鴨茅TCP基因家族成員鑒定及表達分析

摘要：TCP轉錄因子家族在葉片發(fā)育中發(fā)揮重要作用，鴨茅是世界著名的多年生禾本科牧草，葉片是其主要的收獲部位，且營養(yǎng)價值豐富。本研究鑒定了鴨茅（Dactylis glomerata）TCP基因家族成員，并對所有成員進行了理化性質、基因結構、染色體定位、進化關系、保守基序和結構域、啟動子順式作用元件以及表達量等分析。發(fā)現(xiàn)鴨茅TCP基因家族共有22個成員被劃分成3個亞家族；它們都含有TCP蛋白典型結構域；成員間蛋白的親水性較好，等電點和相對分子質量有差異；α螺旋和無規(guī)則卷曲是鴨茅TCP蛋白主要的二級結構，亞細胞定位預測主要定位于細胞核；22個成員的啟動子順式作用元件可分為4類，分別是光響應元件、植物激素響應元件、抗病創(chuàng)傷脅迫響應元件以及其他元件；此外，DgTCP8和DgTCP20在葉片中的表達量較高且可響應生長素和赤霉素的表達。本文為深入探究鴨茅TCP基因在葉片發(fā)育中的功能提供依據(jù)，為葉片優(yōu)良鴨茅品種的選育奠定基礎。

關鍵詞：鴨茅；TCP；基因家族；表達量分析；葉片發(fā)育

中圖分類號：S326""" 文獻標識碼：A"""" 文章編號：1007-0435（2024）06-1682-11

Identification and Expression Analysis of TCP Gene Family Members in Orchardgrass

LUO Jin-chan， JIN Ya-rong， YANG Yu-chen， ZHU Xin， JIA Ji-yuan， WANG Xiao-shan， HUANG Lin-kai*

（Grass Science College Sichuan Agricultural University， Chengdu， Sichuan Province 611130， China）

Abstract：The TCP transcription factor family genes play an important role in leaf development，and orchardgrass is a world-renowned perennial Poaceae grass. Its leaves are the main harvesting parts and have rich nutritional value. In this study，we identified the members of the TCP gene family in orchardgrass and analyzed their physicochemical properties，gene structure，chromosome localization，evolutionary relationships，conserved motifs and domains，cis-acting promoter elements，and expression levels. It was found that 22 members of the TCP gene family in orchardgrass were divided into 3 groups. They all contain typical domains of TCP proteins. The hydrophilicity of proteins among members is good，and there were differences in isoelectric point and relative molecular weight. α-helix and random coil were the main secondary structures of orchardgrass TCP protein，and subcellular localization prediction was mainly located in the nucleus. The cis acting elements of the 22 member promoters can be divided into 4 categories，namely light responsive elements，plant hormone responsive elements，anti traumatic stress responsive elements，and other elements. In addition，DgTCP8 and DgTCP20 had higher expression levels in leaves and responded to treatment with auxin and gibberellin. The article provides a basis for in-depth exploration of the function of the TCP gene in leaf development of orchardgrass，and lays the foundation for the breeding of excellent orchardgrass varieties.

Key words：Orchardgrass；TCP；Gene family；Expression analysis；Leaf development

鴨茅（Dactylis glomerata）是一種以葉片為主要收獲部位的牧草，屬于禾本科（Gramineae）早熟禾亞科（Premature subfamily）鴨茅屬（Dactylis）植物，它主要生長在溫帶區(qū)域，在我國主要分布于西南地區(qū)［1］。它的莖葉營養(yǎng)價值豐富，可用于家畜的青飼、調制干草和與其他豆科牧草青貯等［2］，目前，在我國南方各地大量應用和廣泛種植，常被應用于人工草地建設、草山草坡改良以及石漠化治理等［3］?？梢姡喢┦且环N優(yōu)良的牧草資源，具有很高的應用價值和發(fā)展前景。為提高鴨茅的產(chǎn)量，挖掘其葉片發(fā)育相關的轉錄因子，再通過轉基因技術等方法實現(xiàn)鴨茅品質的改良。

TCP（TEOSINTE BRANCHED1/CINCINNATA/PROLIFERATING CELL FACTOR）轉錄因子家族是植物特有的一類轉錄因子家族，該家族的基因廣泛參與植物生長發(fā)育，例如葉片、花和果實的發(fā)育，種子的萌發(fā)以及側枝的形成等［4］；而且TCP基因還能夠影響多種植物激素的合成，例如生長素、脫落酸、乙烯等［5］。根據(jù)氨基酸序列的差異，將TCP基因家族分為了2個亞家族，分別是ClassⅠ和ClassⅡ，其中，ClassⅠ亞族主要包含PCF（PROLIFERATING FACTOR）基因，而ClassⅡ亞族又被分為了CIN（CINCINNATA）亞族和CYC（CINCINNATA）/TB1（TEOSINTE BRANCHED1）2個亞族［6］。隨著測序技術的發(fā)展，許多植物的基因組被測定，越來越多的TCP基因家族也被鑒定出來，例如擬南芥（Arabidopsis thaliana）研究中發(fā)現(xiàn)AtTCP14和AtTCP15調節(jié)赤霉素信號通路，在節(jié)間、葉片以及花組織的細胞增殖中發(fā)揮重要作用［7］。水稻（Oryza sativa）OsTCP19可誘導一些激素信號途徑，如生長素、脫落酸、細胞分裂素和茉莉酸的發(fā)生［5］，然而TCP基因家族在鴨茅中的概況尚不清楚。

本研究以24個擬南芥TCP蛋白序列為基準對鴨茅基因組數(shù)據(jù)庫進行檢索，篩選鑒定得到22個鴨茅TCP基因家族成員。利用來自擬南芥、水稻和鴨茅的TCP蛋白序列構建了系統(tǒng)發(fā)育樹；并對所有成員分別進行了蛋白質理化性質、保守結構域、染色體位置、基因結構以及不同組織下表達量等分析。該結果豐富了鴨茅基因家族方面的研究，為后續(xù)利用基因工程技術改良鴨茅品質奠定理論基礎；同時，TCP基因家族在不同物種中的系統(tǒng)鑒定可為后續(xù)深入解析其家族成員發(fā)揮的不同生物學功能具有一定的理論指導意義。

1 材料與方法

1.1 鴨茅TCP基因家族成員的鑒定及理化性質分析

從鴨茅基因組數(shù)據(jù)庫（https：//orchardgrassgenome.sicau.edu.cn/）中下載鴨茅的基因組文件和基因注釋文件［8］。在擬南芥數(shù)據(jù)庫Tair（https：//www.arabidopsis.org/）中下載擬南芥TCP基因家族成員的基因序列和蛋白序列，使用BLAST工具以擬南芥TCP蛋白序列檢索鴨茅蛋白數(shù)據(jù)庫尋找鴨茅TCP蛋白，以E值小于10-5為標準選取合適的蛋白序列。與此同時，從Pfam數(shù)據(jù)庫（http：//ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/Pfam/current_release/）下載hmm模型和TCP基因家族的Pfam號（PF03634）搜索可能的鴨茅TCP基因。將以上兩種方法鑒定得到的鴨茅TCP基因取交集［9］，得到鴨茅TCP基因家族成員，并利用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）上的Batch CD-search工具分析成員的保守結構域。利用ExPASy在線網(wǎng)站（https：//web.expasy.org/protparam/）對鴨茅TCP基因家族成員進行蛋白質理化性質分析［10］，其中包括氨基酸數(shù)目、分子量、等電點等。

1.2 鴨茅TCP基因家族蛋白質二級結構和亞細胞定位分析

使用prabi（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa%20_sopma.html）在線工具預測蛋白質二級結構。使用WoLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）進行亞細胞定位預測［11］。

1.3 鴨茅TCP基因家族保守基序（motif）、基因結構分析及染色體位置分析

從基因組中提取出22個鴨茅TCP基因的蛋白序列，接著用MEME在線網(wǎng)站（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）對其保守基序進行預測，保守基序的個數(shù)設為6個［12］。利用鴨茅基因組注釋信息中的染色體信息以及TCP基因家族的基因號進行基因結構和染色體位置分析。利用TBtools實現(xiàn)保守基序和基因結構的可視化［13］。

1.4 鴨茅TCP基因系統(tǒng)進化樹的構建

為了研究TCP家族在不同植物的系統(tǒng)發(fā)育關系，我們從在線網(wǎng)站（https：//www.arabidopsis.org/browse/genefamily/index.jsp和http：//planttfdb.gao-lab.org/）下載得到了24條擬南芥TCP蛋白序列和23條水稻TCP蛋白序列。使用MEGA11［14］軟件對這些TCP蛋白序列進行多序列比對，采用鄰接法（Neighbor-Joining）構建進化樹。參數(shù)設置：Bootstrap Replication為1000，其他參數(shù)設置為默認參數(shù)。進化樹的構建結果使用Evolview（https：//www.evolgenius.info/evolview-v2）在線軟件顯示并美化［15］。

1.5 鴨茅TCP基因啟動子順式作用元件分析

在鴨茅基因組數(shù)據(jù)庫中下載TCP家族成員基因轉錄起始位點上游2 000 bp的序列，使用PlantCARE（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）將來自鴨茅TCP基因翻譯起始位點上游的2 000 bp的序列進行順式作用元件分析［16］。使用TBtools實現(xiàn)圖形的可視化。

1.6 鴨茅TCP基因家族在不同組織中的表達分析

基因的時空表達在一定程度上反映了基因的功能特性，根據(jù)課題組前期已發(fā)表的文章獲取鴨茅轉錄組數(shù)據(jù)（http：//orchardgrassgenome.sicau.edu.cn/）［8］。提取22個鴨茅TCP基因在根、莖、葉、穗和花的FPKM值（Fragment Per Kilobase of exon model per Million mapped reads）［2，17］，用TBtools軟件繪制熱圖，對基因的表達模式進行分析。

1.8 IAA和GA處理下DgTCPs基因的表達模式分析

以生長一致的安巴鴨茅為試驗材料，使用50 mg·L-1的IAA和GA處理鴨茅，分別取處理0，1，2，4，8 h和48 h的鴨茅葉片，提取葉片RNA并反轉錄成cDNA，以該cDNA為模板進行實時熒光定量PCR分析。根據(jù)基因在不同組織的特異性表達分析結果，選取在葉片中相對較高表達的基因，利用primer軟件設計引物（表1）。反應體系為：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix：5 μL，引物F/R：0.5 μL，稀釋10倍的cDNA：2 μL，ddH2O：2 μL。反應程序為：步驟一：95℃-30 sec，一個循環(huán)；步驟二：95℃-10 sec，60℃-30 sec，40個循環(huán)；步驟三：95℃-15 sec，60℃-60 sec，95℃-15 sec，一個循環(huán)。利用Graphpad Prism 10.0軟件繪制圖形并進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 鴨茅TCP基因家族成員的鑒定結果

為了確定鴨茅TCP基因家族的數(shù)目，首先在擬南芥數(shù)據(jù)庫中下載得到了24個擬南芥TCP基因家族成員AtTCP1～AtTCP24，將其作為參考在鴨茅基因組數(shù)據(jù)中進行鑒定，共鑒定到了22個鴨茅TCPs。利用Pfam數(shù)據(jù)庫的hmm模型以及TCP基因家族的Pfam號進行檢索，該方法提取到25個鴨茅TCPs。將這兩種方法取交集，發(fā)現(xiàn)這兩種方法同時分離到的TCP基因家族成員共22個。利用NCBI的CDD數(shù)據(jù)庫對這22個鴨茅TCP家族成員的蛋白序列進行進一步分析，確認所有成員都包含保守的TCP蛋白結構域（圖1）。根據(jù)其在染色體上的順序，將分離得到的鴨茅TCP基因家族成員分別命名為DgTCP1～DgTCP22［18］，其中在4號染色體上分布的數(shù)目最多，為6個（圖2）。結果表明，鴨茅的TCP基因家族成員數(shù)目與擬南芥中TCP家族成員數(shù)目相似，差異數(shù)目為2。于此同時，利用ExPASy在線網(wǎng)站對22個鴨茅TCP家族成員進行蛋白質理化性質分析，結果顯示鴨茅TCP家族成員的氨基酸數(shù)目介于164～453個氨基酸之間，分子質量在17.4～47.4kDa之間，蛋白等電點最小為5.09，最大為9.92，不穩(wěn)定性系數(shù)介于44.03～66.78之間，脂溶性指數(shù)都小于100，親水性平均值皆為負值（表2）。以上分析結果說明在鴨茅中該家族蛋白具有良好的親水性，在蛋白分子量、等電點等方面存在差異。

2.2 鴨茅TCP基因家族蛋白二級結構及亞細胞定位分析結果

對鴨茅TCP蛋白的預測結構進行分析發(fā)現(xiàn)（表3），TCP蛋白二級結構有α螺旋、延長鏈、β折疊和無規(guī)卷曲4種類型，各二級結構的氨基酸數(shù)分別為42～124，21～68，10～28和79～334，各二級結構的占比分別為α螺旋25.61%～37.13%，延長鏈11.11%～19.77%、β折疊4.22%～7.31%、無規(guī)卷曲41.80%～73.73%。其中，α螺旋和無規(guī)卷曲占比最大，為鴨茅TCP蛋白的主要二級結構。亞細胞定位預測結果顯示有20個鴨茅TCP基因家族成員都定位在細胞核上，占比90.91%，DgTCP1定位在細胞質上，DgTCP5定位在葉綠體上。鴨茅TCP蛋白二級結構以α螺旋和無規(guī)則卷曲為主，且絕大多數(shù)TCP蛋白質定位在細胞核上。

2.3 鴨茅TCP基因家族的染色體位置分析結果

根據(jù)鴨茅的基因組注釋信息，獲得鴨茅TCP基因家族成員的染色體長度，繪制了22個鴨茅TCP成員（DgTCPs）在染色體（2n=14）上的位置及其分布規(guī)律。結果如圖2所示，22個DgTCPs基因分布在鴨茅的7條染色體上，且呈不均等分布，最少的分布1個DgTCPs，最多分布6個DgTCPs。其中2號、6號和7號染色體上各含有1個DgTCP，1號染色體上分布了3個DgTCPs，3號和5號染色體上各分布了5個DgTCPs以及4號染色體上分布了6個DgTCPs（圖2）。結果表明鴨茅TCP基因在染色體間的分布是不均衡的，主要集中在3號染色體、5號染色體和6號染色體上。

2.4 鴨茅TCP基因家族的基因結構和保守基序（Motif）分析結果

為了掌握鴨茅TCP基因的多樣性，對DgTCPs進行了基因結構分析，繪制了基因結構圖譜并比較了DgTCPs基因的非翻譯區(qū)（Untranslated region，UTR）和編碼序列（Coding sequence，CDS）組成。結果表明，22個DgTCPs基因的結構都比較簡單，所有序列都含有編碼序列，17個DgTCPs含有非翻譯區(qū)，占基因總數(shù)之比77.27%。（圖3）。

同時，利用鴨茅的22個TCP蛋白序列構建了無根進化樹，然后使用MEME在線軟件對這22個成員進行了保守結構域分析，結果顯示DgTCPs成員共包含了6種不同的保守結構域（Motif1～Motif6），Motif1和Motif2在所有成員中均含有，Motif4出現(xiàn)在14個DgTCPs成員中以及Motif3出現(xiàn)在11個DgTCPs成員中（圖3），說明這些基序具有較高的保守性，它們在鴨茅TCP轉錄因子發(fā)揮功能上有著重要的作用。

2.5 鴨茅TCP基因系統(tǒng)進化分析結果

為了進一步了解鴨茅TCP轉錄因子家族的系統(tǒng)進化關系，本研究對其進行了系統(tǒng)進化分析。利用MEGA11軟件［14］對24個擬南芥TCP基因、23個水稻TCP基因以及22個鴨茅TCP基因成員進行多序列比對，然后通過鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。結果顯示鴨茅TCP基因成員被劃分成了3個groups（圖4）。其中，group 1包含1個鴨茅TCP基因，即DgTCP17，group 2包含3個鴨茅TCP基因家族成員，分別是DgTCP14、DgTCP16、DgTCP20。group 3是其中最大的分支，包含18個鴨茅TCP基因家族成員，占比81.82%。研究表明位于這一分支上的AtTCP3、AtTCP8、AtTCP10、AtTCP15和AtTCP22均能調控葉片的發(fā)育［19，20］，而DgTCP22與AtTCP3、DgTCP3與AtTCP10、DgTCP18與AtTCP22處在同一進化支上，說明它們在結構上高度相似，可能發(fā)揮相同或者相似的生物學功能。

2.6 鴨茅TCP基因啟動子順式作用元件分析結果

基因啟動子序列上的順式作用元件（Cis-acting element）對于基因的轉錄調控具有十分重要的功能［21］，由于啟動子多數(shù)位于基因轉錄起始點的上游，我們通過對鴨茅TCP基因起始密碼子ATG上游2 000 bp的基因序列進行分析，在其中發(fā)現(xiàn)了多種順式作用元件，大致可分為4類，分別是光響應元件、植物激素響應元件、抗病創(chuàng)傷脅迫響應元件和其他順式元件。在預測的結果中，參與光響應元件較多，占比39%，參與激素響應的元件占比為33%，參與抗病創(chuàng)傷脅迫響應元件占比17%，其他順式元件占比11%（圖5）。與植物激素相關的順式元件有茉莉酸甲酯激素的響應元件（TGACG-motif）、脫落酸響應元件（Abscisic acid responsive element，ABRE）、生長素響應元件（Auxin-responsive elements，AuxRR-core）、赤霉素響應元件（Gibberellin-responsive element，GARE-motif）等；參與光響應的順式元件有I-box、GATA-motif和TCCC-motif等；參與脅迫響應的順式元件有低溫響應元件（Low-temperature responsivenes，LTR）、干旱誘導元件（Drought-inducibility）等，其他順式元件包括晝夜節(jié)律調控元件、胚乳表達、分生組織表達等。在這些順式元件中參與生長發(fā)育的順式元件有細胞周期調控（Cell cycle regulation）、晝夜節(jié)律控制（Circadian control）等

2.7 鴨茅TCP家族成員在不同組織中的表達分析結果

分析基因的表達模式對進一步了解基因的功能具有非常重要的作用。為了分析DgTCPs基因在不同組織或器官中的表達情況，本研究分析了22個DgTCPs基因在鴨茅不同組織（包括根、莖、葉、花、穗）中的表達情況。結果顯示，DgTCP8（DG3C05144.1）和DgTCP20（DG5C05852.1）基因在各組織中的表達差異較大，同時它也是葉片中表達量較高的基因，即DgTCP8和DgTCP20基因在鴨茅葉片中特異性上調表達（圖6）。因此，DgTCP8和DgTCP20可能在葉片發(fā)育過程中發(fā)揮重要的調控作用。

2.8 DgTCP8和DgTCP20在IAA和GA處理下的表達模式分析結果

生長素和赤霉素可以正向調控葉片的發(fā)育，同時5種組織下轉錄組數(shù)據(jù)表明DgTCP8和DgTCP20在鴨茅葉片中特異性上調表達（圖6），因此本研究選擇了DgTCP8和DgTCP20這兩個基因做接下來的分析。在IAA處理下，DgTCP8，在1 h、8 h、48 h的表達量與對照相比差異顯著，下調表達（圖7A）；DgTCP20在1 h、8 h、48 h的表達量與對照相比差異顯著，上升表達（圖7B）。在GA處理下，DgTCP8在4 h、8 h的表達量與對照相比差異顯著，下降表達（圖7C）；DgTCP20在4 h、8 h的表達量與對照相比差異顯著，上調表達，4 h達到最高峰，是未處理的2倍（圖7D）。結果表明，DgTCP8和DgTCP20這兩個基因能夠響應生長素和赤霉素調控通路，而IAA和GA與葉片發(fā)育過程密切相關，進一步說明DgTCP8和DgTCP20很可能參與葉片發(fā)育的調控。

3 討論

鴨茅分布廣泛，常被應用于飼料作物和土壤改良等方面［22］，進一步改善其品質對于擴大其應用范圍具有重要的意義。Xu等［23］通過系統(tǒng)發(fā)育、基因結構、基序和表達模式分析，鑒定了46個鴨茅GRAS基因，并對其特征進行了分析。Yang等［24］鑒定到了鴨茅的123個MADS-box基因。Shuai等［25］通過系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定了125個鴨茅中的C2H2型鋅指蛋白家族，并對其進行了進一步的分類。Feng等［26］鑒定了17個鴨茅SPL基因，并通過系統(tǒng)發(fā)育分析確定了7個具有相似基因結構和保守基序的基因。Lu等［27］對bHLH轉錄因子家族進行了全基因組分析，鑒定了132個鴨茅bHLH基因等。為了豐富鴨茅基因家族的相關研究，本研究圍繞鴨茅TCP轉錄因子家族相關概況展開的，闡明了該家族成員的基本信息等。

TCP轉錄因子家族是植物特有的轉錄因子家族，它們在葉片的生長發(fā)育等相關過程中發(fā)揮重要的作用［28］。根據(jù)DNA結合域可將TCP轉錄因子分為Ⅰ類TCP和Ⅱ類TCP，Ⅱ類TCP也被稱為CIN-TCPs（CINCINNATA-like TCPs），CIN-TCPs基因的突變導致葉片細胞分裂過度，從而產(chǎn)生了葉片變大的表型，然而，研究發(fā)現(xiàn)CIN-TCPs基因在葉片發(fā)育早期促進葉片組織的成熟，早熟導致整個葉片發(fā)育不完全［29］；CIN-TCPs基因還可以促進miR396的表達，而miR396靶向編碼GRF（GROWTH-REGULATING FACTOR）基因［30］，而GRF在調節(jié)葉片和子葉組織中的細胞擴增中發(fā)揮作用［31］。此外，據(jù)報道擬南芥AtTCP14和AtTCP15參與葉片形狀的調控［7］。

在其蛋白的理化性質分析中，本研究發(fā)現(xiàn)該家族蛋白的親水性較好，但在分子量和等電點方面存在差異，這與其他植物TCP蛋白的特征類似，這可能是因為不同的TCP蛋白在植物中發(fā)揮不同的生理作用有關［32］。通過染色體位置分析我們發(fā)現(xiàn)鴨茅TCP基因在染色體間的分布是不均衡的，這可能是由于其在進化過程中發(fā)生了基因的復制或者丟失引起的［33］。聚類分析越是相近的基因，功能和結構更為相似［34］，根據(jù)進化樹分析結果發(fā)現(xiàn)位于group3分枝上的AtTCP3，AtTCP8，AtTCP10，AtTCP15和AtTCP22均能調控葉片的發(fā)育［19，20］，而DgTCP3、DgTCP18和DgTCP22皆分布在這一分枝上（圖4）。進一步分析DgTCPs在鴨茅不同組織中的表達發(fā)現(xiàn)，DgTCP8和DgTCP20這兩個基因在葉片中高表達。

4 結論

本研究在鴨茅全基因組水平上共鑒定出22個DgTCPs基因，并對它們進行了理化性質、基因結構、染色體定位、系統(tǒng)發(fā)育關系、啟動子順式作用元件以及表達量等分析。該結果豐富了鴨茅轉錄因子基因家族的研究，同時還篩選出了2個基因（即DgTCP8和DgTCP20）可能具有響應葉片發(fā)育的功能。

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（責任編輯 彭露茜）