飲水?dāng)z入抗生素對小鼠腸道菌群的影響

馬晶 王德亞 田忠景 康美玲 李慶亮 朱峰 孫夏 丁誠實

摘要：目的 采用抗生素飲水飼喂小鼠，觀察抗生素對腸道菌群的影響。方法 高通量測序，分析腸道菌群的共有和特有OTUs、多樣性和復(fù)雜度；PCA、NMDS、PCoA和 UPGMA聚類樹作多樣本比較分析；聚類熱圖和柱狀圖分析小鼠腸道菌群相對豐度并預(yù)測腸道菌群功能的改變。結(jié)果 飲水?dāng)z入抗生素能夠顯著降低腸道菌群的物種豐富度、多樣性、復(fù)雜度，升高優(yōu)勢菌群的總體占比，變形菌門的腸道細(xì)菌對抗生素的拮抗能力更強(qiáng)，并可能影響其功能。結(jié)論 抗生素具備改變腸道菌群的作用，需做好食品特別是飲用水受其污染的防控工作。

關(guān)鍵詞：抗生素；腸道菌群；高通量測序

中圖分類號：R978.1 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Effects of antibiotics intaken by drinking water on intestinal microbiota in mice

Ma Jing， Wang Deya， Tian Zhongjing， Kang Meiling， Li Qingliang， Zhu Feng， Sun Xia， and Ding Chengshi

（College of Life Science， Zaozhuang University， Zaozhuang 277160）

Abstract ? ?Objective In this study， mice were fed with antibiotics by drinking water， and their effects on intestinal microbiota were observed. Methods The public and unique OTUs， the sample diversity， and the sample complexity were obtained by high-throughput sequencing. The multiple comparative analysis was observed by PCA plot， NMDS plot， PCoA plot， and UPGMA clustering tree. The clustering heatmap and barplot were used to analyze the species abundance of intestinal flora and predict changes in intestinal flora function. Results Intake of antibiotics in drinking water can significantly reduce the species richness， diversity， and complexity of intestinal flora， and increase the overall proportion of dominant flora. Proteobacteria intestinal bacteria have stronger antagonistic ability to antibiotics. It may affect its function. Conclusion Antibiotics can change the intestinal flora， and thus it is necessary to prevent and control the antibiotic contamination of food， especially drinking water.

Key words ? ?Antibiotics; Intestinal microbiota; High-throughput sequencing

抗生素是指由微生物或高等動植物在生活過程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其它活性的一類次級代謝物，能干擾其他細(xì)胞生長的化學(xué)物質(zhì)[1-2]。其在養(yǎng)殖業(yè)中的大量使用成為畜禽抗病增產(chǎn)的有效保證，為食品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供源源不斷的原材料[3-5]。抗生素隨糞便和污泥施肥進(jìn)入土壤，隨雨水地表徑流遷移至河流、湖泊和水庫等污染地表水，還可通過滲濾作用污染地下水[6-8]。最近研究發(fā)現(xiàn)上海兒童尿液中檢出21種抗生素，而這些抗生素主要來源于飲用水與食品[9]。

為了抵抗抗生素，細(xì)菌通過基因突變，獲得耐藥基因而成為耐藥菌。耐藥基因可以長期殘留在畜禽養(yǎng)殖附近的水、土壤和大氣等環(huán)境中并在食品加工儲藏過程中轉(zhuǎn)移傳播給其它微生物，被認(rèn)為是一種新型的食品和水體污染物。特別是在抗生素的脅迫下，食品中耐藥基因的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散變得越來越容易[10-12]。

有研究表明，食品是耐藥菌傳播給人類的媒介[13-14]。而從可能存在抗生素和耐藥菌的微環(huán)境方面看，動物腸道是抗生素脅迫細(xì)菌、耐藥基因轉(zhuǎn)移擴(kuò)增的理想場所。前期研究往往關(guān)注單一抗生素對腸道菌群的影響，很少研究多抗生素的聯(lián)合作用[15-16]。本文采用Illumina MiSeq PE250二代測序平臺對腸道微生物V4區(qū)進(jìn)行富集測序，觀察多抗生素聯(lián)合作用對腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，并預(yù)測抗生素對腸道菌群功能的改變。本研究為抗生素的污染防控提供了一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

昆明雄性小鼠（20±2）g購自北京華阜康生物科技股份有限公司，實驗動物許可證號SCXK（京）2020-0004。

主要試劑：TIANamp Stool DNA Kit糞便基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit購自寶生物工程（大連）有限公司；氨芐青霉素（Ampicillin，Amp，A610028）、卡納霉素（Kanamycin，Km，A506636）、四環(huán)素（Tetracycline，Tet，A500731）購自上海生工公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

VS-G-1A型超凈工作臺（無錫云潔凈化設(shè)備有限公司）；NanoDrop One型超微量紫外分光光度（美國Thermo公司）；ULT-7150-9V型深低溫冰箱（美國Thermo公司）； T100 型PCR儀（美國Bio-RAD公司）；Optima XE-100型超速離心機(jī)（美國Beckman公司）；Illumina MiSeq PE250二代測序平臺（北京諾禾致源公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及飼養(yǎng)

小鼠隨機(jī)分為4組，純凈水對照組、低劑量抗生素組、中劑量抗生素組、高劑量抗生素組。純凈水對照組：純凈水飲水飼養(yǎng)。低劑量抗生素組：抗生素Amp、Km、Tet各0.5 mg/L飲水飼養(yǎng)。中劑量抗生素組：抗生素Amp、Km、Tet各1 mg/L飲水飼養(yǎng)。高劑量抗生素組：抗生素Amp、Km、Tet各2 mg/L飲水飼養(yǎng)。連續(xù)飼養(yǎng)16 d，收集糞便。

1.3.2 腸道菌群物16S rRNA V4區(qū)高通量測序

使用糞便基因組提取試劑盒提取小鼠糞便中腸道菌群總DNA，對16S rRNA基因V4區(qū)擴(kuò)增。引物Af-F：5'-GCGGAAACGACTTAACTGAACC-3'；利用515F擴(kuò)增糞便DNA樣本V4區(qū)，通過Illumina MiSeq PE250二代測序平臺高通量測序。

1.4 ?數(shù)據(jù)分析

測序得到的原始數(shù)據(jù)作為序列標(biāo)簽Tags，排除干擾數(shù)據(jù)，對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過濾，得到有效數(shù)據(jù)（effective tags）。對所有樣品的Effective Tags進(jìn)行聚類，Uparse 軟件（Uparse v7.0.1001）以97%的一致性將序列聚類成為operational taxonomic units（OTUs），然后對OTUs的代表序列進(jìn)行物種注釋。然后基于Effective Tags進(jìn)行OTUs聚類和物種分類分析。維恩圖指示組間的共有和特有OTUs信息等；T-test、MetaStat、LEfSe統(tǒng)計學(xué)處理和微生物生態(tài)學(xué)定量分析（quantitative insights into microbial ecology，QIIME，Version 1.9.1），計算物種α多樣性指數(shù)如Observed-species、Chao1、Shannon和Simpson等指數(shù)，使用R軟件（Version 2.15.3）繪制稀疏曲線（rarefaction curve）、等級聚類曲線（rank abundance curve）和物種指數(shù)組間差異箱型圖（species difference boxplot），觀察樣品中物種的復(fù)雜性（均勻度）和物種相對豐度；使用R軟件繪制主成分分析（principal component analysis，PCA）、主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）和無度量多維標(biāo)定法（non-metric multi-dimensional scaling，NMDS）圖。PCA分析使用R軟件的ade4包和ggplot2軟件包，PCoA分析使用R軟件的WGCNA，stats和ggplot2軟件包，NMDS分析使用R軟件的vegan軟件包，UPGMA（unweighted pair-group method with arithmetic mean）方法構(gòu)建樣品聚類樹，然后進(jìn)行β多樣性指數(shù)組間差異分析；QIIME軟件分析，聚類熱圖和柱狀圖說明飲水抗生素攝入對小鼠腸道菌群物種相對豐度的影響；根據(jù)FAPROTAX數(shù)據(jù)庫，功能聚類熱圖預(yù)測腸道功能的改變[17-19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 腸道菌群OTUs的分布

OTUs指微生物的有效代表序列，由圖1可知飲水?dāng)z入抗生素能顯著降低小鼠腸道菌群的總體和特有OTUs，總體OTUs數(shù)目由699（對照組）降低到563（低劑量組）、390（中劑量組）和490（高劑量組），特有OTUs數(shù)目由314（對照組）降低到104（低劑量組）、46（中劑量組）和59（高劑量組）。而OTUs可代指物種豐富度，即飲水?dāng)z入抗生素能夠降低腸道菌群的豐富度。

2.2 小鼠腸道菌群樣品復(fù)雜度分析

Shannon指數(shù)是用來估算樣品中微生物多樣性的指數(shù)，指數(shù)值越大，說明群落多樣性越高。低（0.5 mg/L）、中（1 mg/L）、高（2 mg/L）劑量飲水?dāng)z入抗生素能夠極顯著降低小鼠腸道菌群的Shannon指數(shù)，即降低腸道菌群的多樣性，但不具備量效關(guān)系。Simpson指數(shù)描述從一個群落種群連續(xù)兩次抽樣所得到的個體數(shù)屬于同一種的概率，代指樣品的均勻性，數(shù)值越大越均勻。對照組的腸道菌群物種豐度相對較均勻、較豐富，低（0.5 mg/L）、中（1 mg/L）、高（2 mg/L）劑量飲水?dāng)z入抗生素均能夠顯著降低Simpson指數(shù)、改變這種均勻性，減少敏感菌群的存在，增大優(yōu)勢菌群的占比。Chao1指數(shù)指用Chao1算法估計群落中含OTUs 數(shù)目的指數(shù)，常用來估計物種總數(shù)。低（0.5 mg/L）和高（2 mg/L）劑量飲水?dāng)z入抗生素能夠顯著降低Chao1指數(shù)（P<0.05），減少腸道菌群物種總數(shù)；中（1 mg/L）劑量飲水?dāng)z入抗生素能夠極顯著降低Chao1指數(shù)（P< 0.01），減少腸道菌群物種總數(shù)（見表1）。

為了深入分析抗生素對小鼠腸道微生物整體結(jié)構(gòu)的影響，進(jìn)一步從各樣本腸道菌群的豐富度和均勻度的層面研究小鼠腸道微生物的多樣性。圖2A樣品稀釋曲線結(jié)果表明隨著樣品測序深度的增加，觀測物種指數(shù)曲線趨于平緩，各組樣本的OTUs數(shù)目隨著測序深度的增加基本達(dá)到飽和，說明當(dāng)前測序深度足以發(fā)現(xiàn)各樣本生境中的大部分物種；而各組樣本的稀釋曲線明顯分開，說明各組小鼠腸道物種多樣性具有較大的差異。從圖2B反映物種豐富度及均勻度的物種等級聚類曲線可以看出，隨著OTU等級的增加，曲線愈加平坦并且在橫軸的跨度也越來越大，說明樣品中物種的均勻度和相對豐度都達(dá)到了很高的水平，且抗生素組與對照組的物種差異顯著（P<0.05）。圖2C反映樣品中物種分布均勻，豐度較高，所測結(jié)果可用于后續(xù)分析。

2.3 小鼠腸道菌群多樣本比較分析

PCA是一種應(yīng)用方差分解，對多維數(shù)據(jù)進(jìn)行降維，從而提取出數(shù)據(jù)中最主要的元素和結(jié)構(gòu)的方法[20]。群落組成越相似，樣品在圖中的距離越接近。圖3A表明組內(nèi)樣品彼此之間距離較近，菌群結(jié)構(gòu)差異較小，樣品重復(fù)性較好；對照組與抗生素攝入組組間距離較遠(yuǎn)，說明抗生素對腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響較大；低（0.5 mg/L）、中（1 mg/L）、高（2 mg/L）劑量飲水?dāng)z入抗生素組間差異較小且未能明顯分開，說明抗生素對菌群結(jié)構(gòu)影響的量效關(guān)系較差。NMDS分析根據(jù)樣本中包含的物種信息，以點的形式反映在多維空間上，而對不同樣本間的差異程度，則是通過點與點間的距離體現(xiàn)，能夠反映樣本的組間和組內(nèi)差異等[18]。圖3B結(jié)果與圖3A類似，組內(nèi)樣品距離較近，菌群結(jié)構(gòu)差異較小，樣品重復(fù)性好；對照組與抗生素攝入組組間距離遠(yuǎn)，說明抗生素對腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響較大；中劑量（1 mg/L）飲水?dāng)z入抗生素對樣品菌群結(jié)構(gòu)的影響最大，低劑量（0.5 mg/L）和高劑量（2 mg/L）飲水?dāng)z入抗生素對腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響相似。PCoA分析是通過一系列的特征值和特征向量排序從多維數(shù)據(jù)中提取出最主要的元素和結(jié)構(gòu)，樣品距離越接近，表示物種組成結(jié)構(gòu)越相似、群落結(jié)構(gòu)相似度越高[18]。圖3C也表明組內(nèi)差異較小，組間差異較大，抗生素飲水?dāng)z入能夠影響小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)。在圖3D UPGMA聚類樹圖中，低（0.5 mg/L）、中（1 mg/L）、高（2 mg/L）劑量飲水?dāng)z入抗生素均能夠降低小鼠腸道菌群的均勻性和豐度，非優(yōu)勢菌群如無壁菌門（Tenericutes）、放線菌門（Actinobacteria）、梭菌門（Fusobacteria）、脫鐵桿菌門（Deferribacteres）、浮霉菌門（Planctomycetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）和藍(lán)藻細(xì)菌（Cyanobacteria）總體占比減小。優(yōu)勢菌群如擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）總體占比增大，其中變形菌門增加明顯，由3.1%分別增加到27.1%（低劑量抗生素）、15.7%（中劑量抗生素）和12.9%（高劑量抗生素），增加的程度與抗生素的劑量呈負(fù)相關(guān)。厚壁菌門占比減小，由28.6%分別降低到25.7%（低劑量抗生素）、14.3%（中劑量抗生素）和8.6%（高劑量抗生素），降低的程度與抗生素的劑量呈正相關(guān)。

2.4 腸道菌群物種相對豐度的改變

如圖4A聚類熱圖顯示，抗生素能夠顯著降低小鼠腸道菌群中的紅細(xì)菌綱（Rubrobacteria）、柔膜菌綱（Mollicutes）、酸微菌綱（Acidimicrobiia）、放線菌綱（Unidentified-Actinobacteria）、Δ-變形菌綱（Deltaproteobacteria）、噬纖維菌綱（Cytophagia）、鞘脂桿菌綱（Sphingobacteriia）、β-變形菌綱（beta Proteobacteria）、紅蝽菌綱（Coriobacteriia）、全噬菌綱（Holophagae）、念珠菌綱（Candidatus-Azambacteria）、芽單胞菌綱（Unidentified-Gemmatimonadetes）、疣微菌綱（Verrucomicrobiae）、浮霉菌綱（Planctomycetacia）、α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、梭桿菌綱（Fusobacteriia）、厭氧繩菌綱（Anaerolineae）、黃桿菌綱（Flavobacteriia）、桿菌綱（Bacilli）、綠菌綱（Chloroplast）、擬桿菌綱（Bacteroidia）、螺旋體菌綱（Unidentified-Saccharibacteria）和丹毒絲菌綱（Erysipelotrichia）?？股貪舛仍酱螅瑢δc道菌群相對豐度的影響就越大。如圖4B柱狀圖所示，飲水?dāng)z入抗生素能增加腸道菌群里面的γ-變形菌綱（gamma Proteobacteria）和梭菌綱（Clostridia）；同時抗生素可降低腸道菌群的物種豐富度，減少桿菌綱（Bacilli）、柔膜菌綱（Mollicutes）、丹毒絲菌綱（Erysipelotrichia）、紅蝽菌綱（Coriobacteriia）、α-變形菌綱（alpha Proteobacteria）、β-變形菌綱（beta Proteobacteria）和ε-變形菌綱（epsilon Proteobacteria），柱狀圖的結(jié)果和聚類熱圖的結(jié)果基本一致?？股貪舛仍酱?，桿菌綱（Bacilli）減少得越多，而Γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）增加得越少。

2.5 小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)改變的功能預(yù)測

如圖5功能聚類熱圖所示，與純凈水對照組相比，抗生素能夠增加動物寄生蟲或共生體疾病（animal parasites or symbionts）、人體腸道疾?。╤uman gut）、哺乳動物腸道疾?。╩amal gut）、人類病原體疾?。╤uman pathogens）、人源性胃腸炎（human pathogens gastroenteritis）、人源性腹瀉（human pathogens diarrhea）、硝酸還原（nitrate reduction）、有氧化學(xué)異養(yǎng)（aerobic chemoheterothophy）、延胡索酸呼吸（fumarate respiration）、氮呼吸（nitrogen respiration）、硝酸銨化（nitrite ammonification）、硝酸鹽呼吸（nitrate respiration）、亞硝酸鹽呼吸（nitrite respiration）。抗生素能夠降低人源性肺炎（human pathogens pneumonia）、塑料降解（plastic gegradation）、芳香族化合物降解（aromatic compound degradation）、化能異養(yǎng)（chemoheterothophy）、發(fā)酵（fermentation）、尿素分解（ureolysis）、硫化物呼吸（respiration of sulfur compounds）、硫酸呼吸（sulfate respiration）、反硝化（denitrification）、硝酸鹽反硝化（nitrate denitrification）、亞硝酸鹽反硝化（nitrite denitrification）、氧化亞氮脫氮（nitrous oxide denitrification）。低、中、高劑量抗生素（0.5、1和

2 mg/L）均能夠改變腸道功能，但不具備量效關(guān)系。

3 討論

腸道是食物消化吸收的主要場所，是一個巨大的細(xì)菌庫，腸道菌群的紊亂會引起腸道疾病甚至系統(tǒng)性疾病[21-22]。腸道菌群在某些因素作用下，可以變成易感細(xì)菌，通過基因突變或水平轉(zhuǎn)移獲得耐藥基因而成為耐藥菌。然而，環(huán)境因素復(fù)雜，如飲水飲食、抗生素[23]、耐藥菌[24]、納米材料[25-26]等都可能影響耐藥菌的形成和傳播。抗生素作為食品特別是飲水的新型污染物，一旦攝入動物體內(nèi)，一方面會引起耐藥基因的產(chǎn)生和傳播，另一方面必然會改變腸道菌群的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而可能造成菌群失調(diào)、疾病發(fā)生。抗生素在水體中濃度可達(dá)0.917 μg/L～0.664 mg/L[27]，本研究使用的是自由飲水，而不是抗生素灌胃，故抗生素濃度稍高，選為0.5、1和2mg/L。Amp為β-內(nèi)酰胺抗生素，是人類最早和最常用抗生素；Tet類抗生素為畜禽養(yǎng)殖最常用的抗生素；Km為氨基糖苷類抗生素，也是人類使用較多的抗生素。這3種抗生素在環(huán)境中普遍存在，水體中基本都能檢測到這3種所代表的3類抗生素的殘留[27]。選擇該3種抗生素聯(lián)合用藥，考察其對腸道菌群的影響，具有多抗生素聯(lián)合影響的代表性。

前期的研究主要集中在單抗生素或雙抗生素對腸道菌群的影響，本研究主要關(guān)注多抗生素聯(lián)合作用對腸道菌群的影響。結(jié)果表明，飲水?dāng)z入多種抗生素能夠顯著降低小鼠腸道菌群的OTUs分布，即降低腸道菌群的物種豐富度。Shannon、Simpson和Chao1多樣性指數(shù)說明樣品中正常小鼠腸道菌群的多樣性較高，飲水?dāng)z入抗生素能夠降低菌群的多樣性。稀釋曲線、等級聚類曲線和物種指數(shù)組間差異箱型圖均說明樣品均勻度較好，復(fù)雜度較高，飲水?dāng)z入抗生素能夠降低腸道菌群樣品的復(fù)雜度。多樣本比較分析中，組內(nèi)樣品距離較近，菌群結(jié)構(gòu)較一致；組間樣品距離較遠(yuǎn)，菌群結(jié)構(gòu)差異較大，飲水?dāng)z入抗生素能夠明顯改變樣品的腸道菌群組成。在門水平上，飲水?dāng)z入抗生素能夠顯著降低腸道菌群的豐富度和非優(yōu)勢菌群的占比，使其在腸道菌群中所占比例不足1%；飲水?dāng)z入抗生素能夠升高優(yōu)勢菌群的總體占比，使其占比大于99%。對于優(yōu)勢菌群，抗生素都能夠降低厚壁菌門的占比，增大變形菌門的占比，推測變形菌門的腸道菌群抵抗抗生素的能力更強(qiáng)，這與前期的研究成果變形菌門更易獲得耐藥基因一致[16，28]，但其機(jī)制還有待于深入研究。根據(jù)表1中的多樣性指數(shù)，在綱水平上抗生素能夠極顯著降低腸道菌群的豐富度，且抗生素在1 mg/L濃度以內(nèi)具有量效關(guān)系，高劑量1～2 mg/L范圍內(nèi)不具備量效關(guān)系。細(xì)菌對抗生素的抵抗有兩種方式，一種是耐藥基因的獲得，一種是細(xì)菌表型結(jié)構(gòu)的抵抗，推測在不同抗生素濃度下，細(xì)菌耐藥的方式不同，故在一定藥物濃度范圍內(nèi)不具備量效關(guān)系。單一抗生素對腸道菌群的影響可能結(jié)果更明確，但自然環(huán)境中往往是多抗生素共存，故研究多抗生素聯(lián)合對腸道菌群的影響更具有現(xiàn)實意義。從菌群結(jié)構(gòu)上前人研究發(fā)現(xiàn)，在門水平級別上單一β-內(nèi)酰胺類的抗生素均以抗生素作用下Firmicutes增加、Bacteroidetes與Proteobacteria減少為特征[15]。而本文研究結(jié)果表明多種抗生素聯(lián)合作用下，F(xiàn)irmicutes、Bacteroidetes與Proteobacteria均占比增加，推測這與多抗生素聯(lián)合作用下，Bacteroidetes與Proteobacteria更易獲得耐藥基因產(chǎn)生抗性有關(guān)[25-26，28]。頭孢噻肟鈉、頭孢曲松鈉、鹽酸左氧氟沙星、萬古霉素、美羅培南、阿奇霉素、硫酸慶大霉素和本研究使用的氨芐青霉素、卡那霉素、四環(huán)素對腸道菌群在綱水平上的影響相似，在種屬水平上的影響差異還有待深入研究[15-16]。

正常微生物菌群彼此之間保持著一種動態(tài)平衡，菌群的結(jié)構(gòu)失衡與動物機(jī)體的疾病發(fā)生密切相關(guān)，例如它們在腹瀉、腫瘤、免疫、營養(yǎng)、消化吸收等方面發(fā)揮重要作用[29-30]。本研究表明：多抗生素聯(lián)合作用可能引起動物寄生蟲或共生體疾病、哺乳動物及人腸道疾病、人類病原體疾病、人源性腹瀉、人源性胃腸炎、能量代謝疾病、消化吸收疾病，其與單抗生素或雙抗生素作用相似，以上結(jié)果是基于數(shù)據(jù)庫的疾病預(yù)測，還有待于確切的動物模型和臨床實驗驗證?？股嘏c腸道菌群關(guān)系的深入研究，將為食品特別是飲用水抗生素污染防控提供一定的理論基礎(chǔ)。

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