鴨茅幼苗對(duì)開花期白三葉不同部位化感作用的響應(yīng)機(jī)理

張美艷，劉彥培，楊國(guó)盟，張 艷，黃梅芬，薛世明*

(1. 云南省草地動(dòng)物科學(xué)研究院，云南 昆明 650212；2.云南省種畜繁育推廣中心,云南 昆明 650212)

【研究意義】化感作用(Allelopathy)是植物生態(tài)生理研究熱點(diǎn)之一，又稱為異株克生或他感作用，指的是一種植物通過(guò)向生長(zhǎng)環(huán)境中釋放其產(chǎn)生的某些化學(xué)物質(zhì)，進(jìn)而對(duì)其周圍其他植物的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生有利或有害的影響[1-3]?；凶饔迷谥参镏袕V泛存在[4-6]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】白三葉對(duì)多年生黑麥草(Loliumperenne)、高羊茅(Festuca elata)、紫花苜蓿(Medicagosativa)、紅三葉(Trifoliumpratense)和蘿卜(Raphanussativus)等存在一定程度的化感效應(yīng)[7-10]。鴨茅種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)對(duì)紫花苜蓿(Medicagosativa)和紫莖澤蘭(Eupatoriumadenophorum)存在明顯的化感響應(yīng)，且鴨茅對(duì)不同濃度水提液化感作用的感應(yīng)強(qiáng)度不同[11-13]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】白三葉+鴨茅混播草地在中國(guó)西南地區(qū)有著廣泛應(yīng)用[14-15]，而放牧是白三葉+鴨茅混播草地最主要的利用方式[16-17]。而關(guān)于化感作用在白三葉+鴨茅混播草地建植和利用中的研究報(bào)道較少?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】文章主要探討白三葉開花期不同部位浸提液對(duì)鴨茅幼苗生長(zhǎng)發(fā)育的影響，旨在為鴨茅和白三葉混播草地的建植和高效管理提供指導(dǎo)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)所用提取液的供體牧草白三葉來(lái)自云南昆明北郊試驗(yàn)基地(N 25°11′，E102°59′，海拔1995 m)。受體植物是鴨茅(品種為安巴)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集與處理 挖取開花期白三葉植株，先用自來(lái)水沖洗，再用無(wú)菌雙蒸水沖洗2～3次，直至沖洗干凈。再用無(wú)菌濾紙吸干植株表面的水分，分離莖、葉、根，再分別剪成1～2 cm小段樣品備用。

1.2.2 白三葉浸提液的制備 母液的制備：將處理好的白三葉根、莖、葉樣品分別進(jìn)行稱重，置于500 mL錐形瓶，按樣品l g加無(wú)菌雙蒸水4 mL進(jìn)行配制，封口后置于搖床25 ℃下浸泡震蕩48 h，之后進(jìn)行二重過(guò)濾，濾液即是浸提液母液，濃度為0.25 g/mL，保存在4 ℃冰箱備用。

處理溶液的制備：按照稀釋比例，用無(wú)菌雙蒸水將母液稀釋成不同濃度(0.005、0.01、0.05、0.10和0.15 g/mL)的處理溶液，如不立即施用，處理液也需在4 ℃下保存。對(duì)照處理為無(wú)菌蒸餾水。

1.2.3 試驗(yàn)處理 利用人工氣候培養(yǎng)箱(一恒MGC-350)進(jìn)行幼苗培育。用發(fā)芽盤進(jìn)行鴨茅種子萌發(fā)，20 ℃黑暗3 d，第4天開始每天光照25 ℃10 h，黑暗20 ℃14 h，培養(yǎng)12 d(鴨茅幼苗長(zhǎng)度4～5 cm)時(shí)，挑選生長(zhǎng)一致幼苗，移栽至發(fā)芽盒(19 cm×13.5 cm×8 cm)上，每個(gè)發(fā)芽盒裝有全濃度霍格蘭德(Hoagland)營(yíng)養(yǎng)液800 mL，營(yíng)養(yǎng)液每3 d更換1次。培養(yǎng)12 d后，用預(yù)選配好的莖、葉、根浸提液替換營(yíng)養(yǎng)液，進(jìn)行浸提液處理。處理期間，每天25 ℃10 h光照，20 ℃14 h，無(wú)菌雙蒸水為對(duì)照處理。處理10 d采集樣品進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

測(cè)定指標(biāo)是鴨茅幼苗電解質(zhì)滲透率、丙二醛、 超氧化物歧化酶活性、過(guò)氧化氫酶活性等，測(cè)定方法參照植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)測(cè)定方法[18]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析，用Duncan法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 鴨茅幼苗葉片和根系電解質(zhì)滲透率對(duì)開花期白三葉不同部位浸提液的響應(yīng)

鴨茅幼苗葉片電解質(zhì)滲透率對(duì)開花期白三葉莖、葉、根浸提液的響應(yīng)不同。無(wú)論是白三葉的莖還是根浸提液，隨著處理濃度增加鴨茅幼苗葉片電解質(zhì)滲透率均呈逐步上升的趨勢(shì)。根浸提液在濃度0.10 g/mL時(shí)，鴨茅幼苗葉片電解質(zhì)滲透率達(dá)到最大，比對(duì)照增加122.0 %；且濃度0.10～0.15 g/mL的處理極顯著高于對(duì)照(P<0.01)。莖浸提液在最大濃度0.15 g/mL時(shí)鴨茅葉片電解質(zhì)滲透率達(dá)到最大，比對(duì)照增加175.0 %；0.05～0.15 g/mL濃度處理極顯著高于對(duì)照(P<0.01)。然而，與白三葉根、莖浸提液不同，葉浸提液處理下鴨茅幼苗葉片電解質(zhì)滲透率無(wú)明顯上升趨勢(shì)(P>0.05)。由此得出鴨茅葉片電解質(zhì)滲透率對(duì)開花期白三葉莖、根浸提液的響應(yīng)要比葉浸提液更加敏感(表1)。

鴨茅幼苗根系電解質(zhì)滲透率對(duì)開花期白三葉莖、葉、根浸提液的響應(yīng)明顯不同(P<0.05)。不同部位浸提液處理下，隨著濃度增加鴨茅幼苗根系電解質(zhì)滲透率整體上表現(xiàn)出上升趨勢(shì)，均在最大濃度0.15 g/mL處理時(shí)，鴨茅幼苗根系電解質(zhì)滲透率達(dá)到最大值，分別比對(duì)照增加189.0 %、201.0 %和63.0 %。根浸提液處理下，0.05～0.15 g/mL濃度處理極顯著高于對(duì)照(P<0.01)。莖浸提液處理下，所有濃度處理均極顯著高于對(duì)照(P<0.01)。葉浸提液處理下，0.005 g/mL和0.10～0.15 g/mL處理極顯著高于對(duì)照(P<0.01)。相比葉浸提液，鴨茅幼苗根電解質(zhì)滲透率對(duì)白三葉根、莖浸提液的響應(yīng)要更加敏感，尤其是莖浸提液(表2)。

2.2 鴨茅幼苗丙二醛含量對(duì)開花期白三葉不同部位浸提液的響應(yīng)

鴨茅葉片丙二醛含量對(duì)開花期白三葉不同部位浸提液的響應(yīng)不一致。其中，白三葉根和莖浸提液處理下，隨著處理濃度的增加鴨茅葉片丙二醛含量均呈現(xiàn)出明顯升高的趨勢(shì)(P<0.01)，均在濃度0.15 g/mL處理時(shí)，鴨茅葉片丙二醛含量最高，分別是23.20和33.69 nmol/g。但是，鴨茅葉片丙二醛含量對(duì)開花期白三葉葉浸提液的響應(yīng)不同于根和莖浸提液，在0.005 g/mL濃度處理時(shí)，鴨茅葉片丙二醛的含量最大，隨著處理濃度不斷增高呈現(xiàn)出先降低后升高趨勢(shì)(P<0.05，表1)。表明，開花期白三葉葉浸提液對(duì)鴨茅生長(zhǎng)的抑制作用明顯高于根和莖。

表1 鴨茅幼苗葉片電解質(zhì)滲透率、丙二醛和脯氨酸含量對(duì)開花期白三葉不同部位浸提液的響應(yīng)

鴨茅根系丙二醛含量對(duì)開花期白三葉不同部位浸提液處理的表現(xiàn)較為一致，均表現(xiàn)出隨著處理濃度的增加呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。且鴨茅根系丙二醛含量對(duì)開花期白三葉莖及葉浸提液的響應(yīng)較根浸提液更為敏感。白三葉莖浸提液0.05 g/mL時(shí)，鴨茅根系丙二醛含量就達(dá)到最高(P<0.05)，0.01～0.15 g/mL處理與對(duì)照差異極顯著(P<0.01)。白三葉葉浸提液0.10 g/mL時(shí)，鴨茅根系丙二醛含量達(dá)到最高值，比對(duì)照增加54.2 %(P<0.01)，而其余處理下的鴨茅根系丙二醛含量與對(duì)照差異不顯著(P>0.05)；而白三葉根浸提液不同濃度處理下的鴨茅根系丙二醛含量差異不顯著(P>0.05，表2)。表明白三葉莖、葉浸提液化感潛力要高于根浸提液。

2.3 鴨茅幼苗脯氨酸含量對(duì)開花期白三葉不同部位浸提液的響應(yīng)

鴨茅葉片脯氨酸含量對(duì)開花期白三葉不同部位浸提液的響應(yīng)存在顯著差異(P<0.05，表1)。其中，白三葉根及葉浸提液，隨著濃度的增加鴨茅幼苗受到抑制作用，脯氨酸含量呈增加趨勢(shì)，均在0.15 g/mL處理濃度下達(dá)到最大，高濃度(0.10～0.15 g/mL)處理顯著高于對(duì)照(P<0.05)。而白三葉莖浸提液在濃度0.10 g/mL時(shí)脯氨酸含量達(dá)到最大(P<0.01)?？梢钥闯觯喢┯酌缛~片中脯氨酸含量均是在低濃度0.005～0.05 g/mL未受到顯著影響或受抑反應(yīng)較低，在高濃度0.10～0.15 g/mL處理下表現(xiàn)出明顯的受抑反應(yīng)，且鴨茅幼苗葉片脯氨酸對(duì)莖浸提液的響應(yīng)要比葉和根浸提液更加敏感。

鴨茅根系脯氨酸含量對(duì)開花期白三葉不同部位浸提液的響應(yīng)不一致(表2)。隨著葉浸提液濃度增加，鴨茅幼苗根系脯氨酸含量呈現(xiàn)出不斷升高趨勢(shì)，在濃度0.05～0.15 g/mL處理下極顯著高于對(duì)照(P<0.01)。但是，鴨茅幼苗根系脯氨酸含量對(duì)開花期白三葉根及莖浸提液的響應(yīng)均是先升高后下降趨勢(shì)。在根浸提液處理下，濃度0.05 g/mL處理時(shí)鴨茅根系脯氨酸含量達(dá)到最大，顯著高于對(duì)照(P<0.01)，其余處理間均無(wú)明顯差異(P>0.05)。在莖浸提液處理下，濃度0.005～ 0.05 g/mL處理下鴨茅根系脯氨酸含量極顯著高于對(duì)照，在低濃度0.005 g/mL處理時(shí)，鴨茅就表現(xiàn)出明顯受抑效應(yīng)(P<0.05)；而白三葉葉及根浸提液均是在0.05 g/mL處理時(shí)鴨茅才表現(xiàn)出明顯受抑效應(yīng)(P<0.05)，這表明鴨茅根系脯氨酸對(duì)白三葉莖浸提液的受抑響應(yīng)要早于根及葉浸提液，這與鴨茅葉片脯氨酸的響應(yīng)較為一致。

表2 鴨茅幼苗根系電解質(zhì)滲透率、丙二醛和脯氨酸含量對(duì)開花期白三葉不同部位浸提液的響應(yīng)

不同小寫字母和大寫字母分別表示同一部位不同濃度處理間5 %和1 %水平差異顯著，下同Different lower case letters and upper case letters indicated significant difference between different concentration of aqueous extract from the same part of Trifolium repens at 5 % and 1 %, respectively，the same as below圖1 鴨茅幼苗超氧化物歧化酶(SOD)活性對(duì)白三葉根浸提液的響應(yīng)Fig.1 Effect of Trifolium repens root aqueous extract on the SOD activities of Dactylis glomerata seedling

2.4 鴨茅幼苗抗氧化酶活性對(duì)開花期白三葉不同部位浸提液的響應(yīng)

2.4.1 超氧化物歧化酶(SOD)活性 白三葉根和莖浸提液處理下，鴨茅幼苗葉片中SOD活性均呈現(xiàn)出先上升后下降趨勢(shì)。其中，根浸提液在濃度0.05 g/mL處理下鴨茅葉片SOD活性達(dá)到最大，顯著高于0.005和0.01 g/mL濃度處理(P<0.05)，但與對(duì)照差異不顯著(P>0.05，圖1)。莖浸提液處理下，0.10 g/mL濃度處理下的鴨茅葉片SOD活性達(dá)到最大，極顯著高于對(duì)照和其他處理(P<0.01)，低濃度0.005～0.01 g/mL處理下的SOD活性極其顯著低于對(duì)照(P<0.01，圖2)。然而，葉浸提液處理各濃度處理間差異不顯著(P>0.05，圖3)。以上表明，鴨茅幼苗葉片SOD活性對(duì)開花期白三葉不同部位浸提液的響應(yīng)不一致，其中根和莖浸提液呈現(xiàn)出“凸”規(guī)律，在中間濃度處理下的SOD活性達(dá)到最大；而葉浸提液均為抑制作用；鴨茅幼苗葉片SOD活性對(duì)白三葉莖和根浸提液的響應(yīng)要明顯高于葉浸提液。

隨著白三葉根、莖、葉浸提液濃度的增加，鴨茅幼苗根系SOD活性均表現(xiàn)出先上升后下降趨勢(shì)，且均在濃度0.10 g/mL處理下SOD活性達(dá)到最大，極顯著高于對(duì)照和其他處理(P<0.01)，分別比對(duì)照增加214 %、465 %和180 %。由此可見，鴨茅根系SOD活性對(duì)開花期白三葉莖浸提液的響應(yīng)要比根和葉浸提液更加明顯(圖1～3)。白三葉根和莖浸提液處理下，均是低濃度0.005 g/mL處理與對(duì)照差異不顯著(P>0.05)，高濃度(0.05～0.15 g/mL)與對(duì)照差異極顯著(P<0.01)。而葉浸提液，低濃度0.005 g/mL處理顯著低于對(duì)照(P<0.05)，高濃度(0.05～0.15 g/mL)處理均顯著高于對(duì)照(P<0.05，圖3)。由此得出鴨茅幼苗SOD活性對(duì)開花期白三葉莖浸提液的響應(yīng)要比根和葉浸提液更加明顯。

圖2 鴨茅幼苗超氧化物歧化酶(SOD)活性對(duì)白三葉莖浸提液的響應(yīng)Fig.2 Effect of Trifolium repens stem aqueous extract on the SOD activities of Dactylis glomerata seedling

圖3 鴨茅幼苗超氧化物歧化酶(SOD)活性對(duì)白三葉葉浸提液的響應(yīng)Fig.3 Effect of Trifolium repens leaf aqueous extract on the SOD activities of Dactylis glomerata seedling

2.4.2 過(guò)氧化物酶(POD)活性 白三葉根浸提液處理下，鴨茅幼苗葉片中的POD活性整體呈現(xiàn)出明顯下降趨勢(shì)(P<0.05)。其中，根浸提液處理下，鴨茅葉片POD活性均極顯著低于對(duì)照(P<0.01，圖4)；莖浸提液處理下，不同濃度處理均與對(duì)照差異極顯著(P<0.01)，濃度0.005 g/mL處理下的鴨茅葉片POD活性極顯著高于對(duì)照(P<0.01，圖5)；葉浸提液處理下，低濃度0.005、0.01 g/mL處理下的鴨茅葉片POD活性均顯著大于對(duì)照(P<0.05)，其余濃度處理均極顯著低于對(duì)照(P<0.01，圖6)。說(shuō)明鴨茅葉片POD活性對(duì)白三葉莖、葉浸提液的響應(yīng)要比根浸提液更加敏感。

字母下劃線是表示CAT酶活性的差異性，下同Letters underline indicated the significance among CAT enzyme activity, the same as below圖4 鴨茅幼苗過(guò)氧化物酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性對(duì)白三葉根浸提液的響應(yīng)Fig.4 Effect of Trifolium repens root aqueous extract on the POD and CAT activities of Dactylis glomerata seedling

圖5 鴨茅幼苗過(guò)氧化物酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性對(duì)白三葉莖浸提液的響應(yīng)Fig.5 Effect of Trifolium repens stem aqueous extract on the POD and CAT activities of Dactylis glomerata seedling

白三葉不同部位浸提液處理下，鴨茅根系POD活性的響應(yīng)不一致。其中，根浸提液和莖浸提液處理下，鴨茅根系POD活性呈整體上升趨勢(shì)，均在高濃度0.15 g/mL處理下達(dá)到最大值，極顯著高于對(duì)照和其他處理(P<0.01)，分別是對(duì)照處理的70.65倍和31.84倍；莖浸提液處理下的鴨茅幼苗根系POD活性均極顯著高于對(duì)照處理(P<0.01，圖4～5)。葉浸提液處理下，隨著濃度增加鴨茅根系POD活性呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)， 0.01～0.15 g/mL濃度處理下鴨茅根系POD活性極顯著高于對(duì)照(P<0.01，圖6)。表明，鴨茅根系POD活性對(duì)白三葉根和莖浸提液的響應(yīng)要比葉浸提液更加敏感。

2.4.3 過(guò)氧化氫酶(CAT)活性 鴨茅葉片和根系CAT活性對(duì)白三葉不同部位浸提液的響應(yīng)不一致，且鴨茅葉片CAT活性對(duì)白三葉不同部位水浸體液的響應(yīng)變化幅度整體要大于根系CAT活性的變化幅度。鴨茅葉片CAT活性對(duì)白三葉根浸體液和浸體液的響應(yīng)較為一致，隨著處理濃度的增加表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，均在0.01 g/mL處理下達(dá)到最大，顯著高于高濃度(0.05，010和0.15 g/mL)處理(P<0.05)，且與低濃度0.005 g/mL和對(duì)照處理差異不顯著(P>0.05，圖4～5)。然而，鴨茅葉片對(duì)白三葉葉浸提液的響應(yīng)不同于根和莖浸提液，隨著處理濃度增加，鴨茅葉片CAT活性呈顯著下降趨勢(shì)，不同濃度處理下的鴨茅葉片CAT活性均極顯著低于對(duì)照處理(P<0.01，圖6)。

圖6 鴨茅幼苗過(guò)氧化物酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性對(duì)白三葉葉浸提液的響應(yīng)Fig.6 Effect of Trifolium repens leaf aqueous extract on the POD and CAT activities of Dactylis glomerata seedling

鴨茅根系CAT活性對(duì)白三葉不同部位浸提液的響應(yīng)也不相同。其對(duì)白三葉根浸提液和莖浸提液的響應(yīng)較為一致，均隨著處理濃度的增加呈現(xiàn)出升高的趨勢(shì)；在0.15 g/mL處理下的鴨茅根系CAT活性，極顯著高于對(duì)照處理(P<0.01)；且對(duì)莖浸提液的響應(yīng)更為敏感(圖4～5)。鴨茅根系對(duì)白三葉葉浸提液的響應(yīng)不同于白三葉的根和莖，隨著浸提液濃度的增加，鴨茅葉片CAT活性呈降低的趨勢(shì)(圖6)。

3 討 論

丙二醛(MDA)是反映膜脂過(guò)氧化和組織的抗氧化能力強(qiáng)弱程度的指標(biāo)之一[19]，同時(shí)，也是一種有害物質(zhì)，能與細(xì)胞內(nèi)各種成分發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)及生理完整性的破壞[20]。本研究中，隨著白三葉各部位浸提液濃度的增加，鴨茅幼苗葉片MDA含量呈上升趨勢(shì)，這可能是鴨茅幼苗葉片膜質(zhì)過(guò)氧化程度增強(qiáng)，引起了細(xì)胞酶和膜的嚴(yán)重?fù)p傷，進(jìn)而導(dǎo)致MDA含量增加，也可能是由于活性氧清除劑活性受到抑制而造成的[21]。這與紫莖澤蘭(Eupatoriumadenophorum)葉水提液對(duì)玉米(Zeamays)、黃花蒿(Artemisiaannua)浸提液對(duì)小白菜(Brassicachinensis)和蘿卜幼苗生長(zhǎng)的化感效應(yīng)的研究結(jié)果相似[19, 22]。而鴨茅幼苗根系MDA含量隨著白三葉不同部位浸提液濃度的增加，呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，且在達(dá)到最大之后又出現(xiàn)降低現(xiàn)象，可能是由于鴨茅根系一些化感物質(zhì)被釋放，或是感應(yīng)到環(huán)境脅迫時(shí)產(chǎn)生的一種對(duì)環(huán)境脅迫的適應(yīng)機(jī)制[9]。

白三葉植株會(huì)釋放酚類化感物質(zhì)[23]，酚類物質(zhì)會(huì)影響受體植物細(xì)胞的生長(zhǎng)分化和抗氧化物酶(SOD)活性，破壞受體植物細(xì)胞內(nèi)自由基平衡和細(xì)胞膜的正常運(yùn)作，影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育[24-25]。SOD可以清除植物體內(nèi)的氧自由基，調(diào)節(jié)膜脂過(guò)氧化水平，保護(hù)細(xì)胞膜受傷，在白菜(Brassicapekinensis)等植物上的研究指出，隨著白三葉莖葉浸提液濃度的增加，白菜、紫花地丁(ViolayedoensisMakino.)和蘿卜幼苗SOD活性呈下降趨勢(shì)[25]，這與本研究的結(jié)果不同。植物SOD活性下降表明SOD酶逐漸失去活性，進(jìn)而導(dǎo)致受體植物鴨茅生長(zhǎng)受到的抑制逐漸增強(qiáng)，這可能植物抗氧化酶適應(yīng)逆境脅迫的一種機(jī)制[26]。表明，植物化感作用是植物進(jìn)化過(guò)程中應(yīng)對(duì)周圍環(huán)境脅迫形成的一種適應(yīng)機(jī)制[27]。

4 結(jié) 論

通過(guò)用開花期白三葉不同部位浸提液處理鴨茅幼苗，測(cè)定鴨茅地上部和地下部電解質(zhì)滲透率和SOD活性等指標(biāo)的測(cè)定得出，鴨茅幼苗葉片和根系對(duì)開花期白三葉不同部位浸提液，以及同一部位不同濃度的化感作用響應(yīng)不同。鴨茅葉片和根系電解質(zhì)滲透率對(duì)開花期白三葉莖、根浸提液的響應(yīng)要比葉浸提液更加敏感。鴨茅幼苗葉片和根系丙二醛含量對(duì)白三葉不同部位浸提液的響應(yīng)是莖和葉>根。從鴨茅幼苗脯氨酸含量變化可得出，白三葉不同部位浸提液表現(xiàn)出“低濃度無(wú)抑制，高濃度抑制”的影響，且莖>根≈葉。綜合鴨茅葉片和根系SOD、POD和CAT活性變化，均表現(xiàn)出莖>根≈葉。綜合各項(xiàng)指標(biāo)，得出開花期白三葉莖浸提液對(duì)鴨茅幼苗的化感作用較大，其次是根和葉。因此，在人工混播草地建植和管理環(huán)節(jié)，需嚴(yán)格控制混播用種白三葉的播種比例和監(jiān)控其繁殖比例，將白三葉對(duì)混播草地的化感影響降到最低。