超聲波對鎘脅迫鴨茅和冰草種子萌發(fā)的影響

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(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院， 陜西 楊凌 712001)

土壤重金屬污染是當(dāng)今環(huán)境研究的熱點問題。鎘是生物毒性最強的一個重金屬元素，我國約有1.3萬公頃的耕地受鎘污染[1]。鎘在土壤中難降解、移動性大[2]，能夠在土壤和生物體內(nèi)富集，污染土壤和作物，干擾植物正常生理代謝，影響植物的生長、發(fā)育[3]、造成作物產(chǎn)量和品質(zhì)的下降[4]，并且容易通過食物鏈的富集作用危及人類的健康，對人體具有致病、致癌、致突變作用[5]。由于多數(shù)牧草具有分蘗力強，可以通過反復(fù)刈割來降低土壤中重金屬的含量,因而牧草對重金屬污染的土壤具有一定的修復(fù)作用，近年來，國內(nèi)外至少有數(shù)十種牧草開始用于重金屬污染土壤的修復(fù)上[6]，如紫花苜蓿、紅三葉、黑麥草等。鴨茅是一種良好的冬春飼草，抗寒性較好[7]，是西部退耕還草，建立林-草復(fù)合植被生態(tài)系統(tǒng)的重要草種[8]，冰草是一種重要的固沙植物也是一種優(yōu)良飼草[9]但是關(guān)于鴨茅和冰草對重金屬污染的植物修復(fù)作用報道的很少。

因此選用耐鎘脅迫的鴨茅和冰草就顯得尤為重要。但考慮到育種花費時間長，投入人力、物力、財力大。因此選擇一種簡單、經(jīng)濟的方法提高鴨茅和冰草的耐鎘能力，使其在重金屬鎘污染的土壤上能夠生長良好，再通過反復(fù)刈割從而降低土壤重金屬鎘的含量。超聲波可以用于提取污泥中的重金屬[10]，來降低土壤中重金屬的含量，從而降低土壤中過量重金屬對植物生長發(fā)育的抑制作用，提高作物產(chǎn)量，改善作物品質(zhì)。有文獻(xiàn)報道稱植物種子經(jīng)超聲波發(fā)生儀處理后，可以提高種子活力、促進(jìn)種子萌發(fā)及幼苗生長、增加植物的抗逆能力及產(chǎn)量[11-14]，超聲波也可以促進(jìn)生物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)樯锬茉碵15-16]。但是，關(guān)于超聲波處理下重金屬脅迫的報導(dǎo)很少。因而本實驗擬在前人的基礎(chǔ)上研究重金屬鎘脅迫下超聲波對鴨茅和冰草發(fā)芽率、胚芽長的影響以及鴨茅幼苗中過氧化物酶(peroxidase, POD)活性、丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量的影響，為其進(jìn)一步利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選取2013年收獲的純凈、無雜質(zhì)的鴨茅和冰草種子作為試驗材料。試驗在西北農(nóng)林科技大學(xué)草業(yè)科學(xué)實驗室2016-2017年進(jìn)行。儀器包括：分光光度計、超聲波發(fā)生儀、分析天平等。

1.2 種子發(fā)芽培養(yǎng)與處理方法

試驗前先用蒸餾水浸泡種子3 h，然后用10%的H2O2溶液消毒20 min，最后用蒸餾水沖洗3～4次。把兩種種子各分成六份，分別用超聲波處理0、5、10、15、25、35 min。

種子采用培養(yǎng)皿紙上發(fā)芽法進(jìn)行發(fā)芽處理，每個培養(yǎng)皿均放置五十粒種子。試驗設(shè)計為，種子經(jīng)不同時長超聲波處理(0、5、10、15、25、35 min)后，每天對其澆灌定量不同濃度的氯化鎘溶液(0.00%、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%)，共36個處理，每一個處理均重復(fù)3次。種子萌發(fā)及幼苗生長均在溫室中進(jìn)行(溫度25℃，光照30.05 lx)。培養(yǎng)20天后統(tǒng)計發(fā)芽率、胚根長、胚芽長以及測定鴨茅幼苗中不同處理下的生理指標(biāo)，取3個重復(fù)值得到平均值進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的分析。

表1 對鴨茅和冰草種子的處理方法Table 1 Treatments on the seeds of D. glomerata and A. cristatum

1.3 生理生化指標(biāo)的測定

每天都統(tǒng)計兩種種子的發(fā)芽勢，20天后統(tǒng)計各個處理下的發(fā)芽率、胚芽長、胚根長以及鴨茅幼苗中POD活性、MDA含量。其中POD的活性采用愈創(chuàng)木酚法測定[17]，MDA的含量采用硫代巴比妥酸法測定[18]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007軟件和SAS軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 各處理對鴨茅和冰草種子發(fā)芽率的影響

鴨茅種子經(jīng)超聲波處理后，均能夠促進(jìn)種子發(fā)芽率，在超聲波處理5、10、15min顯著提高種子的發(fā)芽率(表2)。其中以超聲波處理5 min(處理2)效果最明顯，種子發(fā)芽率比對照組高出18.67%。冰草種子比鴨茅種子發(fā)芽率低，冰草種子經(jīng)超聲波處理后，在超聲波5 min的處理下促進(jìn)種子發(fā)芽率，比對照組高出4.00%，而其余時間的處理均抑制冰草種子的發(fā)芽率，在超聲波35 min處理下(處理6)冰草種子發(fā)芽率最低，比對照組低出4.00%(表2)。

在單一鎘溶液的處理下，相比于對照組，五種不同濃度的鎘處理均抑制鴨茅種子的發(fā)芽(表2)。當(dāng)鎘溶液的濃度大于0.03%(處理9)時顯著抑制。抑制程度和鎘溶液的濃度不是呈現(xiàn)單一的線性關(guān)系。當(dāng)鎘溶液的濃度為0.01 %(處理7)時抑制程度最大，發(fā)芽率僅為對照組的3.33%。對于冰草種子，在鎘溶液的濃度為0.04%(處理10)時，促進(jìn)冰草種子發(fā)芽，比對照組高出18.00%，其余濃度的鎘處理效果不顯著。

表2 單一超聲波或者鎘處理對鴨茅和冰草種子發(fā)芽率的影響Table 2 Effects of individual sonication or Cd+ treatment on seed germination of D. glomerata and A. cristatum/%

注：平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤

Note：Average value±Standard error

由表3可知，超聲波和鎘處理對鴨茅種子發(fā)芽率的交互作用在超聲波時長為5min和鎘溶液的濃度為0.02%時發(fā)揮的效果最大。由表4可知，超聲波和鎘處理對冰草種子交互作用的效果在超聲波時長為10 min和鎘溶液的濃度為0.01%時發(fā)揮的效果最大。

表3 超聲波和鎘處理對鴨茅種子發(fā)芽率的交互作用Table 3 Interacts of sonication and cadmium stress on germination percentage in D.glomerata

表4 超聲波和鎘處理對冰草種子發(fā)芽率的交互作用Table 4 Interaction of sonication and cadmium stress on seed germination rateof A. cristatum

由圖1可知，當(dāng)鎘溶液濃度為0.01%時，五種不同時長的超聲波均提高鴨茅種子的發(fā)芽率，在超聲波處理10 min時，發(fā)芽率達(dá)到最大為68.67%。當(dāng)鎘溶液濃度大于0.01%時，不同時長的超聲波處理對鴨茅種子的發(fā)芽率影響不同，但都在超聲波10

min時有促進(jìn)作用。對于冰草種子而言，在鎘溶液的濃度為0.01%、0.02%、0.03%、0.04 %時，各超聲波處理促進(jìn)效果不顯著或者表現(xiàn)為抑制作用，但在鎘溶液濃度為0.05 %時，各超聲波處理均顯著促進(jìn)。

圖1 超聲波和鎘溶液的組合處理對鴨茅和冰草種子發(fā)芽率的影響Fig.1 Effects of combining sonication and cadmium on seed germination rate of D glomerata and A cristatum注：*表示交互作用，下同Note:*indicates interaction, the same as below

2.2 各處理對鴨茅和冰草幼苗胚芽生長的影響

由圖2可知，單一超聲波處理下，超聲波10 min可以促進(jìn)鴨茅和冰草幼苗的生長，但各超聲波處理對鴨茅和冰草幼苗生長均表現(xiàn)為促進(jìn)效果不顯著，在超聲波5 min時顯著抑制鴨茅幼苗生長，在超聲波35 min時顯著抑制冰草幼苗的生長。單一鎘溶液處理下，五種不同濃度的鎘溶液均顯著抑制鴨茅幼苗生長，對冰草幼苗生長也均表現(xiàn)為抑制作用。鎘溶液和超聲波交互處理鴨茅時，對于鴨茅幼苗而言：當(dāng)鎘溶液的濃度為0.01%時，不同時長的超聲波處理均顯著促進(jìn)鴨茅幼苗的生長，當(dāng)鎘溶液的濃度大于0.01 %時，各超聲波處理對鴨茅胚芽生長均表現(xiàn)為抑制作用或促進(jìn)效果不顯著。對于冰草幼苗而言，當(dāng)鎘溶液的濃度為0.01%、0.02%、0.03%、0.04%時，各超聲波處理對冰草幼苗胚芽的生長均表現(xiàn)為抑制作用或促進(jìn)效果不顯著，當(dāng)鎘溶液的濃度為0.05%時，各超聲波處理顯著抑制冰草幼苗的生長。

由表5可知，超聲波和鎘交互處理對鴨茅胚芽的生長在超聲波時長為5 min和鎘溶液的濃度為0.02 %時發(fā)揮的效果最大。由表6可知，超聲波和鎘的交互處理對冰草胚芽的生長在超聲波時長為10 min和鎘溶液的濃度為0.05%時發(fā)揮的效果最大。

2.3 各處理對鴨茅幼苗中POD活性的影響

在圖3中，單一超聲波處理下，與對照組相比，各超聲波處理均提高鴨茅幼苗中POD的活性，在超聲波處理5 min和35 min時，促進(jìn)效果顯著，超聲波5 min處理下POD活性最大為228.72 μg·g-1FW·min-1。單一鎘溶液處理下，鎘溶液濃度為0.02 %時顯著提高鴨茅幼苗POD的活性。鎘溶液與超聲波交互處理鴨茅時：當(dāng)鎘溶液的濃度為0.01 %時，各超聲波處理均顯著提高鴨茅幼苗中POD的活性，且隨著超聲波處理時間的增長，POD活性逐漸降低，在超聲波5 min處理下，鴨茅幼苗中POD的活性最大為374.905 μg·g-1FW·min-1。

2.4 各處理對鴨茅幼苗中MDA含量的影響

在圖3中，單一超聲波處理下，與對照組相比，各超聲波處理均使鴨茅幼苗中MDA的含量增加。單一鎘溶液處理下，對鴨茅幼苗中MDA的含量表現(xiàn)為抑制或增加效果不顯著。兩種處理交互作用下，當(dāng)鎘的濃度為0.01 %時、超聲波25 min處理的鴨茅幼苗中MDA含量最少，當(dāng)鎘的濃度為0.02 %時、超聲波15 min處理的鴨茅幼苗中MDA含量最少。當(dāng)鎘的濃度為0.03、0.04 %時，超聲波處理均顯著降低了鴨茅幼苗中MDA的含量。

圖2 各處理對鴨茅幼苗胚芽長的影響Fig.2 Effects of different treatments on plumule length of D glomerata and A cristatum seedlings

圖3 各處理下鴨茅POD活性、MDA含量的變化Fig.3 Effects of different treatments on POD activity、MDA content in D glomerata seedlings

表5 超聲波和鎘處理對鴨茅胚芽長的交互作用Table 5 Interaction of sonication and cadmium stress on plumule length of D. glomerata

處理Treatments2Time of sonication,5 min310 min415 min525 min635 min7 Cd2+, 0.01%1.28 1.68 1.48 -0.07 -0.64 80.02%1.12 0.76 -0.73 -0.27 -0.45 90.03%-1.13 1.07 -1.14 -1.00 1.09 100.04%-1.09 -0.25 -0.33 0.38 -0.02 110.05%-0.71 -0.58 0.20 -0.25 -0.40

表6 超聲波和鎘處理對冰草胚芽長的交互作用Table 6 Interaction of sonication and cadmium stress on plumule length of A. cristatum

3 討論

3.1 超聲波對發(fā)芽率、胚芽生長以及鴨茅幼苗POD活性、MDA含量的影響

超聲波實際上是把電能轉(zhuǎn)變?yōu)槌曊鹗幮问降膭幽軅魅敕N子的細(xì)胞中，刺激生命運動的增強，加速種子內(nèi)部的生理生化反應(yīng)[19]。本試驗采用五種不同時長的超聲波處理鴨茅種子，結(jié)果表明；這五種時長的超聲波均促進(jìn)鴨茅種子的發(fā)芽，且在5 min時鴨茅發(fā)芽率達(dá)到最大。冰草種子發(fā)芽率較低，且僅在超聲波5 min處理下，發(fā)芽率提高。有研究表明一定時長的超聲波處理某種種子可以打破該種子的休眠，如張文明等研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)超聲波處理水稻種子5～10 min時促進(jìn)其發(fā)芽率[20]。在播種之前采用一定時長的超聲波處理種子，可以提高種子發(fā)芽率，達(dá)到增收的效果。

本試驗發(fā)現(xiàn)同一超聲波處理鴨茅種子，5 min時促進(jìn)鴨茅種子的發(fā)芽率但是卻抑制鴨茅胚芽的生長，試驗表明超聲波對鴨茅發(fā)芽率和胚芽生長之間不是共同促進(jìn)的作用。超聲波35 min時抑制冰草胚芽的生長。莊南生等研究結(jié)果表明：一定時間的超聲波處理可以促進(jìn)植物胚芽的生長[21]。Wang[22]等研究結(jié)果表明在超聲波溫度為39.7℃、處理時長為22.5 min、輸出功率為348W時柳枝稷胚芽生長最好，因此可以繼續(xù)研究找到可以同時促進(jìn)鴨茅種子或冰草種子發(fā)芽率和胚芽長的超聲波時長，來使得田間出苗更快更整齊。

POD是清除活性氧系統(tǒng)中的重要酶，有抑制膜脂過氧化，延緩細(xì)胞衰老的作用[23]，還能促進(jìn)細(xì)胞生長、是重要的防御機制[24].本試驗表明五種不同時長的超聲波均提高鴨茅幼苗中POD的活性，其中在超聲波5 min時POD的活性最高。孫立軍等研究表明當(dāng)超聲波處理30 min的人參種子時其幼苗中POD的活性最高[25]。因此，一定時長的超聲波處理特定種子，有利于提高該種子幼苗中POD的活性，從而起到保護該幼苗細(xì)胞的作用。

MDA是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)生還能加劇膜的損傷等多種生物學(xué)功能的惡化[26]。本次試驗所設(shè)置的超聲波時長均使鴨茅幼苗中丙二醛的含量增加，說明單一超聲波處理會破壞鴨茅的膜系統(tǒng)。趙奇等研究結(jié)果表明超聲波可以降低青椒丙二醛的含量[27]。這可能是由于材料及時間等不同造成的。

3.2 鎘脅迫對發(fā)芽率、胚芽生長以及鴨茅幼苗POD活性、MDA含量的影響

本試驗設(shè)置的不同濃度的鎘處理鴨茅和冰草種子時，鴨茅和冰草種子經(jīng)鎘脅迫處理后，除0.04%的鎘處理提高冰草種子發(fā)芽率，其余均表現(xiàn)為抑制種子發(fā)芽率。五種不同濃度的鎘溶液均顯著抑制鴨茅幼苗的生長，對冰草幼苗的生長也均表現(xiàn)為抑制作用。何俊瑜等研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鎘處理對小麥種子萌發(fā)有抑制效應(yīng)，且隨著鎘濃度的增加而增加[28]。這主要是離子濃度設(shè)置不同以及種子自身特性和環(huán)境不同的影響。重金屬污染較輕時，反而會提高某些植物的發(fā)芽率[29]。因此，在重金屬污染的土地上首先要明確各類重金屬含量的高低，然后要明確所種植的耐重金屬的草種對重金屬的敏感性，繼而選擇相應(yīng)的草種。

本試驗發(fā)現(xiàn)在鎘溶液濃度為0.02%時顯著提高鴨茅幼苗POD的活性，對鴨茅幼苗中MDA的含量無顯著作用。鄭愛珍等研究結(jié)果表明，青菜中過氧化物酶的活性隨鎘濃度的增加而增加[30]，樊明琴等研究結(jié)果表明，小麥幼苗中過氧化物酶的活性隨著鎘濃度的增加總體呈增加趨勢，先緩慢增加后急劇增加[31]，陳維等研究發(fā)現(xiàn)抽穗期的稗草隨著鎘濃度的增加MDA含量先降低后升高[32]。很多研究都表明在鎘溶液的某一濃度會促進(jìn)某種植物幼苗POD的活性或降低MDA的含量。因此，在保證提高種子發(fā)芽率的重金屬濃度范圍下，進(jìn)而找到促進(jìn)種子幼苗POD活性和降低MDA含量的重金屬濃度對獲得高產(chǎn)、抗逆的植株是至關(guān)重要的。

3.3 鎘脅迫下超聲波對發(fā)芽率、胚芽生長以及鴨茅POD活性、MDA含量的影響

本試驗研究表明：在五種不同濃度的鎘脅迫下，超聲波10 min的處理均可促進(jìn)鴨茅種子的發(fā)芽率。當(dāng)沒有鎘脅迫時，超聲波5 min對鴨茅種子的發(fā)芽率顯著促進(jìn)，因此，在鎘脅迫下，超聲波時間在一定范圍內(nèi)相應(yīng)的增大才會促進(jìn)鴨茅種子的發(fā)芽率。對于冰草而言，在鎘溶液濃度為0.05%時，各超聲波處理均顯著促進(jìn)冰草種子的發(fā)芽率。有研究發(fā)現(xiàn)超聲波與某一物質(zhì)的交互作用下對植物的發(fā)芽率并不是促進(jìn)作用，如董匯澤等發(fā)現(xiàn)超聲波處理時間較長時，赤霉素對柴胡種子萌發(fā)有一定的抑制作用[33]。史鋒厚等研究中發(fā)現(xiàn)超聲波處理時間較長時聚乙二醇對油松種子的萌發(fā)有抑制作用[34]。因此，在重金屬污染的土壤上種植某種植物，選擇相應(yīng)時長的超聲波處理尤為重要。

對于鴨茅種子而言，當(dāng)鎘溶液的濃度較小為0.01%時，不同時長的超聲波處理均顯著促進(jìn)鴨茅幼苗的生長，不同濃度鎘處理下各超聲波對冰草種子的胚芽生長無顯著作用。當(dāng)鎘溶液的濃度較小為0.01%時，較小時長的超聲波5 min處理鴨茅種子可以提高其幼苗中POD的活性。李妹娟研究結(jié)果表明[35]：超聲波處理可以提高鹽脅迫下水稻幼苗中POD的活性。在不同濃度的鎘溶液脅迫下，較長時間的超聲波處理(>10 min)可以相對減少鴨茅幼苗中MDA的含量。因此，在重金屬鎘含量超標(biāo)的土壤上，可各超聲波處理均顯著促進(jìn)冰草種子的發(fā)芽率以種植用10 min的超聲波處理過的鴨茅種子，來提高鴨茅種子的發(fā)芽率以及對重金屬鎘的抗性。

3.4 鎘和超聲波的交互作用

對于鴨茅種子來說可以在超聲波時長為5 min和鎘溶液的濃度為0.02%時處理以使得發(fā)芽率和胚芽的共同促進(jìn)。對于冰草種子而言，超聲波和鎘的交互作用對發(fā)芽率和胚芽生長各不相同。在重金屬污染的土地上，尋找到處理所用種子特定的超聲波時長，使得超聲波和重金屬的交互作用對種子發(fā)芽率和胚芽生長都有促進(jìn)作用，以此提高種子出苗率、促進(jìn)種子生長發(fā)育。因此，超聲波處理可以有效減緩鴨茅和冰草種子的鎘脅迫效應(yīng)，提高種子和成苗活力。

4 結(jié)論

超聲波與鎘溶液組合處理的交互作用顯示，在較低鎘溶液濃度(0.01%)時，超聲波顯著促進(jìn)鴨茅胚芽生長。在較高的鎘濃度(0.05%)脅迫下，超聲波處理10 min顯著提高鴨茅和冰草種子的發(fā)芽率；綜合來看，在生產(chǎn)實踐中，利用超聲波處理可以有效減緩鴨茅和冰草種子的鎘脅迫效應(yīng)，提高種子和成苗活力。