纖維素酶對常規(guī)水分和低水分稻草青貯品質(zhì)的影響

， ， ， *，

(1. 福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院， 福建 福州 350002； 2. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所， 福建 福州 350013； 3. 福建省新閩科生物科技開發(fā)有限公司， 福建 福州 350008； 4. 福建傲農(nóng)生物科技集團股份有限公司， 福建 漳州 363002)

稻草是稻(Oryzasativa‘Y302’)生產(chǎn)的副產(chǎn)物，中國年產(chǎn)稻草2～3億噸[1]。其中很大部分被堆放腐敗或者焚燒，用于動物飼料的數(shù)量很少。這不僅造成了資源浪費，又帶來環(huán)境污染。因此，開發(fā)利用稻草用于動物生產(chǎn)，不僅可以廣開飼料來源、緩解中國飼料資源短缺的現(xiàn)狀，還可以節(jié)省糧食、促進農(nóng)業(yè)生態(tài)的良性循環(huán)[2]。然而，自然干燥后的稻草是一種劣質(zhì)粗飼料，其粗纖維含量高、消化率低、適口性差[1]，而經(jīng)過處理的稻草能明顯改善適口性和提高營養(yǎng)價值[3]。在生物技術(shù)迅猛發(fā)展的21世紀，傳統(tǒng)的物理方法和化學(xué)方法大多被生物學(xué)方法取代。調(diào)制稻草青貯是利用稻草的最佳方法，它是集科學(xué)、環(huán)保、經(jīng)濟、易行的一種生物學(xué)方法。但稻草莖葉上自然附著的乳酸菌數(shù)目少，可溶性碳水化合物含量低，常規(guī)青貯法很難制成優(yōu)質(zhì)青貯飼料[1,4]。因此必須采用特種青貯法[5]。有研究表明黑麥草[6]、象草[7]、貓尾草等[8]，低水分青貯的品質(zhì)優(yōu)于常規(guī)青貯的品質(zhì)。因為降低原料的含水率，可使原料可溶性碳水化合物等養(yǎng)分濃縮[8-9]，能顯著提高青貯品質(zhì)。纖維素酶作為青貯添加劑倍受關(guān)注，因為纖維素酶能將植物細胞壁的結(jié)構(gòu)性多糖降解為單糖，為乳酸菌提供更多的可利用底物，促進乳酸菌發(fā)酵，從而改善青貯品質(zhì)[10-13]。迄今，研究不同水份的稻草青貯報道較少，更缺乏對不同因素相互影響的綜合研究。因此，本試驗在常規(guī)水分稻草青貯和低水分稻草青貯中添加不同水平的纖維素酶，探討原料含水率和纖維素酶添加水平這兩個因素的相互影響，為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的稻草青貯飼料提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

青貯原料稻草來源于福建農(nóng)林大學(xué)作物學(xué)院試驗基地。水稻品種為Y兩優(yōu)302，2011年7月2日播種，秧齡期為23 d，11月3日下午人工收割水稻、脫粒、將稻草平鋪晾曬。

青貯添加劑是纖維素酶，為夏盛實業(yè)集團有限公司產(chǎn)品，酶活為40 000 U·g-1。

1.2 試驗設(shè)計

設(shè)計調(diào)制常規(guī)水分和低水分2種含水率(moisture content, MC)的稻草青貯，含水率約70%和約40%，分別用MC1和MC2表示；在MC1和MC2青貯中均設(shè)0、20、40、80 mg·kg-1纖維素酶(cellulase，CEL)的4個濃度梯度，分別用CON、CEL1、CEL2、CEL3表示。每個處理組3個重復(fù)。

1.3 青貯調(diào)制

2011年11月4日將稻草切短成約1～2 cm長，混合均勻后按照四分法分為兩份，分別用于MC1和MC2青貯調(diào)制。隨即進行MC1青貯調(diào)制，每個重復(fù)稱取700 g，噴灑纖維素酶和蒸餾水共計10 mL(對照組噴灑蒸餾水)，混勻后裝入1 L專用青貯試驗塑料瓶內(nèi)，填裝、壓實、密封。常溫條件下貯存60 d開封，供分析測定。用于MC2青貯的稻草利用日光晾曬，11月5日進行青貯調(diào)制，每個重復(fù)稱取500 g，制作方法同MC1青貯調(diào)制。

1.4 測定項目與方法

原料與青貯飼料的分析樣品是在65℃下干燥48 h、回潮、粉碎制成的。采用常規(guī)法[14]測定水分(moisture)和粗蛋白質(zhì)(crude protein，CP)含量，中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)和酸性洗滌纖維(acid detergent fiber,ADF)含量用Van Soest 等[15]的方法測定，半纖維素(HC)=NDF-ADF?？扇苄蕴妓衔?water soluble carbohydrate,WSC)含量用比色法[16]測定。取代表性青貯飼料樣品100 g裝入有刻度的500 mL的廣口錐形瓶中，加入蒸餾水定容至500 mL，放置4℃冰箱中，18 h后用濾紙過濾，制備青貯飼料浸提液。用pH計測定浸提液的pH[17]；用島津LC-20AT型高效液相色譜(色譜柱：Shodex Rspak KC-811 S-DVB gel Column 300×8 mm，檢測器：SPD-M10AVp，流動相：3 mmol /L高氯酸)分析浸提液的乳酸、乙酸、丙酸、丁酸含量[18]；用苯酚-次氯酸鈉比色法[19]測定青貯飼料浸提液的氨態(tài)氮(NH3-N)。WSC、NDF、ADF、HC和CP以干物質(zhì)(dry mater,DM)基礎(chǔ)的百分比表示，LA、AA、PA和BA用新鮮(fresh matter,FM)基礎(chǔ)的百分比表示，DM用百分比表示，NH3-N換算為100 g新鮮青貯飼料中的mg數(shù)。氣體損失率(GLR)和干物質(zhì)回收率(dry matter recovery,DMR)通過計算得出，計算方法如下：

GLR(%)=[(裝填時裝入原料重-開封時回收青貯飼料重)/(裝填時裝入原料重×原料DM%)]×100；

DMR(%)=[(開封時回收青貯重×青貯飼料DM%)/(裝填時裝入原料重×原料DM%)]×100。

分別采用MRS瓊脂培養(yǎng)基(MRS agar medium，MRS)、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(nutrient agar，NA)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)計數(shù)材料上的乳酸菌、好氧性細菌、酵母菌和霉菌數(shù)量。乳酸菌用厭氧箱(YQX-Ⅱ型，上海新苗)，37℃培養(yǎng)2 d；好氧性細菌、酵母菌和霉菌在有氧條件下30℃培養(yǎng)2～3 d。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，采用one-way ANOVA進行單因素方差分析和S-N-K方法進行多重比較，結(jié)果及差異顯著性用平均數(shù)±標準差及肩標不同字母表示。

2 結(jié)果

2.1 稻草的化學(xué)成分和微生物組成

從表1可見，MC1和MC2稻草的WSC和CP含量很低，而NDF、ADF和HC含量較高。

從表2可見，MC1和MC2稻草中的乳酸菌數(shù)均未占優(yōu)勢，但乳酸菌數(shù)MC2顯著高于MC1(P<0.05)。

表1 稻草的化學(xué)成分Table 1 Chemical composition of rice straw

注：數(shù)據(jù)為WSC、NDF、ADF、HC和CP占稻草干重的百分比；同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)；下同

Note: The WSC，NDF，ADF，HC and CP were calculated on a dry matter basis. The different lowercase letters (a,b) within rows indicate significant difference at the 0.05 level, the same letters indiente no different. The same as below

表2 稻草中微生物數(shù)量Table 2 The number of microorganisms in rice straw

注：數(shù)據(jù)為LA、AA、PA和BA占稻草青貯鮮重的百分比

Note: The LA, AA, PA and BA were calculated on a fresh weight basis

2.2 青貯的發(fā)酵品質(zhì)

含水率、纖維素酶及二者間的交互作用對青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響如表3所示。含水率、纖維素酶及其二者間的交互作用對pH均有極顯著的影響(P<0.01)，含水率、纖維素酶對NH3-N均有極顯著的影響(P<0.01)，另外，含水率對LA、AA、PA和DMR有極顯著或顯著的影響(P<0.01，P<0.05)。

隨原料含水率的降低，4個處理組的pH和DMR顯著升高(P<0.05)、AA顯著減少(P<0.05)，CON組、CEL1組和CEL3組的NH3-N顯著減少(P<0.05)，CEL3組的LA顯著減少(P<0.05)，CON組的PA顯著減少(P<0.05)。

在MC1青貯中，4個處理組均表現(xiàn)LA少而AA多。在pH上，CEL1組和CEL2組顯著低于CON組(P<0.05)。CEL2組的NH3-N顯著減少(P<0.05)，且顯著低于CEL1組和CEL3組(P<0.05)。在MC2青貯中，4個處理組均表現(xiàn)LA多而AA少。在pH上，CEL1組、CEL2組和CEL3組均顯著低于CON組(P<0.05)，CEL1組和CEL2組顯著低于CEL3組，CEL2組顯著低于CEL1組(P<0.05)。在DMR上，CEL2組和CEL3組顯著高于CON組(P<0.05)。另外，CEL2組的NH3-N顯著減少(P<0.05)。

注：數(shù)據(jù)為LA、AA、PA和BA占稻草青貯鮮重的百分比 ；同列不同大寫字母表示不同含水率處理間差異顯著(P<0.05)，同列不同小寫字母表示不同纖維素酶添加處理間差異顯著(P<0.05)；**表示在0.01水平上差異顯著；*表示在0.05水平上差異顯著；NS表示無顯著差異

Note: The LA, AA, PA and BA were calculated on a fresh matter basis. Different letter (A, B) within rows were significant difference (P<0.05) among the different moisture content treatments, the different letters (a, b, c, d) within rows meant significant difference (P<0.05) among the different cellulase level treatments. ** and * indicate significant difference at the 0.01 and 0.05 level, respectively; NS indicate no significant difference. The same as below

2.3 青貯飼料的化學(xué)成分

含水率、纖維素酶及二者間的交互作用對青貯化學(xué)成分的影響如表4所示。含水率、纖維素酶對DM、WSC、NDF和ADF有極顯著或顯著的影響(P<0.01，P<0.05)，在DM和NDF上，含水率與纖維素酶之間有極顯著和顯著的交互作用(P<0.01，P<0.05)。

隨原料含水率的降低，CON組的WSC顯著增加(P<0.05)、HC顯著減少(P<0.05)，CEL1組的NDF和ADF顯著增加(P<0.05)，CEL2組的ADF顯著增加(P<0.05)，CEL3組的NDF顯著增加(P<0.05)。

在MC1青貯中，與CON組相比，3個纖維素酶組的WSC顯著增加、NDF和ADF顯著減少(P<0.05)，CEL2組和CEL的HC顯著減少(P<0.05)。CEL2組D的DM與WSC顯著高于CEL1組和CEL3組(P<0.05)。

在MC2青貯中，與CON組相比，3個纖維素酶組的DM顯著增加、NDF顯著減少(P<0.05)，CEL2組的WSC顯著增加，ADF顯著減少(P<0.05)，CEL3組的ADF顯著減少(P<0.05)。CEL2組的DM與WSC顯著高于CEL1組和CEL3組(P<0.05)，CEL2組的ADF顯著低于CEL1組(P<0.05)。

表4 稻草青貯的化學(xué)成分Table 4 Chemical composition of raw straw silages

3 討論

兩因素方差分析的結(jié)果顯示，含水率對丁酸、氣體損失率和半纖維素之外的所有項目有極顯著或顯著的影響，纖維素酶對pH、干物質(zhì)、可溶性碳水化合物、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維和氨態(tài)氮有極顯著的影響，在pH、干物質(zhì)和中性洗滌纖維上，含水率與纖維素酶間有顯著的交互作用。研究表明，兼顧2個因素的相互影響，能調(diào)制品質(zhì)更好的青貯飼料，有利于指導(dǎo)生產(chǎn)。

3.1 含水率對青貯品質(zhì)的影響

常規(guī)青貯的成敗，主要取決于乳酸發(fā)酵的程度。青貯原料中的乳酸菌，在水分合適、糖分足夠以及缺氧環(huán)境等條件都滿足時，生長繁殖快、生成乳酸的數(shù)量多、pH下降快，可確保青貯品質(zhì)優(yōu)良。MC1稻草的含水率為70.00%，屬于常規(guī)青貯適宜含水率(65%～75%)的范疇[20]，MC1青貯的pH在4.22～4.38，而優(yōu)質(zhì)青貯的pH通常在4.2以下。原因之一是稻草的WSC含量不足。一般牧草青貯時足夠數(shù)量的WSC含量應(yīng)為干物質(zhì)中10%以上[21]，而MC1稻草干物質(zhì)中WSC含量僅為3.56%。另外，一般牧草上附著的乳酸菌數(shù)目不足，且只有少數(shù)是發(fā)酵能力強的優(yōu)良菌種[22]。

MC2稻草的含水率僅為37.5%，MC2青貯為低水分青貯[20]。低水分青貯時，植物細胞的滲透壓達到55×105～60×105Pa，在此情況下，腐敗菌、酪酸菌以至乳酸菌的生命活動接近于生理干燥狀態(tài)，生長繁殖受到限制[20]。因此，一方面不利于青貯pH的下降，另一方面能有效減少養(yǎng)分損失，提高干物質(zhì)回收率[23]。試驗結(jié)果顯示，在pH和DMR上，MC2青貯顯著高于MC1青貯。這與低水分青貯的原理一致，也與相關(guān)報道[6-7,23]的結(jié)果一致。

MC1和 MC2青貯中PA和BA的數(shù)量都比較少；除CEL2組外的3個處理組在NH3-N含量上，MC2青貯極顯著低于MC1青貯。表明植物細胞的呼吸和不良微生物的繁殖作用都得到了較好抑制；低水分稻草的不良發(fā)酵得到了更好抑制，這與莊益芬等[23]的研究結(jié)果一致。

3.2 纖維素酶對青貯品質(zhì)的影響

在青貯飼料中添加纖維素酶能使原料的部分結(jié)構(gòu)性多糖水解成單糖[12-13,24]，促進乳酸菌發(fā)酵，加快乳酸生成和pH下降，同時，酸度增大還能抑制腐敗菌、酪酸菌等有害菌的活動[20]，減少不良發(fā)酵作用對糖和蛋白質(zhì)的氧化分解，保存更多的營養(yǎng)物質(zhì)。在本試驗2種水分青貯中，3個纖維素酶水平雖然都未能顯著提高LA和AA含量，卻都顯著降低了青貯的pH和NDF含量。這與諸多[5,25-27]研究結(jié)果相近似。

在2種水分青貯中，均以CEL2組的DM、DMR、WSC最高，pH、GLR、NDF、ADF、NH3-N最低。這與艾尼瓦爾等[25]在貓尾草青貯中添加不同水平纖維素酶的試驗結(jié)果相近似。通常在一定的纖維素酶水平范圍內(nèi)，隨著添加水平的升高，纖維素酶的作用效果增強，當纖維素酶添加過多時，植物纖維可能完全被破壞而增加原料的粘性[28]，這不利于乳酸菌與發(fā)酵底物接觸，導(dǎo)致乳酸菌作用受限制。另外，在水分低青貯中，纖維素酶的活力也可能受到一定的限制，Pitt(1990)報道纖維素酶的最佳活力pH值為4.2，而到發(fā)酵開封，青貯料的pH值均未降至4.2[29]。這就造成一個不良循環(huán)，青貯料pH值無法降低，導(dǎo)致纖維素酶的活力無法充分發(fā)揮，乳酸菌不能獲得充足的底物，從而無法發(fā)酵產(chǎn)生足夠的乳酸降低青貯料的pH值。因此，在原料可溶性碳水化合物含量不充分的青貯，纖維酶最好與營養(yǎng)性添加劑聯(lián)合使用，給乳酸菌的發(fā)酵充足的啟動底物，才獲得一個良性循環(huán)的效果。

4 結(jié)論

綜上所述，根據(jù)pH、干物質(zhì)回收率和氨態(tài)氮等青貯化學(xué)成分和發(fā)酵品質(zhì)的指標，低水分稻草青貯的品質(zhì)優(yōu)于常規(guī)水分稻草青貯品質(zhì)；常規(guī)水分和低水分稻草青貯中，3個纖維素酶水平都有顯著改善了青貯品質(zhì)，其中以CEL2處理組，即40mg·kg-1的添加效果最佳。