耐喹諾酮類藥物革蘭陰性菌的適應(yīng)性研究

王邦娟 陳楊 黃璐璐 劉理慧 劉振利 程古月

摘要：隨著廣譜高效喹諾酮類藥物的過度應(yīng)用，革蘭陰性菌對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥率逐年上升，已嚴(yán)重威脅到人類健康。革蘭陰性菌對(duì)喹諾酮類藥物的抗性是通過耐藥基因突變或者獲得外源抗性基因?qū)崿F(xiàn)的。耐藥性的維持通常會(huì)對(duì)細(xì)菌造成一定的適應(yīng)性代價(jià)，表現(xiàn)為細(xì)菌生長速率、毒性和傳播的減弱，但耐藥菌可通過補(bǔ)償突變緩解適應(yīng)性代價(jià)，甚至增強(qiáng)耐藥菌適應(yīng)性，嚴(yán)重阻遏臨床療效。而且耐藥菌株的適應(yīng)性增強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)菌即使在缺乏抗菌劑使用的條件下，其耐藥率也增加，導(dǎo)致無法通過減少抗菌劑的使用減弱菌株耐藥率。所以本文分別對(duì)革蘭陰性菌的染色體和PMQR基因介導(dǎo)的耐喹諾酮藥物的機(jī)制對(duì)其適應(yīng)性變化的影響進(jìn)行綜述，并對(duì)耐藥菌適應(yīng)性的研究方法進(jìn)行總結(jié)，以期為耐喹諾酮類藥物革蘭陰性菌的新型治療方案、相關(guān)的腸道致病菌抑制劑的開發(fā)和未來與之相關(guān)的研究提供一定參考。

關(guān)鍵詞：革蘭陰性菌；喹諾酮；耐藥性；適應(yīng)性；適應(yīng)性代價(jià)；補(bǔ)償突變；適應(yīng)性測(cè)量

中圖分類號(hào)：R978.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Study on the adaptability of quinolone-resistant Gram-negative bacteria

Wang Bangjuan1， Chen Yang1， Huang Lulu1， Liu Lihui1， Liu Zhenli1，2， and Cheng Guyue1，2

（1 MOA Laboratory for Risk Assessment of Quality and Safety of Livestock and Poultry Products Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070; 2 National Reference Laboratory of Veterinary Drug Residues （HZAU） and MOA Key Laboratory for the Detection of Veterinary Drug Residues in Foods， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070）

Abstract ? ?With the excessive use of broad-spectrum high-efficiency quinolones， the resistance rate of gram-negative bacteria to quinolones has been increasing year by year， which has seriously threatened human health. Resistance to quinolones in gram-negative bacteria is achieved through mutations in resistance genes or acquisition of exogenous resistance genes. The maintenance of drug resistance usually causes a certain adaptive cost to bacteria， manifested as weakening of bacterial growth rate， toxicity and transmission， but drug-resistant bacteria can alleviate the adaptive cost by compensating mutations， and even enhance the adaptability of drug-resistant bacteria， seriously dampening the clinical effect. Moreover， the adaptability of resistant strains is enhanced， resulting in an increase in the resistance rate of bacteria even in the absence of antimicrobial use， resulting in the inability to attenuate the resistance rate of strains by reducing the use of antimicrobials. Therefore， in this paper， the effects of chromosome of gram-negative bacteria and PMQR gene-mediated mechanism of quinolone-resistant drugs on their adaptive changes are reviewed， and the research methods of adaptability of drug-resistant bacteria are summarized in order to provide some reference for new treatment regimens of quinolone-resistant Gram-negative bacteria， the development of related enteropathogen inhibitors and future related research.

Key words ? ?Gram-negative bacteria; Quinolone; Drug resistance; Adaptability; Adaptive cost; Compensatory mutation; Adaptability measurement

喹諾酮類（氟喹諾酮類）藥物因其抗菌譜廣、活性強(qiáng)、安全性高、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于革蘭陽性菌、革蘭陰性菌和支原體感染的預(yù)防和治療[1-3]。

喹諾酮類藥物通過抑制gyrA和gyrB編碼的DNA回旋酶和/或parC、parE編碼的DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的活性，阻礙DNA合成來實(shí)現(xiàn)抑制細(xì)菌的生長[4]。

然而，隨著臨床使用喹諾酮類藥物次數(shù)和劑量的增加，革蘭陰性菌對(duì)其耐藥率逐年上升。其中耐氟喹諾酮類藥物的沙門菌已被WHO劃分為急需開發(fā)新型抗生素的重點(diǎn)耐藥菌之一[5-7]。細(xì)菌耐喹諾酮類藥物的現(xiàn)象是多因素的結(jié)果，主要有：①染色體突變：藥物作用靶位的改變、細(xì)胞膜通透性的改變和主動(dòng)外排系統(tǒng)的過度表達(dá)；②質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮類藥物耐藥（plasmid-mediated quinolone resistance，PMQR），其中qnr、aac（6'）-Ib-cr、qepA和oqxAB為主要的PMQR基因[8]。

細(xì)菌的適應(yīng)性與藥物的選擇壓力都會(huì)影響細(xì)菌耐藥性的流行與傳播[9]。細(xì)菌的適應(yīng)性（fitness）一般指細(xì)菌在無抗生素的選擇壓力下，通過調(diào)節(jié)自身代謝來適應(yīng)不同環(huán)境的能力[10]。而耐藥菌適應(yīng)性的變化已證明存在以下幾種情況：①耐藥菌產(chǎn)適應(yīng)性代價(jià)。即在無抗生素壓力下與敏感菌株相比，發(fā)生耐藥突變或者獲得外源基因的細(xì)菌自身適應(yīng)性降低，表現(xiàn)為耐藥菌的傳播速度、毒力和競爭能力減弱，最終不敵敏感菌而被消滅。適應(yīng)性代價(jià)也被認(rèn)為是限制細(xì)菌耐藥性傳播的主要障礙，在一定程度上決定耐藥菌能否在宿主體內(nèi)或體外環(huán)境中長久存在[11]。

②耐藥菌適應(yīng)性增強(qiáng)。一方面是因耐藥菌的補(bǔ)償性進(jìn)化，細(xì)菌為了改善自身適應(yīng)性代價(jià)所發(fā)生的適應(yīng)性突變，促進(jìn)其與敏感菌株競爭。具體表現(xiàn)是產(chǎn)適應(yīng)性代價(jià)的耐藥菌在長期進(jìn)化過程中，通過耐藥基因的突變累積來緩解其適應(yīng)性，促進(jìn)耐藥菌的進(jìn)化而嚴(yán)重阻遏臨床療效[10，12]。另一方面是在腸桿菌科細(xì)菌進(jìn)化的無數(shù)年歷史中，雖然大多數(shù)耐藥突變的出現(xiàn)均會(huì)對(duì)菌體產(chǎn)生或大或小的適應(yīng)性代價(jià)，但還是存有無適應(yīng)性代價(jià)和適應(yīng)性增加的耐藥突變現(xiàn)象[12]。

耐藥菌株的適應(yīng)性增強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)菌即使在缺乏抗菌劑使用的條件下，其耐藥率也增加，所以在特定條件下，通過減少抗菌劑的使用也無法達(dá)到減弱細(xì)菌耐藥率的目的。但有學(xué)者針對(duì)細(xì)菌的適應(yīng)性降低可減弱耐藥菌的傳播速度和毒力，提出利用此機(jī)制有望逆轉(zhuǎn)細(xì)菌的耐藥性[13]。所以對(duì)耐藥菌適應(yīng)性的研究不僅有助于更全面地理解細(xì)菌耐藥機(jī)制和流行性，還可促進(jìn)人們探索并建立有效的方法來預(yù)測(cè)和控制耐藥菌的流行[10]。革蘭陰性菌耐喹諾酮藥物日益嚴(yán)峻，本文主要從兩方面進(jìn)行綜述：分析革蘭陰性菌耐喹諾酮藥物的不同機(jī)制對(duì)其適應(yīng)性變化的影響和總結(jié)耐藥菌適應(yīng)性的研究方法，以期了解革蘭陰性菌在不同耐藥機(jī)制下的適應(yīng)情況，為指導(dǎo)臨床合理用藥和幫助設(shè)計(jì)新型耐藥抑制劑提出有針對(duì)性的解決思路與方法，從而達(dá)到有效控制我國耐藥菌的目的。

1 染色體介導(dǎo)的喹諾酮耐藥機(jī)制對(duì)細(xì)菌適應(yīng)性的影響

1.1 靶基因突變對(duì)耐藥菌適應(yīng)性的影響

染色體介導(dǎo)細(xì)菌耐喹諾酮類藥物，是因細(xì)菌喹諾酮類藥物耐藥決定區(qū)（plasmid-mediated quinolone resistance，QRDR）的主要和次要靶點(diǎn)（gyrA、gyrB、parC和parE）會(huì)發(fā)生至少一個(gè)氨基酸替換，引起喹諾酮類藥物對(duì)酶-DNA復(fù)合物親和力[14]降低而減弱藥效（圖1， B）。而適應(yīng)性作為影響耐藥菌進(jìn)化的因素[15]，已發(fā)現(xiàn)耐藥菌的染色體突變會(huì)影響其適應(yīng)性和耐藥性[16]，且不同突變位點(diǎn)會(huì)對(duì)菌株適應(yīng)性產(chǎn)生不同影響[17]。

具體來說可提高菌株適應(yīng)性的染色體突變有（表1）：耐FQ的淋病奈瑟菌株中g(shù)yrA91/95（S91F和D95N）突變[18]；大腸埃希菌中g(shù)yrA A119E突變[16]；腸炎沙門菌中g(shù)yrA（D87N、D87G、D87A、S83Y、S83F）和/

或parC（S80I）存在1～3個(gè)突變時(shí)[19]可顯著增加細(xì)菌適應(yīng)性。降低菌株適應(yīng)性的染色體突變有（表1）：肺炎克雷伯菌中g(shù)yrB S431P、parC S80I突變[15]、淋病奈瑟菌株parC86（D86N）突變[18]、大腸埃希菌中的gyrB F458V和/或A468P和/或gyrAΔS83突變[16]均可引起相應(yīng)耐藥菌株的適應(yīng)性降低，導(dǎo)致其在缺乏抗生素的情況下，競爭力弱于敏感的野生型菌株，無法在細(xì)菌種群中持續(xù)存在[15，20]。然而發(fā)生補(bǔ)償突變的耐藥菌株可通過恢復(fù)適應(yīng)性和毒力重獲競爭優(yōu)勢(shì)。如適應(yīng)性降低的耐FQ的淋病奈瑟菌株通過多藥外排泵MtrCDE的mtrR-79補(bǔ)償性突變[18]、耐FQ的大腸埃希菌通過額外突變gyrA（D87Y/D87N/A119E）均可促進(jìn)其適應(yīng)性增強(qiáng)[16]。此外，在傷寒沙門菌中發(fā)現(xiàn)，在無抗生素壓力條件下，gyrA和parC耐藥突變菌株比敏感菌株有適應(yīng)優(yōu)勢(shì)，而且由于基因的協(xié)同上位性，雙突變體菌株比所有單突變體菌株的適應(yīng)性高，說明抗性基因之間的協(xié)同上位性可能是增強(qiáng)菌株適應(yīng)性、促進(jìn)耐藥菌株進(jìn)化和流行的一個(gè)關(guān)鍵因素[21]。

1.2 外排泵對(duì)耐藥菌適應(yīng)性的影響

革蘭陰性菌的膜上有許多外排泵，這些泵作為一個(gè)三方系統(tǒng)存在，可通過高水平表達(dá)輸送不止一種類型的抗生素，成為腸桿菌科耐喹諾酮類藥物和多藥耐藥性（MDR）出現(xiàn)的重要機(jī)制之一[26-27]。目前，屬于RND超家族的AcrAB-TolC，是與喹諾酮耐藥有關(guān)且研究較為清楚的外排泵。AcrAB-TolC高水平的表達(dá)，不僅能將小分子物質(zhì)（代謝物、染料、洗滌劑、有機(jī)溶質(zhì)和膽鹽）從細(xì)菌細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)出來，還可在膽汁酸條件下，增強(qiáng)菌株的耐藥性和適應(yīng)性[22-23]。而且在喹諾酮藥物選擇壓力下，含QRDR突變和外排泵過表達(dá)的耐藥鼠傷寒沙門菌比僅有QRDR突變的耐藥腸炎突變菌更具有適應(yīng)性優(yōu)勢(shì)，說明細(xì)菌可通過結(jié)合外排泵和染色體的靶基因突變?cè)鰪?qiáng)耐藥菌適應(yīng)性[24]（表1）。此外，針對(duì)外排泵協(xié)同細(xì)菌生物膜促進(jìn)細(xì)菌耐藥和增強(qiáng)適應(yīng)性的現(xiàn)象，可通過外排泵抑制劑PAβN，阻斷相關(guān)QS信號(hào)分子跨膜通道的轉(zhuǎn)運(yùn)，抑制其對(duì)菌株耐藥的促進(jìn)作用[28-29]。

1.3 外膜滲透性對(duì)耐藥菌的適應(yīng)性影響

細(xì)菌外膜滲透率大小主要取決于細(xì)菌菌株種類、所用的抗菌劑和生物膜的生長條件[30]，其對(duì)菌株耐藥的促進(jìn)作用表現(xiàn)為孔道蛋白相關(guān)基因的缺失或突變，引起菌體外膜通透性下降，阻礙抗菌藥物的進(jìn)入而實(shí)現(xiàn)。如沙門菌通過下調(diào)OmpF的表達(dá)使膜孔蛋白缺失而對(duì)恩諾沙星產(chǎn)生低水平耐藥[31]。同時(shí)，外膜滲透性的改變會(huì)影響細(xì)菌適應(yīng)性[32]。如在Helix-turn-Helix（HTH）家族調(diào)節(jié)劑（包括AraC/XylS 家族）和雙組分系統(tǒng)（TCS）的調(diào)節(jié)下，通過外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)增加和/或孔蛋白表達(dá)減少，促使外膜滲透性降低，延遲抗生素的攝入而促使革蘭陰性菌耐藥性、適應(yīng)性和毒力增強(qiáng)，有效說明外膜滲透性在細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境壓力中起作用[25]（表1）。

2 質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥與細(xì)菌適應(yīng)性之間的關(guān)系

PMQR機(jī)制主要有：編碼DNA結(jié)合蛋白對(duì)靶點(diǎn)產(chǎn)生保護(hù)的qnr基因、引起氟喹諾酮失活的氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶變體aac（6'）-Ib-cr和排泄疏水性氟喹諾酮類藥物的QepA 和 OqxAB 等主動(dòng)外排泵（由 qep、oqxA 和 oqxB 基因編碼）[33]（圖1， C），而CRISPR基因編輯技術(shù)有助于解決臨床菌株的抗性基因?qū)?xì)菌耐藥性的促進(jìn)作用（圖1， D）。PMQR基因雖然只引起低水平的喹諾酮耐藥，但PMQR基因之間的相互累加效應(yīng)或與染色體突變位點(diǎn)的共同作用可促進(jìn)菌株達(dá)到臨床耐藥水平[34-35]，并在一定條件下降低或增強(qiáng)宿主菌的適應(yīng)性，影響包括喹諾酮類藥物在內(nèi)的許多抗菌藥物的有效性。此外，Oladeinde等[36]發(fā)現(xiàn)沙門菌暴露在酸性pH條件下可促進(jìn)耐藥質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移和菌株適應(yīng)性增強(qiáng)，為今后從環(huán)境入手改變細(xì)菌適應(yīng)性來控制喹諾酮耐藥性的發(fā)展提供新的角度。

2.1 PMQR基因?qū)δ退幘m應(yīng)性的影響

PMQR耐藥機(jī)制常見的組合是aac（6'）-Ib-cr-oqxAB和qnrB-aac（6'）-Ib-cr-oqxAB[35]，在PMQR 決定簇中acc（6'）-Ib-cr基因的流行率較高，其次是qnrB、oqxAB和qnrS[37]。目前qnr基因介導(dǎo)腸桿菌科適應(yīng)性研究主要集中在qnrA、qnrB和qnrS基因（表2）。蘭芳俊等[38]通過重組質(zhì)粒方式發(fā)現(xiàn)qnrA、qnrB和qnrS的存在會(huì)促使耐藥菌的生長速率和最大細(xì)胞密度增強(qiáng)，而這三種qnr基因增強(qiáng)耐藥菌適應(yīng)性的效果卻無明顯差別，這也在Kaplan等[39-40]的研究中得到證實(shí)（表2）。然而，攜帶qnr基因的質(zhì)粒大小不一，那質(zhì)粒的大小不同又是否會(huì)影響菌體適應(yīng)性呢？對(duì)于這個(gè)問題，Kaplan與San[40-41]已證明質(zhì)粒大小不會(huì)影響耐藥菌的適應(yīng)性（表2）。此外，在沒有喹諾酮類藥物的情況下，具有和不具有 aac（6'）-Ib-cr 基因的菌株之間的倍增時(shí)間和最大生長速率沒有顯著差異，但在環(huán)丙沙星暴露下，攜帶aac（6'）-Ib-cr基因的菌株具有明顯的適應(yīng)性優(yōu)勢(shì)[42]。外排泵qepA和oqxAB的過度表達(dá)，可在無藥物選擇壓力下，降低菌株適應(yīng)性[16]，

但從臨床大腸埃希菌分離株獲得的qepA1基因可與無活性I類整合子融合創(chuàng)造的新調(diào)節(jié)單元，不僅使qepA1的表達(dá)受環(huán)丙沙星的控制，還可減輕qepA1產(chǎn)生的適應(yīng)性代價(jià)[43]。

2.2 PMQR基因與染色體突變組合對(duì)耐藥菌適應(yīng)性的影響

PMQR基因也常結(jié)合染色體突變進(jìn)一步影響耐藥菌的適應(yīng)性。Machuca等[17]通過將qnr基因轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌，發(fā)現(xiàn)qnr基因與染色體自發(fā)突變構(gòu)成的一到四個(gè)抗性突變組合均可增強(qiáng)菌株適應(yīng)性（表2）。而將外排泵基因qepA2轉(zhuǎn)入到含不同染色體突變的大腸埃希菌中，發(fā)現(xiàn)qepA2基因與gyrA（Ser83Leu和/

或Asp87Asn）和/或parC（Ser80Arg）突變菌株結(jié)合會(huì)產(chǎn)適應(yīng)性代價(jià)，但通過marR基因的缺失可得到補(bǔ)償，并促使耐藥菌的適應(yīng)性和MPC均增加[13]（表2）。同樣，在含gyrB F458V和/或A468P和/或gyrAΔS83突變的OqxAB陽性菌株中發(fā)現(xiàn)，雖然適應(yīng)性減弱，但當(dāng)額外突變gyrA D87Y出現(xiàn)時(shí)適應(yīng)性和耐FQ均增強(qiáng)[16]（表2）。此外，無論體內(nèi)體外，當(dāng)aac（6'）-Ib-cr結(jié)合染色體上的4或5個(gè)突變位點(diǎn)時(shí)不僅促進(jìn)細(xì)菌耐環(huán)丙沙星，還可增強(qiáng)細(xì)菌適應(yīng)性[42]（表2），進(jìn)一步說明PMQR基因與染色體突變的一些特定組合會(huì)對(duì)耐藥菌適應(yīng)性產(chǎn)生重要影響。

2.3 PMQR基因與多重耐藥性（MDR）

PMQR決定簇常存于腸桿菌科細(xì)菌的多藥耐藥質(zhì)粒中，與其他耐藥基因關(guān)聯(lián)促進(jìn)菌株多重耐藥性（MDR）的產(chǎn)生。已發(fā)現(xiàn)acc（6'）-Ib-cr、QRDR突變和qnr基因在多重耐藥肺炎克雷伯菌中的共存頻率很高[44]，而且aac（6'）-Ib-cr與blaCTX-M-15、qnr與 SHV或blaCTX-M-9的密切聯(lián)系均會(huì)促進(jìn)菌株的MDR，而且aac（6'）-Ib-cr和blaCTX-M-27基因的共存會(huì)促進(jìn)菌株適應(yīng)性和生物被膜形成能力增強(qiáng)，對(duì)健康和經(jīng)濟(jì)造成相當(dāng)大的負(fù)擔(dān)[45-48]。此外，耐氟喹諾酮類藥物的多重耐藥菌的適應(yīng)性變化可能是ST特異性的[20]，但對(duì)于PMQR基因?qū)Χ嗨幠退幘唧w的適應(yīng)性影響的研究還是相對(duì)較少，相信這將是未來的一個(gè)重要研究方向，并對(duì)解決耐喹諾酮類藥物的現(xiàn)狀提供新的視角。

3 適應(yīng)性的研究方法

耐藥菌的相對(duì)適合性，是決定其在種群和其他環(huán)境中進(jìn)化成功的關(guān)鍵參數(shù)?，F(xiàn)如今隨著分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的發(fā)展，對(duì)細(xì)菌適應(yīng)性的測(cè)量主要是從兩方面進(jìn)行，一方面是從細(xì)菌的適應(yīng)性代價(jià)入手，另一方面是從細(xì)菌的補(bǔ)償性突變進(jìn)行。

3.1 適應(yīng)性代價(jià)的測(cè)量

細(xì)菌適應(yīng)性代價(jià)的衡量主要有兩種方法：①實(shí)驗(yàn)性方法；②構(gòu)建數(shù)學(xué)模型，具體是在流行病學(xué)大數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，將抗生素的使用量和耐藥菌株頻率的變化構(gòu)建一個(gè)函數(shù)關(guān)系來實(shí)現(xiàn)對(duì)適應(yīng)性代價(jià)的判斷[50]。對(duì)于前者又分為兩種：a：生長曲線，通過比較耐藥突變型菌株和缺乏該突變的野生型菌株之間的生長速度差異來評(píng)價(jià)適應(yīng)性（圖2a）；b：在體外（圖2b）或小鼠胃腸道定植模型中進(jìn)行的體內(nèi)（圖2c）競爭性實(shí)驗(yàn)。將耐藥突變菌株與野生型菌株共培養(yǎng)，通過監(jiān)測(cè)野生型菌株和耐藥突變菌株隨時(shí)間推移的菌數(shù)變化來衡量適應(yīng)性，菌株計(jì)數(shù)高的則代表適應(yīng)性強(qiáng)[50]。對(duì)于攜帶耐藥質(zhì)粒細(xì)菌的適應(yīng)性代價(jià)測(cè)量公式[51]為1-WB/P，WB/P=ln（Nf，B/P/Ni，B/P） / ln（Nf，B/Ni，B），其中WB/P表示質(zhì)粒攜帶菌的相對(duì)適應(yīng)性，Ni，B/P和Nf，B/P 表示競爭前后質(zhì)粒攜帶菌的密度，Ni，B和Nf，B表示競爭前后野生型菌的密度。然而，體外測(cè)量的結(jié)果可能無法完全反映臨床環(huán)境中的情況，基于此楊焰學(xué)者已提出可結(jié)合臨床研究和流行病學(xué)的綜合數(shù)據(jù)來評(píng)價(jià)細(xì)菌的適應(yīng)性代價(jià)，并且對(duì)于小的適應(yīng)性效應(yīng)，可通過數(shù)學(xué)模型和計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)相結(jié)合的競爭分析方法來測(cè)量。

3.2 適應(yīng)性補(bǔ)償突變的分析

耐藥菌可通過代償突變快速適應(yīng)和進(jìn)化，導(dǎo)致轉(zhuǎn)移速率、毒力、生存能力增強(qiáng)。目前已發(fā)現(xiàn)存在兩種補(bǔ)償突變：染色體突變和質(zhì)粒突變。染色體突變是通過細(xì)菌分裂垂直遺傳，但質(zhì)粒突變既可垂直也可水平遺傳，而且能降低質(zhì)粒到達(dá)新宿主細(xì)胞的初始成本。因此對(duì)細(xì)菌進(jìn)行適應(yīng)性補(bǔ)償突變分析時(shí)，不僅要先判斷適應(yīng)性補(bǔ)償突變是否發(fā)生，還要分析補(bǔ)償突變是來源質(zhì)粒/染色體或兩者。

DelaFuente[51]等已描述了一個(gè)進(jìn)化實(shí)驗(yàn)判斷是否存在適應(yīng)性代償突變。具體是將攜帶進(jìn)化質(zhì)粒的進(jìn)化菌株（Be/Pe）和攜帶原始質(zhì)粒的野生型菌株（B/P）在LB培養(yǎng)基中繁殖10 d后，第一步測(cè)量Be/Pe相對(duì)于B/P的相對(duì)適合度：若WBe/Pe/B＞W(wǎng)B/P/B，則說明由質(zhì)粒產(chǎn)生的成本可能被補(bǔ)償或菌株對(duì)實(shí)驗(yàn)條件產(chǎn)生了普遍適應(yīng)，后者與適應(yīng)性補(bǔ)償無關(guān)。因此第二步判斷是否存在適應(yīng)性代價(jià)補(bǔ)償：通過將Be/Pe中的質(zhì)粒去除，將Be/Pe菌株與無質(zhì)粒的對(duì)應(yīng)物Be進(jìn)行競爭實(shí)驗(yàn)后，計(jì)算Be/Pe菌株的適應(yīng)性代價(jià)：1-WBe/Pe/Be，如果最終Be/Pe的適應(yīng)性代價(jià)小于B/P菌株的，則說明菌株發(fā)生適應(yīng)性補(bǔ)償突變。一旦適應(yīng)性補(bǔ)償而且得到確認(rèn)，就可調(diào)查其來源。DelaFuente等[51]是構(gòu)建兩株菌株（將進(jìn)化質(zhì)粒（Pe）結(jié)合到野生型細(xì)菌（B）得到新菌株B/Pe和將原始質(zhì)粒（P）結(jié)合到進(jìn)化的無質(zhì)粒細(xì)菌（Be）得到新菌株Be/P）進(jìn)行競爭實(shí)驗(yàn)，通過判斷不同菌株的適應(yīng)性代價(jià)大小判斷補(bǔ)償?shù)钠鹪?。其中B/Pe的適應(yīng)性代價(jià)為：1-WB/Pe/B、Be/P的適應(yīng)性代價(jià)為：1-WBe/P/Be，若前者小于后者則說明適應(yīng)性代價(jià)的補(bǔ)償突變來源于質(zhì)粒，反之則來源于細(xì)菌染色體，但要注意也可能是二者同時(shí)產(chǎn)生[51]。此外，一旦對(duì)補(bǔ)償?shù)钠鹪催M(jìn)行了表型研究，下一步就可通過基因組測(cè)序和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析從分子層面進(jìn)一步確定補(bǔ)償突變和相關(guān)適應(yīng)性代價(jià)的來源。

4 總結(jié)與展望

綜上所述，目前國內(nèi)外不少學(xué)者對(duì)耐喹諾酮類藥物革蘭陰性菌的適應(yīng)性變化進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在革蘭陰性菌耐喹諾酮類藥物肆虐的今天，與耐藥菌適應(yīng)性相關(guān)的適應(yīng)性代價(jià)和補(bǔ)償性進(jìn)化的變化，主要取決于與染色體和/或可移動(dòng)元件攜帶的與喹諾酮類藥物相關(guān)的特定耐藥基因的變化。本綜述發(fā)現(xiàn)耐喹諾酮類藥物革蘭陰性菌的不同耐藥機(jī)制造成耐藥形式更加復(fù)雜的情況下，對(duì)耐藥菌適應(yīng)性變化的影響主要表現(xiàn)為：增強(qiáng)或減弱。同時(shí)，針對(duì)細(xì)菌適應(yīng)性的降低可減弱耐藥菌的傳播速度和毒力，已有學(xué)者說明利用此機(jī)制有望逆轉(zhuǎn)細(xì)菌的耐藥性[13]，所以本綜述的分析不僅有助于補(bǔ)充細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)和細(xì)菌適應(yīng)性有關(guān)的喹諾酮耐藥機(jī)制研究，還促進(jìn)我們依據(jù)適應(yīng)性降低有關(guān)的耐藥機(jī)制來設(shè)計(jì)新型喹諾酮類藥物。

此外，上述分析也為以后學(xué)者的研究提供以下借鑒：①耐喹諾酮類藥物革蘭陰性菌的適應(yīng)性代價(jià)和補(bǔ)償與耐藥菌或抗生素的種類有無直接關(guān)系，假如存在，其作用的機(jī)理如何？②細(xì)菌耐喹諾酮類藥物的機(jī)制和傳播受地理區(qū)域差異的影響[52]，那耐喹諾酮類藥物革蘭陰性菌的適應(yīng)性變化是否也受特定區(qū)域的影響？③耐喹諾酮類藥物基因的普遍存在與臨床日益嚴(yán)重的MDR存在一定聯(lián)系，但目前PMQR基因?qū)Χ嘀啬退幐锾m陰性菌適應(yīng)性影響的研究相對(duì)較少。我們堅(jiān)信隨著科學(xué)技術(shù)尤其是與分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)的不斷進(jìn)步，這些疑問在被解決的同時(shí)，一定會(huì)探索出更高效的策略去阻遏或控制與喹諾酮類藥物相關(guān)的耐藥菌的發(fā)展。

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