGGTTGACAAGATCCAACA-3?），以芒果MiActin1為內(nèi)參基因[21]（qMiACTu：5?-CCGAGACATGAAGGAGAAGC-3?，qMiACTd：5?-GTGGTCTCATGGATACCAGCA-3?）。采用TaKaRa公司的SYBRGreen和SYBRPremixExTaqII試劑，使用AppliedBiosystems7500實(shí)時(shí)定量PCR儀對MiNAC7基因的表達(dá)進(jìn)行RTqPCR檢測，使用2–ΔΔCT方法對熒光定量的結(jié)果進(jìn)行分析[22]。

1.2.3擬南芥的轉(zhuǎn)化將MiNAC7的完整cDNA序列（CDS）插入到pBI121載體中，將陽性重組質(zhì)粒pBI121-MiNAC7按照說明書的方法導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105中，隨后用花序侵染法對野生型擬南芥進(jìn)行轉(zhuǎn)化[23]。收獲侵染后的種子，將其播種于含有50mg/L卡納的1/2MS培養(yǎng)基中進(jìn)行陽性苗篩選，利用余海霞等[24]改良的CTAB法提取陽性擬南芥的DNA，用MiNAC7的特異引物對陽性轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行PCR檢測與驗(yàn)證。對序列檢測正確的陽性擬南芥進(jìn)行培育繁殖，直至獲得純合株系。

1.2.4轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型分析將擬南芥置于長日照（16h光照/8h黑暗）和21℃的條件下培養(yǎng)，以野生型擬南芥（WT）和轉(zhuǎn)空載擬南芥（pBI1121）為對照，觀察轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型，統(tǒng)計(jì)植株第一朵花開放的時(shí)間。以T3代純合轉(zhuǎn)基因擬南芥的cDNA為模板，擬南芥基因AtACTIN2為內(nèi)參基因（AtActin2u：5?-TCAGATGCCCAGAAGTCTTGTTCC-3?，AtActin2d：5?-CCGTACAGATCCTTCCTGATATCC-3?），通過半定量法[25]檢測芒果MiNAC7基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)水平。通過qRT-PCR法檢測開花相關(guān)基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)水平（AtFTu：5?-CTTGGCAGGCAAACAGTGTATGCAC-3?，AtFTd：5?-GCCACTCTCCCTCTGACAATTGTAGA-3?;AtAP1u：5?-CACCAAATCCAGCATCCTTAC-3?，AtAP1d：5?-GTTCGAGATCATTCCTCCTCA-3?;AtFLCu：5?-ACTTGTGGATAGCAAGCTTGTGG-3?，AtFLCd：5?-CATGAGTTCGGTCTTCTTGGCTC-3?）。

1.2.5轉(zhuǎn)基因擬南芥的非生物逆境脅迫處理將T4代轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗置于長日照培養(yǎng)箱經(jīng)過3d培養(yǎng)后轉(zhuǎn)入逆境培養(yǎng)基中，豎直放置并繼續(xù)培養(yǎng)5d后，拍照并記錄野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥的根長表型和鮮重。逆境脅迫處理所用的試劑及濃度設(shè)計(jì)如下：鹽脅迫使用濃度為0、100、125mmol/L氯化鈉（NaCl）；干旱脅迫使用的甘露醇（mannitol）濃度為0、300、400mmol/L；ABA濃度為0、5μmol/L，GA3濃度為0、5、10μmol/L。

1.3數(shù)據(jù)處理

本研究所有數(shù)據(jù)（如表達(dá)分析、表型分析和非生物脅迫逆境分析數(shù)據(jù)等）均使用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，采用IBMSPSS25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和Duncan多重范圍檢驗(yàn)，利用GraphPadPrism9繪制條形圖，P<0.05表示差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果與分析

2.1MiNAC7生物信息學(xué)分析

MiNAC7基因DNA全長為3631bp，編碼區(qū)長度為1137bp，編碼379個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為4.88，蛋白質(zhì)分子量為93.41kDa。MiNAC7有4個(gè)內(nèi)含子，5個(gè)外顯子（圖1A）。利用MEGA7.0軟件構(gòu)建了NAC蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1B），芒果MiNAC7與阿月渾子PvNAC26最接近，同源性最高，氨基酸相似性為69.64%，且MiNAC7與PvNAC26、CcNAC29、CcNAC100、CsNAC29、LcNAC39同源性較高。故對這6個(gè)物種的NAC氨基酸序列進(jìn)行比對，其保守結(jié)構(gòu)域如圖1C所示，6種蛋白的N端表現(xiàn)出高度的相似性，氨基酸序列中含有1個(gè)NAM保守結(jié)構(gòu)域，是NAC基因家族的典型結(jié)構(gòu)域，C端表示出明顯的差異。對MiNAC7基因的起始密碼子前2000bp的啟動子區(qū)域進(jìn)行順式元件分析（圖1D），MiNAC7基因啟動子主要包含6種不同類型的順式調(diào)控元件，即光響應(yīng)元件（lightresponseelement）、ICE轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、赤霉素響應(yīng)元件（gibberellinresponse）、茉莉酸響應(yīng)元件（jasmonicacidresponseelement）以及生長素響應(yīng)元件（auxinresponseelement）等。

2.2MiNAC7基因的表達(dá)模式分析

特性，采集童期和成年期的不同組織進(jìn)行表達(dá)模式分析。如圖2A所示，MiNAC7基因在各個(gè)組織中均表達(dá)，但表達(dá)存在差異，MiNAC7在童期組織的莖中表達(dá)最高，其次是在芽中，在葉中表達(dá)很低，在成年期的莖中表達(dá)水平較高，在花和葉中表達(dá)很低；表明MiNAC7基因在莖中優(yōu)勢表達(dá)。為了探究MiNAC7基因在四季蜜芒中不同生長發(fā)育時(shí)期的表達(dá)特性，利用qRT-PCR對不同時(shí)期的表達(dá)模式進(jìn)行分析。如圖2B所示，MiNAC7基因在不同時(shí)期的葉片中均存在不同程度的表達(dá)，其中在營養(yǎng)生長期的葉片中維持較高的表達(dá)水平，在成花轉(zhuǎn)變期和花發(fā)育期的葉片中表達(dá)水平很低，說明MiNAC7基因與植物生長發(fā)育有關(guān)。

2.3MiNAC7轉(zhuǎn)基因擬南芥對開花的影響

將構(gòu)建好的載體采用花序侵染法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥植株后，篩選陽性株系并繁育至T3代純合植株。通過半定量PCR技術(shù)檢測MiNAC7在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)情況，結(jié)果如圖3A1所示，MiNAC7在這3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系（OE-2、OE-3、OE-6）中均可以正常表達(dá)，而在野生型（WT）和轉(zhuǎn)pBI121空載擬南芥中不表達(dá)。以野生型擬南芥（WT）和轉(zhuǎn)空載pBI121擬南芥為對照，觀察MiNAC7轉(zhuǎn)基因擬南芥的開花時(shí)間。結(jié)果如圖3A所示，MiNAC7轉(zhuǎn)基因擬南芥顯著延遲開花，開花時(shí)間比對照植株晚約4d（圖3B）。轉(zhuǎn)基因擬南芥開花內(nèi)源基因表達(dá)水平檢測顯示，MiNAC7轉(zhuǎn)基因擬南芥中促花基因AtFT和AtAP1的表達(dá)水平被顯著下調(diào)，而抑制成花基因AtFLC的表達(dá)水平被顯著上調(diào)（圖3C）。

2.4MiNAC7轉(zhuǎn)基因擬南芥對逆境脅迫應(yīng)答的影響

為了解MiNAC7在非生物逆境脅迫中的功能，對野生型擬南芥和3個(gè)超量表達(dá)株系進(jìn)行鹽脅迫處理（0、100、125mmol/LNaCl）、干旱脅迫處理（0、300、400mmol/L甘露醇）和激素處理（0、5μmol/LABA，0、5、10μmol/LGA3），結(jié)果見圖4。在對照組中，野生型與MiNAC7轉(zhuǎn)基因擬南芥在根長和鮮重上差異不顯著，實(shí)驗(yàn)組的野生型與MiNAC7轉(zhuǎn)基因擬南芥在根長和鮮重上差異顯著。鹽脅迫處理使擬南芥根長生長受到抑制，但MiNAC7轉(zhuǎn)基因擬南芥的根長受到的抑制顯著小于野生型擬南芥。干旱脅迫抑制了擬南芥根長生長，鮮重重量降低，但MiNAC7轉(zhuǎn)基因擬南芥的根長受到的抑制比野生型擬南芥輕，鮮重比野生型擬南芥重。GA3激素處理使擬南芥根長和鮮重均受到不同程度的影響，5μmol/LGA3激素處理促進(jìn)了MiNAC7轉(zhuǎn)基因擬南芥的根長生長，鮮重升高，但對野生型擬南芥的根長生長無顯著差異；10μmol/LGA3激素處理與5μmol/LGA3激素處理相比，野生型擬南芥和MiNAC7轉(zhuǎn)基因擬南芥的根長生長均被抑制。在5μmol/LABA激素處理下擬南芥表型差異明顯，植株弱小，MiNAC7轉(zhuǎn)基因擬南芥的根長比野生型擬南芥的短。綜上所述，過表達(dá)MiNAC7基因增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥對ABA的敏感性、抗GA3以及抗旱和耐鹽堿能力。

3討論

NAC基因家族廣泛存在于大量物種中，在植物激素信號傳導(dǎo)，成花發(fā)育、果實(shí)成熟、葉片衰老等植物生長發(fā)育過程以及高鹽、干旱、低溫或高溫等非生物脅迫中起重要作用[26]。通過酵母雙雜交文庫篩選，挖掘獲得了1個(gè)NAC類轉(zhuǎn)錄因子，命名為MiNAC7，NCBI同源性比較分析顯示，MiNAC7與多個(gè)被命名為不同名字的NAC基因具有同源性，其中與阿方索芒果MiNAC7的核苷酸和氨基酸同源性分別為98.16%和96.04%。進(jìn)化樹分析顯示芒果MiNAC7與阿月渾子PvNAC26最接近，同源性最高，氨基酸相似性為69.64%。啟動子順式元件分析表明，芒果MiNAC7基因可能受到光照、激素以及逆境脅迫的調(diào)控。

不同物種NAC家族基因表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式。蠟梅CpNAC68在成熟葉和花上特異表達(dá)[27]，小麥TtNAC2A在葉和根中特異表達(dá)[28]。黃瓜NAC基因家族中有11個(gè)基因的優(yōu)勢表達(dá)部位是莖[29]，菊花菜NAC基因家族中有3個(gè)成員在莖的生長發(fā)育過程中起重要的調(diào)控作用[30]。在本研究中，芒果MiNAC7基因在童期組織中的表達(dá)水平相對于成年期更高，在童期莖的表達(dá)量最高，與北沙柳SpsNAC005的研究結(jié)果相似[31]。芒果時(shí)空組織分析結(jié)果顯示，MiNAC7基因在營養(yǎng)生長期表達(dá)量較高，但在成花轉(zhuǎn)變和花發(fā)育期表達(dá)水平較低，說明MiNAC7與芒果成花有關(guān)。

在植物開花時(shí)間的調(diào)控中不同的NAC基因具有不同的功能。甘蔗ScNAC23的過表達(dá)促使轉(zhuǎn)基因擬南芥提前開花[14]，黃麻CcNAC1可以讓植物的花期提前[32]，OsNAC7亞家族CHR00069684基因使轉(zhuǎn)基因煙草提前開花[30]。本研究中，MiNAC7過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥延遲開花，并下調(diào)開花促進(jìn)基因AtFT和AtAP1的表達(dá)，上調(diào)成花抑制基因AtFLC的表達(dá)，說明MiNAC7通過調(diào)控成花相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)而影響轉(zhuǎn)基因植株成花。芒果MiNAC1基因不影響轉(zhuǎn)基因擬南芥的開花時(shí)間[33]，說明不同類型的NAC基因在調(diào)控植物成花過程中的功能存在差異。

植物NAC轉(zhuǎn)錄因子在多種非生物脅迫應(yīng)答中起重要作用，在NaCl、甘露醇或ABA脅迫條件下，剛毛檉柳ThNAC13轉(zhuǎn)基因植物的根長和鮮重與野生型植物相比均顯著增加[34]。在ABA脅迫條件下，南荻MlNAC10[35]、歐李ChNAC1[36]轉(zhuǎn)基因植物都增加了對ABA的敏感性。在本研究中，100、125mmol/L濃度的鹽脅迫處理和300、400mmol/L的干旱脅迫的轉(zhuǎn)基因擬南芥根長均比野生型擬南芥根長較長，鮮重比野生型擬南芥重。5、10μmol/LGA3激素處理促進(jìn)了MiNAC7轉(zhuǎn)基因擬南芥的根長生長，在5μmol/LABA激素處理下轉(zhuǎn)基因擬南芥根長較短，說明MiNAC7也參與了植物的逆境脅迫應(yīng)答過程。這與芒果MiNAC1基因在逆境脅迫方面的研究結(jié)果相似[33]。

綜上所述，芒果MiNAC7基因不僅參與調(diào)控植株開花，同時(shí)響應(yīng)非生物逆境脅迫應(yīng)答。