基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與設(shè)計(jì)空間法的木蝴蝶提取工藝研究

譚瑤琳 鐘林江 楊俊莉 雷燕莉 李萬里 田佩靈 伍利華

摘要：目的 研究木蝴蝶治療咽炎的物質(zhì)基礎(chǔ)，優(yōu)化木蝴蝶的提取工藝。方法 利用網(wǎng)絡(luò)藥理篩選木蝴蝶治療咽炎的有效成分，通過分子對接技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證；采用設(shè)計(jì)空間法優(yōu)化木蝴蝶的提取工藝；并按木蝴蝶的最佳提取工藝制備木蝴蝶提取物，通過96孔板法驗(yàn)證木蝴蝶提取物的抗菌活性。結(jié)果 經(jīng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)獲得槲皮素、黃芩素等有效成分，分子對接結(jié)合能均＜-5.0 kJ/mol；經(jīng)設(shè)計(jì)空間法獲得木蝴蝶的最佳提取工藝：加乙醇量為30倍、浸泡時(shí)間為30 min、乙醇濃度為30%～70%、提取時(shí)間為30～90 min、提取次數(shù)為1～2次；經(jīng)96孔板法獲得木蝴蝶提取物對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的MIC值為0.3～0.7 mg/mL，MBC值為10～40 mg/mL。結(jié)論 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)表明木蝴蝶治療咽炎的有效成分為黃酮類成分，分子對接構(gòu)象穩(wěn)定；設(shè)計(jì)空間法表明木蝴蝶的最佳提取工藝符合生產(chǎn)實(shí)際；96孔板法表明木蝴蝶提取物對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌具有較強(qiáng)的抗菌活性，為進(jìn)一步開發(fā)利用木蝴蝶提供思路。

關(guān)鍵詞：木蝴蝶；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；設(shè)計(jì)空間；提取工藝；咽炎；抗菌

中圖分類號：R978.1 ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Research on extraction technology of oroxylum indicum based on network pharmacology and design space method

Tan Yaolin1， Zhong Linjiang2， Yang Junli2， Lei Yanli2， Li Wanli3， Tian Peiling2， and Wu Lihua

（1 Graduate School， Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning 530200; 2 School of Pharmacy， Chengdu University， Chengdu 610106; 3 Rekang Clinic School of Medicine， Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning 530200; 4 Journal Center， Chengdu University， Chengdu 610106）

Abstract Objective To study the material basis of oroxylum indicum in the treatment of pharyngitis， and optimizing the extraction process of the oroxylum indicum. Methods ?Screening of the effective components of the oroxylum indicum in the treatment of pharyngitis by network pharmacology， and verified by molecular docking technology; optimization of oroxylum indicum extraction process by design space method; preparation of oroxylum indicum extract according to the best extraction process， the antibacterial activity of the oroxylum indicum extract was verified by 96 well plate method. Results Active ingredients such as quercetin and baicalein were obtained through network pharmacology， and molecular docking binding energy ＜-5.0 kJ/mol. Design space method to obtain the best extraction process of oroxylum indicum： the amount of ethanol added is 30 times， the soaking time is

30 min， the ethanol concentration is 30% to 70%， the extraction time is 30 to 90 min， and the extraction times are 1 to 2 times; the 96-well plate method was used to determine the effect of oroxylum indicum extract on Staphylococcus aureus， Escherichia coli and Bacillus subtilis， the MIC value is 0.3～0.7 mg/mL， and the MBC value is 10～40 mg/mL. Conclusion Network pharmacology shows that the effective components of oroxylum indicum in the treatment of pharyngitis are flavonoids， and molecular docking conformational stabilization; design space method shows that the optimal extraction process of oroxylum indicum is in line with production practice; the 96-well plate method shows that oroxylum indicum extract have strong antibacterial activity against Staphylococcus aureus， Escherichia coli and Bacillus subtilis， provide ideas for further development and utilization of oroxylum indicum.

Key words Oroxylum indicum; Network pharmacology; Design space; Extraction process; Pharyngitis; Antibacterial

咽炎（pharyngitis）屬于上呼吸道感染，常見癥狀[1]是喉嚨痛，其次是發(fā)熱、頭痛、頸部淋巴結(jié)腫大、咳嗽等，由病毒或A型鏈球菌、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌等多種細(xì)菌[2]引起?？股刂委熂?xì)菌性疾病會(huì)促使細(xì)菌的靶點(diǎn)突變或形成生物膜，出現(xiàn)共耐藥性或交叉耐藥性[3]，還會(huì)對人體產(chǎn)生較強(qiáng)腎毒性[4]，腎功能異常時(shí)被迫停止用藥。而中藥成分復(fù)雜使得耐藥性低，不同成分通過影響生物膜形成、改變細(xì)胞膜通透性、下調(diào)耐藥靶點(diǎn)表達(dá)、抑制主動(dòng)外排系統(tǒng)、消除耐藥質(zhì)粒等相同或不同的抗菌機(jī)制共同對抗耐藥菌株。但中藥存在溶解度低、穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)，需優(yōu)化工藝以提高有效成分含量和生物利用度。

木蝴蝶為紫葳科植物木蝴蝶Oroxylum indicum（L.） Vent.的干燥成熟種子。始載于明代《滇南本草》，名為千張紙；清代《本草綱目拾遺》更名為木蝴蝶。味苦甘，性寒涼，歸肺、肝、胃經(jīng)，善清肺熱、利咽喉，具有清熱利咽、疏肝和胃功效，主治肺熱咽痛、喉痹、喑啞、肝胃氣痛，為咽喉腫痛的常用藥。主要成分是黃酮及其苷類，其中木蝴蝶苷B（oroxin B）[5]是黃芩素為母核的黃酮苷單體化合物，2020版《中國藥典》一部[6]指定作為木蝴蝶的評價(jià)指標(biāo)，單一成分難以體現(xiàn)藥物療效。本研究擬利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[7-8]篩選木蝴蝶治療咽炎的有效成分，經(jīng)分子對接技術(shù)[9]進(jìn)行驗(yàn)證；采用設(shè)計(jì)空間法[10-11]優(yōu)化木蝴蝶的提取工藝；并采用96孔板法[12]測定木蝴蝶提取物對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）、大腸埃希菌（Escherichia coli，EC）、枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis，BS）的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）。對木蝴蝶最佳提取工藝得到的木蝴蝶提取物進(jìn)行抗菌活性研究，確定此工藝條件下得到木蝴蝶提取液的有效性，為其制劑開發(fā)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

木蝴蝶飲片[四川省成都市荷花池藥材市場，批號為20210405，經(jīng)成都大學(xué)食品與生物工程學(xué)院劉濤教授鑒定本品為紫葳科植物木蝴蝶Oroxylum indicum（L.）Vent.的干燥成熟種子]；SA、EC、BS菌株（成都大學(xué)附屬醫(yī)院提供）；木蝴蝶苷B、槲皮素、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素（四川省維克奇生物科技有限公司，批號分別為wkq16032404、wkq19011509、wkq20061112、wkq19011507、wkq20030204，純度≥98%）；酵母浸出粉、氯化鈉、瓊脂粉、95%乙醇、磷酸、二甲基亞砜（成都市科隆化學(xué)品有限公司，批號分別為2020062801、2021081801、2020092701、2020090905、2018110501、2020061801）；蛋白胨（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號為20211222）；純凈水（華潤怡寶飲料有限公司，批號為20220417）；96孔一次性細(xì)胞培養(yǎng)板（浙江貝蘭伯生物技術(shù)有限公司）；TopPette單通道移液器（賽默飛世爾科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

FA2004型分析電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）、SQP型萬分之一電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）、ZDHW型調(diào)溫電熱套（北京中興偉業(yè)世紀(jì)儀器有限公司）、Waters 2695型HPLC儀（美國Waters公司）、PS-40型超聲波清洗器（深圳深華泰超聲洗凈設(shè)備有限公司）、XFS-280型手提式壓力蒸汽滅菌器（浙江新豐醫(yī)療器械有限公司）、HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州朗越儀器制造有限公司）、101-1-S型電熱鼓風(fēng)干燥箱（成都雅源科技有限公司）、JJ-CJ-2FD型潔凈工作臺（蘇州金凈凈化設(shè)備科技有限公司）、ZQTY-70E型振蕩培養(yǎng)箱（上海知楚儀器有限公司）、DH3006A型電熱恒溫培養(yǎng)箱（西安禾普生物科技有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法

2.1.1 木蝴蝶的化合物篩選

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫，按口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18檢索，得到木蝴蝶含有化合物18個(gè)和相應(yīng)靶標(biāo)蛋白476個(gè)，見表1。

2.1.2 木蝴蝶與咽炎的交集靶點(diǎn)

利用Uniprot數(shù)據(jù)庫，將木蝴蝶的476個(gè)靶標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)換成靶點(diǎn)219個(gè)。利用GeneCards數(shù)據(jù)庫，輸入咽炎（pharyngitis），按“Relevance score”順序選取前300個(gè)靶點(diǎn)作為咽炎靶點(diǎn)。將木蝴蝶靶點(diǎn)219個(gè)和咽炎靶點(diǎn)300個(gè)輸入Venny 2.1.0網(wǎng)站構(gòu)建韋恩圖，見圖1，得到木蝴蝶與咽炎的交集靶點(diǎn)33個(gè)。

2.1.3 KEGG信號通路富集分析

將33個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫，依次設(shè)置“OFFICIAL-GENE-SYMBOL”、“Gene list”、“Submit list”，物種為“Homo sapiens”，選擇“Gene Ontology”和“Pathways”，勾選“KEGG_PATHWAY”，得到KEGG信號通路表，擁有KEGG信號通路總條目73條，按P Value從小到大排序，選取P＜0.05前20條KEGG信號通路，構(gòu)建KEGG信號通路富集的高級氣泡圖，見圖2，可知木蝴蝶主要涉及KEGG信號通路11條：瘧疾、TNF信號通路、恰加斯病（美國錐蟲?。?、甲型流感、結(jié)核、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、弓形蟲病、細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的相互作用、乙型肝炎、癌癥途徑和單純皰疹感染。

2.1.4 木蝴蝶的化合物-靶點(diǎn)-KEGG信號通路網(wǎng)絡(luò)

將P＜0.05的KEGG信號通路前20條、前20條KEGG信號通路對應(yīng)的靶點(diǎn)22個(gè)、這22個(gè)靶點(diǎn)對應(yīng)的化合物7個(gè)，共同導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件，構(gòu)建木蝴蝶的完整化合物-靶點(diǎn)-KEGG信號通路網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。選擇此網(wǎng)絡(luò)圖的“Analyze Network”，下載csv格式文件，按“Degree”從大到小排序，分別選取化合物、靶點(diǎn)、KEGG信號通路大于中位數(shù)的值，共同導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件，構(gòu)建木蝴蝶的關(guān)鍵化合物-靶點(diǎn)-KEGG信號通路網(wǎng)絡(luò)圖，見圖4，得到木蝴蝶的關(guān)鍵化合物3個(gè)：黃芩素（baicalein）、槲皮素（quercetin）、蘆薈大黃素（aloe-emodin），關(guān)鍵靶點(diǎn)10個(gè)：TNF、IL6、IL1B、IFNG、CXCL8、IL10、STAT1、CCL2、AKT1、CASP8，關(guān)鍵KEGG信號通路7條：癌癥的途徑、細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的相互作用、結(jié)核、甲型流感、TNF信號通路、恰加斯?。绹F蟲?。┖童懠?。

2.1.5 分子對接技術(shù)驗(yàn)證

利用PubChem數(shù)據(jù)庫，輸入3個(gè)關(guān)鍵化合物，下載對應(yīng)2D結(jié)構(gòu)圖的SDF格式文件，導(dǎo)入Discovery Studio 2020 Client軟件去除水和配體，另存為pdb格式文件。利用PDB數(shù)據(jù)庫，輸入10個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，下載對應(yīng)蛋白的PDB format格式文件。采用Vina對接法，將3個(gè)關(guān)鍵化合物的pdb格式文件和10個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)對應(yīng)蛋白的pdb格式文件依次導(dǎo)入PyRx軟件進(jìn)行分子對接，結(jié)合能見表2。將分子對接生成的靶點(diǎn)和化合物的pdbqt格式文件，分別導(dǎo)入PyMOL軟件生成分子對接模型30個(gè)，其中蛋白1eku與3個(gè)關(guān)鍵化合物的分子對接模型見圖5。可知3個(gè)關(guān)鍵化合物與10個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對接結(jié)合能均＜-5.0 kJ/mol，結(jié)合構(gòu)象穩(wěn)定，表明木蝴蝶中黃芩素、槲皮素和蘆薈大黃素等成分具有治療咽炎療效。

2.2 含量測定方法建立

2.2.1 ?HPLC色譜條件

采用高效液相色譜法，色譜柱為Supersil ODS-B C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相[13]為乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脫（0～30 min，20%～30%乙腈；30～60 min，30%～60%乙腈；60～65 min，60%～20%乙腈）；體積流量為1 mL/min，檢測波長為276 nm，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。

2.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取對照品木蝴蝶苷B 0.74 mg、黃芩苷4.66 mg、槲皮素5.81 mg、黃芩素4.41 mg、漢黃芩素4.54 mg于同一5 mL容量瓶，加甲醇定容至刻度，超聲溶解（功率240 W，頻率40 KHz，下同），吸取適量經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備

稱取木蝴蝶50 g，加30%～70%乙醇溶液20～30倍，浸泡30～60 min，提取30～90 min，提取1～3次，合并提取液，抽濾，放冷至室溫，量取總提取液體積。吸取適量經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.2.4 專屬性試驗(yàn)

精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液和“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液各10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄保留時(shí)間，色譜圖見圖6，供試品色譜峰與對照品色譜峰相應(yīng)位置的保留時(shí)間一致，表明此方法專屬性較強(qiáng)。

2.2.5 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液2 mL于2 mL容量瓶中，采用二倍稀釋法，制得6個(gè)濃度遞減的混合對照品溶液，采用“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行濃度測定。以混合對照品的濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到相應(yīng)線性回歸方程和R2值，見表3，表明混合對照品在相應(yīng)濃度范圍與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液 10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰面積，計(jì)算得到混合對照品溶液中木蝴蝶苷B、黃芩苷、槲皮素、黃芩素和漢黃芩素的峰面積RSD值分別為1.20%、1.44%、1.88%、1.96%和1.54%，峰面積RSD值均＜2%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

按照“2.2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液6份，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行含量測定，計(jì)算得到供試品溶液中木蝴蝶苷B、黃芩苷、槲皮素、黃芩素和漢黃芩素的含量RSD值分別為0.80%、1.14%、1.24%、1.47%和2.14%，含量RSD值均＜3%，表明此方法重復(fù)性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行含量測定，在0、3、6、9、12、15、18、21和24 h分別進(jìn)樣，計(jì)算得到供試品溶液中木蝴蝶苷B、黃芩苷、槲皮素、黃芩素、漢黃芩素的含量RSD值分別為1.96%、1.78%、2.04%、2.48%和1.25%，含量RSD值均＜3%，表明室溫下放置供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 加樣回收率

精密吸取“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液1 mL和成分濃度約為1：1的混合對照品溶液1 mL于同一2 mL容量瓶中，超聲混勻，平行6份，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行含量測定，得到木蝴蝶苷B、黃芩苷、槲皮素、黃芩素和漢黃芩素的回收率RSD值分別為2.68%、0.69%、1.36%、2.85%和1.75%，回收率RSD值均＜3%，平均回收率分別為104.93%、97.32%、97.21%、106.82%和102.44%，平均回收率在97%～107%范圍，表明此方法加樣回收率良好。

2.2.10 樣品測定

按照“2.2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行含量測定。

2.2.11 干膏率測定

精密吸取木蝴蝶提取液50 mL于已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴加熱蒸干，于105℃烘箱干燥3 h，置干燥器內(nèi)冷卻30 min，精密稱定干膏重量，計(jì)算干膏率。干膏率（%）＝（m×V/50×M）×100% （其中m代表50 mL提取液的干膏重量，V代表總提取液的體積，M代表藥材的總提取重量）。

2.3 設(shè)計(jì)空間優(yōu)化提取工藝

2.3.1 CPP和CQA

考察5個(gè)關(guān)鍵工藝參數(shù)（critical process parameter，CPP）：提取時(shí)間（X1）、加乙醇量（X2）、提取次數(shù)（X3）、浸泡時(shí)間（X4）、乙醇濃度（X5）。6個(gè)關(guān)鍵質(zhì)量屬性（critical quality attribute，CQA）分別為指標(biāo)性成分含量：木蝴蝶苷B（Y1）、黃芩苷（Y2）、槲皮素（Y3）、黃芩素（Y4）、漢黃芩素（Y5）及相應(yīng)干膏率（Y6）。

2.3.2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

利用Minitab 19軟件，對5個(gè)CPP（X1～X5）：浸泡時(shí)間（30和90 min）、提取時(shí)間（30和90 min）、提取次數(shù)（1和3次）、加乙醇量（20和30倍）、乙醇濃度（30%和70%），選擇DOE中創(chuàng)建因子設(shè)計(jì)，進(jìn)一步選擇5因素2水平（-1，1）的Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到12組提取工藝方案，見表4，測定指標(biāo)性成分含量Y1～Y5（g/g）及相應(yīng)干膏率Y6（%），選擇DOE中分析因子設(shè)計(jì)，得到Y(jié)1～Y6方差分析，見表5～7，分析X1～X5的P＜0.05次數(shù)，見表8，可知提取時(shí)間（X1）、提取次數(shù)（X3）的P＜0.05頻率最高，乙醇濃度（X5）的P＜0.05頻率次之，故選取提取時(shí)間（X1）、提取次數(shù)（X3）和乙醇濃度（X5）作為3個(gè)關(guān)鍵CPP。

2.3.3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

利用Design-Expert 10軟件，對3個(gè)關(guān)鍵CPP進(jìn)行3因素3水平（-1， 0， 1）的Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到17組提取工藝方案（中心水平重復(fù)操作5次），見表9，測定指標(biāo)性成分含量Y1～Y5（g/g）及相應(yīng)干膏率Y6（%）。

2.3.4 設(shè)計(jì)空間及驗(yàn)證

利用MATLAB軟件，輸入Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中6個(gè)CQA（Y1～Y6）數(shù)據(jù)，采用蒙特卡羅法（Monte Carlo method）生成木蝴蝶提取工藝的設(shè)計(jì)空間圖，見圖7，在圖中最佳提取工藝范圍內(nèi)（黃色區(qū)域）、最佳提取工藝范圍外（藍(lán)色區(qū)域），分別隨機(jī)選取一個(gè)提取工藝進(jìn)行3組平行驗(yàn)證，見表10，可知黃色區(qū)域的綜合評分優(yōu)于藍(lán)色區(qū)域，表明此模型預(yù)測能力良好。2.4 木蝴蝶抗菌研究

2.4.1 木蝴蝶藥液制備

稱取木蝴蝶200 g于10000 mL圓底燒瓶中，加50%乙醇30倍，浸泡30 min，加熱回流提取30 min，提取2次，合并提取液，于80℃濃縮得到浸膏，浸膏于80℃、-0.085 Mpa減壓干燥，得到木蝴蝶提取物16.75 g。稱取適量木蝴蝶提取物于容量瓶中，加二甲基亞砜溶液定容至刻度，超聲溶解，制成1～6號不同濃度的木蝴蝶藥液，見表11。

2.4.2 細(xì)菌的培養(yǎng)

（1） 細(xì)菌培養(yǎng)基制備

LB液體培養(yǎng)基制備：稱取蛋白胨2.0 g，酵母浸出粉1.0 g，氯化鈉2.0 g，于500 mL錐形瓶中，加純凈水200 mL，搖勻即得。固體培養(yǎng)基制備：稱取蛋白胨5.0 g，酵母浸出粉2.5 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂粉12.0 g，于1000 mL錐形瓶中，加純凈水500 mL，搖勻即得。將LB液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基、150 mL錐形瓶3個(gè)、10 mL透明西林瓶6個(gè)、6 mm培養(yǎng)皿32個(gè)，置高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，于120 ℃滅菌30 min。

（2） 瓊脂平板和細(xì)菌培養(yǎng)液制備

將500 mL固體培養(yǎng)基倒入32個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)，在潔凈工作臺上放置30～60 min，待冷卻凝固后倒置培養(yǎng)皿，置電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，于37℃靜置24 h，即得瓊脂平板。量取LB液體培養(yǎng)基50 mL于150 mL錐形瓶3個(gè)，冷卻至室溫，分別接種SA、EC、BS菌株于振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)，37 ℃、120 r/min培養(yǎng)24 h，即得SA、EC、BS菌株的培養(yǎng)液。

2.4.3 木蝴蝶抗菌試驗(yàn)

（1）菌懸液制備

0.5號比濁管（0.5 McFarland）進(jìn)行細(xì)菌濁度比較，確定8 mL純凈水加入細(xì)菌培養(yǎng)液100 μL相當(dāng)于0.5號比濁管的濁度，細(xì)菌近似濃度為1.5×108個(gè)/mL。精密吸取純凈水8 mL于10 mL透明西林瓶6個(gè)，分別精密加入SA、EC、BS菌株10和100 μL，搖勻，即得低濃度和高濃度菌懸液，見表11。

（2） MIC試驗(yàn)

1～4號96孔板的2～12號孔加LB液體培養(yǎng)基100 μL。接著1～2號孔加木蝴蝶藥液100 μL，2號孔藥液混勻后吸取100 μL加到3號孔，依次倍比稀釋藥液至10號孔，從10號孔吸出多余藥液100 μL。最后1～11號孔加菌懸液。其中11號孔作為陽性對照孔，用于觀察LB液體培養(yǎng)基正常生長細(xì)菌的狀態(tài)。12號孔作為陰性對照孔，用于觀察LB液體培養(yǎng)基不被細(xì)菌污染的狀態(tài)。操作完成，置電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，于37℃靜置培養(yǎng)24 h取出觀察。

（3）MBC試驗(yàn)

5～6號96孔板的2～6號孔加LB液體培養(yǎng)基100 μL。接著1～2號孔加木蝴蝶藥液100 μL，2號孔藥液混勻后吸取100 μL加到3號孔，依次倍比稀釋藥液至5號孔，從5號孔吸出多余藥液100 μL。最后1～5號孔加菌懸液。其中6號孔作為空白對照孔，用于接種后觀察LB液體培養(yǎng)基是否被細(xì)菌污染。操作完成，置電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，于37 ℃靜置培養(yǎng)24 h取出。用1 mm接種環(huán)將相同2個(gè)藥液孔接種于同一瓊脂平板。每個(gè)藥液孔接種3～4次，1次涂布3～4行。每種細(xì)菌接種5個(gè)濃度的藥液于5個(gè)瓊脂平板。6號孔均接種于同一瓊脂平板，作為空白對照。操作完成，置電熱恒溫培養(yǎng)箱，于37 ℃靜置培養(yǎng)24 h取出觀察。

2.4.4 木蝴蝶抗菌結(jié)果

1～4號96孔板為MIC試驗(yàn)，5～6號96孔板為MBC試驗(yàn)，對應(yīng)加“表11”中1～6號木蝴蝶藥液，重復(fù)操作2行。A、B行為SA菌，D、E行為EC菌，G、H行為BS菌。1、2、5號96孔板加低濃度菌懸液，3、4、6號96孔板加高濃度菌懸液。肉眼觀察小孔內(nèi)藥液澄清程度，藥液澄清視為細(xì)菌生長受到抑制，對應(yīng)的最低藥液濃度為抑制此種細(xì)菌的最低抑菌濃度（MIC）。肉眼觀察瓊脂平板表面的菌落數(shù)，無菌落數(shù)視為細(xì)菌被完全殺滅，對應(yīng)的最低藥液濃度為殺滅此種細(xì)菌的最低殺菌濃度（MBC）。木蝴蝶提取物抵抗SA、EC、BS菌株的MIC效果見圖8及MIC值表12，MBC效果見圖9及MBC值表13，表明木蝴蝶提取物在0.3～0.7 mg/mL

濃度范圍，相當(dāng)于生藥量0.0036～0.0084 g/mL，能抑制SA、EC和BS菌株繁殖；木蝴蝶提取物在10～40 mg/mL

濃度范圍，相當(dāng)于生藥量0.1194～0.4776 g/mL，能殺滅SA、EC和BS菌株。

3 結(jié)論與討論

本研究將木蝴蝶苷B、槲皮素、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素共同作為指標(biāo)性成分考察木蝴蝶的制備工藝和細(xì)菌藥效，符合中藥成分復(fù)雜的特點(diǎn)。引起人體出現(xiàn)咽炎的金黃色葡萄球菌、A型鏈球菌、肺炎鏈球菌均為革蘭陽性菌。木蝴蝶細(xì)菌藥效實(shí)驗(yàn)使用的金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌均為革蘭陽性菌，其中金黃色葡萄球菌為致病菌，枯草芽胞桿菌為益生菌，而大腸埃希菌為革蘭陰性菌。通過研究SA、EC和BS菌株，充分體現(xiàn)木蝴蝶對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌均產(chǎn)生抗菌效果。木蝴蝶對SA、EC和BS菌株的抑菌濃度相同，推測木蝴蝶對SA、EC和BS菌株的抗菌機(jī)制相同。木蝴蝶抗菌活性是黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素等黃酮類成分共同作用的結(jié)果。本研究采用分子對接技術(shù)、設(shè)計(jì)空間法、96孔板法共同驗(yàn)證出網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選中藥有效成分的可靠性和可行性[14-15]。一定程度上避免目前工藝研究僅注重指標(biāo)性成分的轉(zhuǎn)移率，而忽略選擇指標(biāo)性成分的合理性、中藥提取液的有效性問題，為進(jìn)一步開發(fā)利用木蝴蝶提供思路。

本研究經(jīng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出木蝴蝶治療咽炎的3個(gè)關(guān)鍵化合物：槲皮素、蘆薈大黃素、黃芩素。按2020版《中國藥典》一部[6]木蝴蝶項(xiàng)下含量測定，可知木蝴蝶甲醇提取液中槲皮素含量高，蘆薈大黃素、黃芩素含量均低。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)根據(jù)OB≥30%、DL≥0.18常篩選出槲皮素[16]，專屬性不強(qiáng)，但木蝴蝶經(jīng)含量測定可知槲皮素含量高，可作為指標(biāo)性成分。木蝴蝶甲醇提取液中黃芩素含量也低，但木蝴蝶含有黃芩苷的水解酶，含水條件下，部分黃芩苷會(huì)水解成黃芩素，部分黃芩素會(huì)繼續(xù)轉(zhuǎn)化為漢黃芩素，故木蝴蝶乙醇提取液中黃芩素、漢黃芩素含量升高，可作為指標(biāo)性成分。黃芩苷用于指示木蝴蝶中總黃酮含量。因此本研究選取網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出的槲皮素、黃芩素，2020版《中國藥典》一部[6]木蝴蝶項(xiàng)下指定的木蝴蝶苷B、黃芩苷，黃芩素的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物漢黃芩素，5種成分共同作為指標(biāo)性成分。使用綜合評分法作為木蝴蝶制備工藝的判定指標(biāo)，由層次分析AHP法生成綜合評分中各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)。綜合評分=木蝴蝶苷B含量/最大木蝴蝶苷B含量×0.1485+黃芩苷含量/最大黃芩苷含量×0.1485+槲皮素含量/最大槲皮素含量×0.2698+黃芩素含量/最大黃芩素含量×0.2698+漢黃芩素含量/最大漢黃芩素含量×0.0817+干膏率/最大干膏率×0.0817。其中網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出槲皮素、黃芩素的權(quán)重系數(shù)最高，2020版藥典一部[6]木蝴蝶項(xiàng)下指定木蝴蝶苷B、黃芩苷的權(quán)重系數(shù)次之，黃芩素的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物漢黃芩素、指標(biāo)性成分對應(yīng)干膏率的權(quán)重系數(shù)最低。

按木蝴蝶的最佳提取工藝制備木蝴蝶提取物，采用96孔板法進(jìn)行抗菌試驗(yàn)。由于細(xì)菌不斷繁殖、肉眼觀察結(jié)果等因素，使96孔板法無法像纖維蛋白原平板法[17-18]進(jìn)行全面方法學(xué)考察，而采用96孔板內(nèi)重復(fù)操作2行的方法。已有研究表明木蝴蝶提取

物[19]毒性小，對SA菌[20]、雞大腸埃希菌有抑制作用，木蝴蝶乙醇提取物[21]比水提取物具有更高的抗菌活性。黃酮類成分具有多種抗菌機(jī)制，一是增大細(xì)菌的細(xì)胞膜通透性，使蛋白質(zhì)、核酸等大分子內(nèi)容物滲出，誘導(dǎo)細(xì)胞裂解[22]或異常聚集[23]；二是影響細(xì)菌形成生物膜[24]；三是下調(diào)細(xì)菌代謝途徑[25]。黃酮類成分[26]抗菌活性強(qiáng)弱與其基本骨架結(jié)構(gòu)，官能團(tuán)的數(shù)量、種類、位置等有關(guān)。此外，不同工藝制備得到黃酮類成分的含量和配比[27]有差異，間接影響抗菌活性強(qiáng)弱。

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