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    轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Lmo2672對(duì)LM環(huán)境適應(yīng)性和應(yīng)激的調(diào)控作用

    2020-12-10 10:48:58張星星孟慶玲王曉婷才學(xué)鵬
    關(guān)鍵詞:氧化應(yīng)激家族試劑盒

    李 杰,張星星,孟慶玲,喬 軍*,李 妍,王曉婷,李 靜,才學(xué)鵬

    (1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,新疆 石河子 832003;2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆 石河子 832000;3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所,甘肅 蘭州 730046)

    【研究意義】單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes, LM)是一種重要的食源性病原菌之一,廣泛分布于自然界,能在外界環(huán)境中長(zhǎng)期存活[1]。人類通過食用被感染的食物經(jīng)消化道感染機(jī)體,引起感染者發(fā)生敗血癥、腦膜炎、胃腸炎、流產(chǎn)等嚴(yán)重疾??;免疫能力低下者感染后死亡率較高[2-3]。LM能在0.4 ~ 45 ℃、pH值2.5、滲透壓高、20 % NaCl和0.025 %過氧化氫等極端環(huán)境中生長(zhǎng)和生存[1,4-5],是動(dòng)物源性食品生產(chǎn)加工過程中的常見污染菌,對(duì)食品安全構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】為了適應(yīng)不同環(huán)境,LM轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子可通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)從而改變其環(huán)境適應(yīng)能力[8-9]。目前,已在LM中鑒定出多種環(huán)境調(diào)控因子,其中prfA和sigB在環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)中扮演重要角色,它們通過調(diào)節(jié)抗性基因的轉(zhuǎn)錄使LM適應(yīng)各種不利環(huán)境[6-9]。此外,HrcA和CtsR也參與應(yīng)激反應(yīng)基因的調(diào)控[10-12];SOS作為修復(fù)受損DNA的一種機(jī)制,而RecA和LexA分別控制SOS反應(yīng)的激活和抑制,也參與了對(duì)環(huán)境脅迫的適應(yīng)性[16-17],有研究發(fā)現(xiàn),AraC家族是存在于革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性菌中的一種轉(zhuǎn)錄因子,對(duì)細(xì)菌一些基因的轉(zhuǎn)錄具有調(diào)控作用,參與細(xì)菌毒力的調(diào)控及抵抗不良應(yīng)激環(huán)境[6,15]。該家族中的螺旋-旋轉(zhuǎn)-螺旋(HTH) DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域可與基因的啟動(dòng)子結(jié)合,激活基因轉(zhuǎn)錄從而發(fā)揮調(diào)控作用[16-17]。前期的生物信息學(xué)分析表明,lmo2672屬于AraC家族成員,然而目前LMlmo2672具體的生物學(xué)功能尚不清楚。【本研究切入點(diǎn)】本研究利用構(gòu)建的lmo2672基因缺失株,比較LM EGD-e與LM-Δlmo2672在不同應(yīng)激環(huán)境中環(huán)境適應(yīng)能力,通過qRT-PCR分析了應(yīng)激調(diào)節(jié)因子(prfA、sigB、ctsR、hrcA、lexA、recA)和氧化應(yīng)激相關(guān)基因(fri、kat、perR、sod)轉(zhuǎn)錄水平的變化,探討了lmo2672對(duì)LM氧化環(huán)境中的調(diào)控作用?!緮M解決的關(guān)鍵問題】為進(jìn)一步揭示AraC家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Lmo2672在LM中的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 菌株與試劑

    LM EGD-e菌株由德國(guó)伍茲堡大學(xué)W. Goebel惠贈(zèng);pKSV7由本實(shí)驗(yàn)室保存;pMD19-T載體、T4連接酶、限制性酶切酶KpnI和PstI購(gòu)自TaKaRa公司,基因組DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒及質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自TIANGEN生物有限公司,氯霉素、膽汁酸鹽購(gòu)自Sigma公司,氯化鈉購(gòu)自天津盛奧生物試劑公司,腦心浸出液(BHI)購(gòu)自青島海博生物科技有限公司。

    1.2 引物

    根據(jù)GenBank發(fā)表的LM標(biāo)準(zhǔn)株(LM EGD-e)基因組序列(登錄號(hào):AL591824.1),應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)LM缺失株的構(gòu)建、鑒定及qRT-PCR相關(guān)引物,其中R1和R4引物的5’端分別引入酶切位點(diǎn)KpnI和PstI (斜體下劃線部分),引物均由北京華大基因公司合成 (表1)。

    表1 本研究中所用引物

    續(xù)表1 Continued table 1

    1.3 LM-Δlmo2672缺失株的構(gòu)建與鑒定

    采用基因組DNA提取試劑盒提取LM EGD-e菌株的基因組DNA,以DNA為模板,利用引物R1/R2、R3/R4分別擴(kuò)增lmo2672基因的上、下游同源臂,將獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,根據(jù)膠回收試劑盒的操作步驟進(jìn)行回收,將上、下游臂的膠回收產(chǎn)物進(jìn)行融合,獲得缺失目的基因的融合片段。將其與溫控質(zhì)粒pKSV7進(jìn)行16 ℃過夜連接,構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pKSV7-Δlmo2672。將pKSV7-Δlmo2672電轉(zhuǎn)至LM感受態(tài)細(xì)胞中,在氯霉素和42 ℃雙重抗性下進(jìn)行同源重組獲得缺失株,對(duì)獲得的LM-Δlmo2672缺失株用旁外側(cè)引物R5/R6檢測(cè)并測(cè)序進(jìn)行鑒定。同時(shí)將LM-Δlmo2672缺失株在無氯霉素抗性,37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)20代并用R5/R6進(jìn)行PCR檢測(cè)其遺傳穩(wěn)定性。

    1.4 lmo2672基因缺失對(duì)LM在不同應(yīng)激環(huán)境中適應(yīng)能力的影響

    分別挑取LM EGD-e和LM-Δlmo2672單菌落過夜培養(yǎng),調(diào)整菌液OD600約為0.4,分別接種于新鮮BHI培養(yǎng)基放置于不同溫度(37、42 ℃),或者分別在37 ℃接種于含5 % NaCl、0.3 %膽酸鹽、5 mM H2O2、1 % Triton X-100的BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每株菌設(shè)置3個(gè)平行,每2 h測(cè)定其OD600 nm以代表菌株生長(zhǎng)情況,繪制生長(zhǎng)曲線比較LM EGD-e和LM-Δlmo2672生長(zhǎng)曲線。

    1.5 RNA的提取及cDNA的合成

    將待測(cè)菌株在37 ℃,180 r/min過夜振蕩培養(yǎng),離心收集菌體,用含5 mM H2O2BHI調(diào)整菌液OD600至0.6,并放置37 ℃暴露于H2O2環(huán)境中30 min;離心收集菌體,用液氮研磨至粉狀;根據(jù)Trizol法的操作分別提取LM EGD-e和LM-Δlmo2672細(xì)菌總RNA;使用Nanodrop 2000測(cè)量RNA濃度,并通過260/280和230/260 nm的比值以評(píng)估RNA是否被蛋白質(zhì)和有機(jī)物污染。同時(shí)利用兩步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,得到終體積為20 μl的cDNA;并用Nanodrop 2000分光光度計(jì)測(cè)定cDNA濃度。

    1.6 相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的qRT-PCR分析

    以統(tǒng)一濃度的cDNA為模板,以管家基因rpoB作為內(nèi)參,在LightCycler 480儀器上進(jìn)行qRT-PCR,反應(yīng)采用SYBR Green Ⅰ Master mix和1.0 μM濃度的引物進(jìn)行。測(cè)定6個(gè)環(huán)境應(yīng)激調(diào)控相關(guān)基因(prfA、sigB、ctsR、hrcA、lexA、recA)和4個(gè)氧化應(yīng)激相關(guān)基因(perR、kat、sod、fri)的轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果根據(jù)2-ΔΔCT的方法計(jì)算各個(gè)基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。本試驗(yàn)進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù),結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

    1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

    所有試驗(yàn)均重復(fù)3次,采用GraphPad Prism 5.0進(jìn)行組間差異顯著性分析,數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。P<0.05被認(rèn)為差異顯著,P<0.01被認(rèn)為差異極顯著。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 LM-Δlmo2672的構(gòu)建、鑒定及遺傳穩(wěn)定性分析

    利用R5/R6引物篩選擴(kuò)增出1502 bp條帶的重組菌株(圖1);同時(shí)進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步證明成功構(gòu)建LM-Δlmo2672缺失株。在37 ℃、無氯霉素抗性的培養(yǎng)基中繼續(xù)傳20代,R5/R6引物檢測(cè)均可擴(kuò)增出1502 bp單一片段(圖2),表明LM-Δlmo2672具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

    2.2 lmo2672基因缺失對(duì)LM環(huán)境適應(yīng)能力的影響

    在37和42 ℃條件下,在37 ℃更適應(yīng)LM菌生長(zhǎng),且2株菌的生長(zhǎng)趨勢(shì)相同,在細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中, LM-Δlmo2672的生長(zhǎng)顯著慢于LM EGD-e(P< 0.05,圖3-A、圖3-B);在含5 % NaCl培養(yǎng)基中,0~6 h LM EGD-e和LM-Δlmo2672幾乎不生長(zhǎng),在6 h之后LM-Δlmo2672生長(zhǎng)速度顯著低于LM EGD-e(P<0.05,圖3-C)。在1 % Triton X-100 BHI中, 與LM EGD-e相比,LM-Δlmo2672在6~12 h內(nèi)生長(zhǎng)差異顯著(P<0.05,圖3-D);在含0.3 %的膽酸鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 h以后,2株菌生長(zhǎng)情況差異顯著(P<0.01,圖3-E);在含5 mM H2O2BHI培養(yǎng)基中LM-Δlmo2672不生長(zhǎng),極顯著低于親本株LM EGD-e(P<0.01,圖3-F),表明lmo2672缺失降低了LM的環(huán)境適應(yīng)能力。

    M:DNA Marker DL-2000;1:LM EGD-e;2~3:LM-Δlmo2672重組菌;4:陰性對(duì)照;5.LM EGD-e圖1 LM-Δlmo2672重組菌的鑒定Fig.1 Identification of recombinant LM-Δlmo2672

    2.3 環(huán)境應(yīng)激調(diào)控基因及氧化應(yīng)激相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的測(cè)定

    在H2O2環(huán)境中暴露30 min后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與LM EGD-e相比,LM-Δlmo2672中recA和fri基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(P<0.05),表明在氧化環(huán)境中l(wèi)mo2672缺失能誘導(dǎo)recA和fri基因的轉(zhuǎn)錄水平;除recA和fri基因外,其余基因的表達(dá)量均出現(xiàn)不同程度的降低,其中prfA,lexA,fri,perR,kat,sod差異顯著(P<0.05,圖4),表明lmo2672對(duì)LM環(huán)境應(yīng)激和氧化應(yīng)激相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平有影響。

    M:DNA Marker DL-2000;1~3:LM-Δlmo2672重組菌;4:陰性對(duì)照;5:LM EGD-e圖2 LM-Δlmo2672重組菌遺傳穩(wěn)定性的檢測(cè)Fig.2 Analysis of genetic stability of LM-Δlmo2672

    3 討 論

    LM具有極強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力,能夠在食品加工、貯藏、運(yùn)輸?shù)葢?yīng)激環(huán)境條件生存[18-19]。為了適應(yīng)不同的應(yīng)激環(huán)境,LM依靠眾多的調(diào)控因子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控。在大腸桿菌中研究發(fā)現(xiàn),AraC家族蛋白在細(xì)菌應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮了調(diào)控作用。AraC家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Rob通過上調(diào)micF使大腸桿菌對(duì)膽汁酸產(chǎn)生耐受[20-21];Pletzer等人發(fā)現(xiàn)AraC家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子OpiA過表達(dá)時(shí)對(duì)大腸桿菌在pH和高滲透壓環(huán)境的耐受性顯著增加[17]。然而,目前LMAraC家族成員Lmo2672的生物學(xué)作用至今尚不清楚。本研究利用同源重組技術(shù)構(gòu)建LM-Δlmo2672缺失株,測(cè)定在不同應(yīng)激環(huán)境中LM EGD-e和LM-Δlmo2672的生長(zhǎng)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LM-Δlmo2672在37 ℃、42 ℃、5 % NaCl、0.3 %膽酸鹽、5 mM H2O2及1 % Triton X-100的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)顯著低于LM EGD-e,提示AraC家族Lmo2672在LM環(huán)境適應(yīng)和應(yīng)激過程中發(fā)揮了調(diào)控作用。

    A~F:分別為42 ℃,37 ℃,5% NaCl,1 % TrionX-100,0.3 %膽酸鹽,5 mM H2O2環(huán)境中的生長(zhǎng)情況圖3 不同應(yīng)激環(huán)境對(duì)LM EGD-e和LM-Δlmo2672生長(zhǎng)曲線的影響Fig.3 Growth curves of LM EGD-e and the LM-Δlmo2672 deletion mutant strains at different environmental stresses

    圖4 氧化應(yīng)激環(huán)境下LM EGD-e和LM-Δlmo2672壓力調(diào)控相關(guān)基因及氧化應(yīng)激相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平分析Fig.4 Relative transcriptional levels of the genes related to stress regulator and oxidative stress response in the LM EGD-e and LM-Δlmo2672 under the oxidative stress

    在外界環(huán)境中,LM常暴露于氧化應(yīng)激中,為了防止氧化應(yīng)激引起的損傷,細(xì)菌自身的防御系統(tǒng)可通過啟動(dòng)相關(guān)的抗氧化機(jī)制來抵御ROS[22-23]。清除活性氧組分的超氧化物歧化酶(sod)將高活性的超氧化物轉(zhuǎn)化為過氧化氫,過氧化氫又被過氧化氫酶(kat)轉(zhuǎn)化為水和氧[24];fri編碼類鐵蛋白Dps,據(jù)報(bào)道Dps在保護(hù)細(xì)胞抵御ROS時(shí)有雙重作用,它可以直接與DNA結(jié)合調(diào)控應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá),以保護(hù)細(xì)菌免受H2O2的傷害[25]。研究表明,在不同的環(huán)境應(yīng)激(例如熱應(yīng)激、冷應(yīng)激、膽酸鹽應(yīng)激)中均可誘導(dǎo)fri基因的表達(dá)[26-28]。本研究發(fā)現(xiàn),在氧化應(yīng)激作用下,fri基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生明顯改變,表明該基因參與了抵御氧脅迫的作用。有研究表明,外源性ROS造成的DNA損傷會(huì)誘導(dǎo)recA基因的表達(dá)啟動(dòng)SOS反應(yīng)機(jī)制以適應(yīng)氧脅迫環(huán)境[26-28]。本研究中發(fā)現(xiàn),lmo2672基因缺失后,recA基因轉(zhuǎn)錄水平顯著增強(qiáng),推測(cè)可能是通過recA基因的高表達(dá)來啟動(dòng)SOS反應(yīng),從而維持其生存,提示lmo2672可通過調(diào)控recA基因的表達(dá)以抵抗環(huán)境應(yīng)激。

    4 結(jié) 論

    總之,本研究通過構(gòu)建LM AraC家族lmo2672基因缺失株,證實(shí)了LM-Δlmo2672缺失株通過調(diào)控環(huán)境應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá),顯著降低抵抗環(huán)境應(yīng)激的能力,尤其在氧化應(yīng)激環(huán)境中,LM-Δlmo2672缺失株fri及recA基因被誘導(dǎo)高表達(dá),表明lmo2672基因在適應(yīng)氧化應(yīng)激環(huán)境中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用,為進(jìn)一步探究LMlmo2672調(diào)控應(yīng)激環(huán)境的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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