基于細(xì)胞膜損傷機(jī)制的抗菌肽結(jié)構(gòu)優(yōu)化研究進(jìn)展

張良 潘瀅浩 袁瑜 黃波 孟廣鵬 李元波 周琳

摘要：抗菌肽相比傳統(tǒng)抗生素，具有廣譜殺菌、對(duì)多重耐藥菌有效、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)。近年來，抗菌肽獨(dú)特的細(xì)胞膜靶向作用機(jī)制得到了深入研究，基于此機(jī)制上的結(jié)構(gòu)優(yōu)化策略也成為了近期研究熱點(diǎn)。本文主要針對(duì)抗菌肽的細(xì)胞膜損傷機(jī)制展開，就近期通過氨基酸替換、線性肽成環(huán)、化學(xué)修飾、多聚化、抗生素偶聯(lián)以及復(fù)合材料制備等手段對(duì)抗菌肽結(jié)構(gòu)予以優(yōu)化的研究進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié)，期望對(duì)抗菌肽設(shè)計(jì)與改構(gòu)研究提供思路。

關(guān)鍵詞：抗菌肽；臨床前研究；結(jié)構(gòu)優(yōu)化

中圖分類號(hào)：R978文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Research progress on structure modification of antimicrobial peptides targeting membrane disruption

Zhang Liang1， Pan Yinghao2， Yuan Yu2，3， Huang Bo2， Meng Guangpeng2， Li Yuanbo2， and Zhou Lin1

（1 Chengdu Institute For Drug Control， Chengdu 610045; 2 Chengdu Sintanovo Biotechnology Co.， Ltd.， Sichuan Province， Chengdu 610000; 3 College of Pharmacy， Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 610000）

Abstract Comparing to traditional antibiotics， antimicrobial peptides （AMPs） have the advantages of broad spectrum antibacterial activity， active against multidrug resistant bacteria and good biocompatibility. The unique cell membrane targeting mechanism of AMPs has been studied in depth， and the structure optimization strategies based on this basis have become hotspots in recent years. In this paper， we focus on the research progress of optimization strategies based on the membrane damage mechanism of AMPs， including amino acid replacement， peptide cyclization， chemical modification， polymerization， antibiotic conjugation， combined materials， et al. We expect this review to provide ideas on design and modification in the development of AMPs.

Key words Antimicrobial peptides; Pre-clinical research; Structure optimization

抗菌肽（antimicrobial peptides， AMPs），有時(shí)也被稱為宿主防御肽（host defense peptides， HDPs），是一種小分子多肽，通常由不到50個(gè)氨基酸殘基組成。抗菌肽具有廣譜的抗微生物活性，除了抗菌活性外，對(duì)真菌、寄生蟲與病毒也有活性[1-3]，此外，抗菌肽也被發(fā)現(xiàn)具有其他多種生理功能，如免疫調(diào)節(jié)、促血管形成、促傷口愈合和抗腫瘤活性等[4-7]。天然抗菌肽來源廣泛，除了人體外，在動(dòng)物、植物、細(xì)菌、真菌乃至古生菌與原生動(dòng)物中均發(fā)現(xiàn)了天然的抗菌肽[8]。目前已經(jīng)報(bào)道了超過4000種抗菌肽[9]，其中大多數(shù)為帶有正電荷、具有一定疏水性基團(tuán)的兩親性多肽，主要通過影響細(xì)菌細(xì)胞膜發(fā)揮抗菌作用。抗菌肽的構(gòu)象多樣，可以是α-螺旋、β-折疊，線性延展或無規(guī)則卷曲，也可以是環(huán)肽或上述多種構(gòu)象的混合，但大部分抗菌肽的構(gòu)象為α-螺旋或β-折疊。由于當(dāng)今微生物對(duì)傳統(tǒng)抗生素的耐藥性越來越強(qiáng)，臨床對(duì)新型抗菌藥物需求急切，而抗菌肽因?yàn)榫哂信c傳統(tǒng)抗生素所不同的抗菌機(jī)制，成為了一種擁有巨大潛力的新型抗菌分子類別，在近年來受到了廣泛關(guān)注，并且在細(xì)菌感染、傷口愈合與炎癥治療等方面都具有臨床應(yīng)用前景[10-11]。本文從傳統(tǒng)抗生素與抗菌肽的抗菌機(jī)制出發(fā)，分析了抗菌肽基于細(xì)胞膜損傷機(jī)制的抗菌構(gòu)效關(guān)系，并對(duì)近年來基于細(xì)胞膜損傷機(jī)制的一些抗菌肽結(jié)構(gòu)優(yōu)化策略研究進(jìn)展進(jìn)行了介紹。

1 傳統(tǒng)抗生素與抗菌肽的抗菌機(jī)制

傳統(tǒng)抗生素通常是通過5種途徑實(shí)現(xiàn)對(duì)病原細(xì)菌的攻擊[12]：①抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成（β-內(nèi)酰胺類抗生素等）；②抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成（紅霉素等）；③直接或間接抑制核酸（DNA/RNA）的合成或復(fù)制（利福霉素、磺胺類抗生素等）；④靶向細(xì)胞膜（多黏菌素等）；⑤前4種機(jī)制與抗生素誘導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)協(xié)同作用，如DNA修復(fù)的SOS應(yīng)答氧化應(yīng)激等（β-內(nèi)酰胺類抗生素等）。而針對(duì)上述作用機(jī)制，具有抗藥性的細(xì)菌進(jìn)化出了對(duì)應(yīng)的抗生素抵抗機(jī)制[13-15]：①產(chǎn)生使抗菌藥物失活的酶（針對(duì)β-內(nèi)酰胺抗生素等）；②通過外排泵將抗生素泵出菌體外（針對(duì)紅霉素等）；③改變原本對(duì)抗生素的作用靶位（針對(duì)β-內(nèi)酰胺抗生素等）以及降低細(xì)菌細(xì)胞膜通透性、改變代謝通路等機(jī)制。面對(duì)具有多種耐藥機(jī)制的超級(jí)細(xì)菌，傳統(tǒng)抗生素的抗菌效果大大降低。

抗菌肽的抗菌機(jī)制主要通過細(xì)胞膜與細(xì)胞內(nèi)兩種途徑實(shí)現(xiàn)[15-16]?？咕牡募?xì)胞內(nèi)途徑與傳統(tǒng)的抗生素作用機(jī)制相似，主要通過與細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的各種大分子相互作用而影響細(xì)胞功能來實(shí)現(xiàn)，如影響核酸復(fù)制、蛋白質(zhì)合成、影響酶活性和細(xì)胞壁生成等[15-16]。

細(xì)胞膜途徑是抗菌肽的主要抗菌途徑，也是其與傳統(tǒng)抗生素不同的特有途徑。帶有正電荷的抗菌肽與細(xì)菌帶有負(fù)電荷的細(xì)胞膜通過靜電吸附相結(jié)合，聚集在細(xì)菌細(xì)胞膜表面；抗菌肽兩親性結(jié)構(gòu)中的疏水部分與細(xì)胞膜磷脂相互作用，破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，從而實(shí)現(xiàn)抗菌。對(duì)于抗菌肽與細(xì)菌細(xì)胞膜的相互作用機(jī)制，目前還無法完全闡明，有多種常見的模型假說[16]，如桶-板模型、環(huán)-孔模型、地毯模型和聚集模型。在桶-板模型中[17]，隨著抗菌肽在細(xì)胞膜表面聚集，其垂直插入脂質(zhì)雙分子層中，疏水部分朝外，親水部分朝內(nèi)形成通道，致使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)流出；環(huán)-孔模型與桶-板模型相似[17]，不同的是在環(huán)-孔模型中抗菌肽的疏水部分與細(xì)胞膜脂質(zhì)層相結(jié)合，共同環(huán)繞著含有抗菌肽親水部分的孔洞；在地毯模型中[18]，抗菌肽完全平行覆蓋在細(xì)胞膜表面，隨著抗菌肽不斷聚集，細(xì)胞膜磷質(zhì)層穩(wěn)定性降低，最后完全被抗菌肽覆蓋并破裂；在聚集模型中[19]，抗菌肽與細(xì)胞膜相互結(jié)合，覆蓋細(xì)胞膜導(dǎo)致其破裂的同時(shí)也形成導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏的孔道，這些孔道會(huì)進(jìn)一步幫助抗菌肽進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)與傳統(tǒng)抗生素分子相似的對(duì)核酸、蛋白質(zhì)、酶等合成進(jìn)行抑制的功能。無論是哪種模型，抗菌肽都能夠使細(xì)胞膜穿透性大大增加，導(dǎo)致細(xì)胞溶解、胞內(nèi)物質(zhì)流出，引發(fā)細(xì)胞死亡?？咕耐ㄟ^細(xì)胞膜途徑引發(fā)細(xì)菌細(xì)胞死亡的生物活性與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，對(duì)抗菌肽的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)上的研究已經(jīng)有了一定成果。

2 抗菌肽的結(jié)構(gòu)-生物活性關(guān)系

抗菌肽的抗菌活性與其結(jié)構(gòu)聯(lián)系緊密，這種基于細(xì)胞膜損傷機(jī)制的抗菌活性為抗菌肽結(jié)構(gòu)修飾優(yōu)化提供了方向，其中在結(jié)構(gòu)上對(duì)抗菌活性影響較大的幾個(gè)因素包括電荷數(shù)、疏水性、螺旋度與兩親性等。

適當(dāng)增加抗菌肽的正電荷數(shù)能夠提高其抗菌活性[20]。絕大部分抗菌肽在中性pH下都為陽離子型，帶正電荷，以此通過靜電相互作用附著在細(xì)菌帶負(fù)電的細(xì)胞表面。此外，正電荷還能夠使抗菌肽與細(xì)胞膜脂多糖上的Ca2+、Mg2+結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，深入細(xì)胞膜內(nèi)部，進(jìn)一步破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)[21]。細(xì)菌細(xì)胞的脂質(zhì)膜作為抗菌肽作用的主要靶點(diǎn)，抗菌肽的疏水性對(duì)其與脂質(zhì)膜的相互作用有著重要影響。通過引入疏水性殘基，提高抗菌肽的疏水性，可以提高其抗菌活性。但過強(qiáng)的疏水性也會(huì)引發(fā)抗菌肽的自我聚集，降低其溶解度與抗菌活性[22]。大多數(shù)的抗菌肽有著α-螺旋的二級(jí)結(jié)構(gòu)，抗菌肽在α-螺旋下能夠更好地與細(xì)胞膜相結(jié)合，因此抗菌肽的螺旋度被認(rèn)為與其抗菌活性有較強(qiáng)的相關(guān)性[22]。最后，兩親性是絕大多數(shù)抗菌肽具有的特性，其本身也是抗菌肽在電荷數(shù)與疏水性上取得平衡的結(jié)果，意味著抗菌肽既能夠通過親水域的靜電作用吸附在細(xì)胞膜，也可以通過疏水域與細(xì)胞膜的相互作用滲入膜結(jié)構(gòu)中，呈現(xiàn)抗菌活性。

3 抗菌肽的近期臨床前結(jié)構(gòu)優(yōu)化研究進(jìn)展

針對(duì)上述幾個(gè)方面，通過優(yōu)化抗菌肽的氨基酸序列能夠改善其抗菌活性。此外，其他的化學(xué)修飾手段，如C端酰胺化、N端乙?；⒂喓铣森h(huán)（利用小分子連接子，共價(jià)交聯(lián)不同位置氨基酸的側(cè)鏈，提高多肽穩(wěn)定性等屬性）、烷基鏈引入等方法[23-24]也被廣泛應(yīng)用于抗菌肽結(jié)構(gòu)改造，以此達(dá)到高抗菌活性、提高多肽穩(wěn)定性和降低溶血毒性等目的。下文將會(huì)介紹近年來通過疏水性、正電荷調(diào)整和其他化學(xué)修飾手段對(duì)抗菌肽進(jìn)行優(yōu)化的臨床前研究進(jìn)展。

3.1 氨基酸替換

對(duì)抗菌肽序列中的氨基酸進(jìn)行替換、優(yōu)化，以此調(diào)控多肽電荷、疏水性和二級(jí)結(jié)構(gòu)等屬性，從而實(shí)現(xiàn)更好的抗菌效果、更低的毒性或更高的穩(wěn)定性，一直是抗菌肽臨床前研究中的主要內(nèi)容。Nibbering等[25]通過對(duì)人源抗菌肽LL37上C端的24個(gè)氨基酸序列進(jìn)行隨機(jī)替換和計(jì)算機(jī)活性預(yù)測，再將序列中的谷氨酰胺替換為陽離子的賴氨酸或精氨酸，提高其正電荷數(shù)和螺旋度，篩選合成了25個(gè)多肽衍生物，其中的抗菌肽SAAP148對(duì)多種多重耐藥菌都具有良好的抗菌效果，其在50%血漿中對(duì)金黃色葡萄球菌的99.9%殺菌濃度LC99.9可達(dá)1.6～12.8 μmol/L，而改構(gòu)原型LL-37的相應(yīng)LC99.9則要大于204.8 μmol/L。SAAP148在血漿中的殺菌效果優(yōu)于多種臨床前和臨床研究階段的抗菌肽抑菌水平。

Deber等[26]從稀有的含連續(xù)多個(gè)陽離子氨基酸序列的天然抗菌肽出發(fā)，設(shè)計(jì)合成了含有“陽離子簇”的抗菌肽6K-F17，通過改換賴氨酸位置改變該多肽電荷分布，調(diào)整其兩親性，以探究兩親性對(duì)生物活性的影響。研究發(fā)現(xiàn)，雖然電荷分布更平均、兩親性更好的結(jié)構(gòu)具有更高的抗菌活性，但對(duì)人體正常細(xì)胞的毒性也會(huì)隨之增加，且抗酶解穩(wěn)定性也會(huì)下降。N端含有連續(xù)6個(gè)賴氨酸，正電荷集中的6K-F17破壞細(xì)菌細(xì)胞膜能力強(qiáng)，對(duì)人細(xì)胞毒性低，有著更好的抗菌選擇性。6K-F17對(duì)銅綠假單胞菌的MIC為3.1～25 μmol/L，而6個(gè)賴氨酸分散在多肽序列中的1K-5K抗菌肽的相應(yīng)MIC則為25～>50 μmol/L。6K-F17也擁有更低的毒性和更好的多肽穩(wěn)定性，在其40 μmol/L濃度下未觀察到細(xì)胞溶血，且在血漿中保留24 h后抗菌肽含量依然無減少。

倪京滿等[27]基于蜂毒抗菌肽anoplin設(shè)計(jì)合成了一系列疏水或親水氨基酸替換的短鏈衍生物，對(duì)衍生物的生物活性與其正電荷、疏水性、兩親性和二級(jí)結(jié)構(gòu)間的關(guān)系進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這些衍生物的陽離子氨基酸與疏水氨基酸各自分布在α-螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)的疏水面與親水面上。作者總結(jié)了抗菌肽衍生物疏水性分別對(duì)革蘭陰性和陽性菌抗菌活性的影響，篩選出了具有最高抗菌活性和低毒性的抗菌肽A-21，其對(duì)金黃色葡萄球菌和鮑曼不動(dòng)桿菌的MIC95可達(dá)4～8 μmol/L，優(yōu)于anoplin的256～512 μmol/L；同時(shí)A-21的最低溶血濃度MHC（抗菌肽引發(fā)10%人血紅細(xì)胞溶血所需濃度）為134.38 μmol/L，溶血毒性較低。

單安山等[28]利用組氨酸側(cè)鏈上亞胺pH敏感的質(zhì)子化性質(zhì)，以北非蝎子毒素中的抗菌肽AaeAP2a為模板，使用組氨酸替代賴氨酸設(shè)計(jì)并篩選出了具有酸性pH響應(yīng)能力的抗菌肽F5?？咕腇5在pH 7.4的生理pH下對(duì)革蘭陰性菌的殺菌能力微弱，MIC>64 μmol/L，而在pH 6.5的微酸性pH下相應(yīng)抗菌活性明顯增強(qiáng)，MIC可達(dá)2～16 μmol/L。此外，模板AaeAP2a在pH 7.4或6.5時(shí)MHC為16或2 μmol/L，而F5的MHC要大于128 μmol/L。 在膿腫環(huán)境下，F(xiàn)5可以有效殺傷處于酸性pH中的有害細(xì)菌，同時(shí)避免了對(duì)正常生理pH中有益共生菌的傷害。

3.2 線性肽成環(huán)

除了常規(guī)的氨基酸替換優(yōu)化方法，將線性肽通過二硫鍵、訂合等方法成環(huán)的手段在提高抗菌肽活性、穩(wěn)定性等方面也有著廣泛應(yīng)用。賴仞等[29]以金環(huán)蛇毒中的抗菌肽衍生物cathelicidin-BF15為基礎(chǔ)，使用色氨酸與賴氨酸替換原多肽中的所有苯丙氨酸、絲氨酸和亮氨酸，再插入半胱氨酸（Cys）成環(huán)，得到了具有保留強(qiáng)效抗菌活性、低溶血性的同時(shí)具有更高穩(wěn)定性的抗菌肽ZY4，其對(duì)具有多重耐藥性的銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌引起的MIC可達(dá)0.8～4.0 μmol/L；而ZY4的MHC大于320 μg/mL，溶血毒性較低。此外，在血漿中保存10 h后，ZY4依然有91%保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

Walensky等[30]對(duì)天然抗菌肽蛙皮素II進(jìn)行訂合修飾，篩選了不同位點(diǎn)的i+4與i+7（將i與i+4或i與i+7位兩個(gè)氨基酸的側(cè)鏈連接）訂合肽，對(duì)比其抗菌活性與紅細(xì)胞溶血度，并對(duì)不同位點(diǎn)訂合的抗菌肽疏水面進(jìn)行分析，結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)了抗菌肽篩選算法。通過算法確定在15位氨基酸訂合后，再根據(jù)算法使用賴氨酸掃描在9位將丙氨酸替換為賴氨酸（A9K），使其在25 μg/mL濃度時(shí)的細(xì)胞溶血由13%降低到3%。之后作者再對(duì)已有訂合肽在細(xì)胞膜上形成環(huán)-孔的具體機(jī)制進(jìn)行了分析，以完善算法。作者進(jìn)一步在Mag（i+4）15（A9K）的基礎(chǔ)上，在1位氨基酸上增加一處訂合以提高穩(wěn)定性，最后對(duì)剩余位點(diǎn)氨基酸進(jìn)行替換調(diào)整，通過算法幫助篩選出了具有最優(yōu)的抗多重耐藥菌活性、低溶血性、低毒性和高穩(wěn)定性的雙訂合抗菌肽Mag（i +4）1，15 （A9K， B21A， N22K， S23K），其對(duì)銅綠假單胞菌的MIC可達(dá)1.56 μg/mL，而篩選前Mag2抗菌肽的相應(yīng)MIC則大于50 μg/mL。

3.3 非氨基酸結(jié)構(gòu)引入的化學(xué)修飾

向多肽中引入非氨基酸結(jié)構(gòu)（如脂肪鏈等）來實(shí)現(xiàn)對(duì)抗菌肽性能的調(diào)控也是常用的方法之一。Kamysz等[31]將C2-C14烷基鏈或芳香環(huán)引入人源抗菌肽LL37的片段肽KR12-NH2的N端，以研究這種親脂性修飾對(duì)抗菌活性和溶血性的影響。研究發(fā)現(xiàn)，在適當(dāng)長度范圍（C6-C12）內(nèi)，N端烷基鏈修飾能夠增加KR12-NH2的抗菌活性；但過長烷基鏈修飾（C14）的多肽會(huì)自組裝為更大的聚集結(jié)構(gòu)，反而會(huì)導(dǎo)致抗菌活性下降。經(jīng)過對(duì)比，抗菌活性與溶血性取得平衡的最優(yōu)結(jié)構(gòu)為C8烷基鏈N端修飾的抗菌肽C8-KR12-NH2，其對(duì)于金黃色葡萄球菌的MIC可達(dá)2～4 μg/mL，而無烷基鏈修飾的Ac-KR12-NH2相應(yīng)MIC大于256 μg/mL。同時(shí)，C8-KR12-NH2的MHC為64 μg/mL，而更長烷基鏈（C10-C14）修飾的KR12-NH2在相同濃度下則會(huì)引發(fā)85%～100%的細(xì)胞溶血。

3.4 單體多聚化

將單體抗菌肽二聚化或多聚化對(duì)擴(kuò)展廣譜性、提高抗菌活性和穩(wěn)定性都有一定幫助，是一種有效的修飾手段。Wade等[32]通過二硫鍵、二甲苯或全氟苯連接Cys的方法，對(duì)先期研究中通過各種化學(xué)修飾手段得到的富脯氨酸抗菌肽Chex1-Arg20進(jìn)行了二聚化。研究發(fā)現(xiàn)，使用四氟苯和八氟聯(lián)苯連接的抗菌肽二聚體對(duì)多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC19606和FADDI-AB156的抗菌活性分別可達(dá)5 μg/mL和13.5 μg/mL，而Chex1-Arg20單體的相應(yīng)抗菌活性為200 μg/mL和大于250 μg/mL。此外，Chex1-Arg20二聚體還被發(fā)現(xiàn)能夠緩解細(xì)菌感染引發(fā)的炎癥和提高宿主先天免疫。

3.5 抗菌肽與小分子抗生素偶聯(lián)

將抗菌肽與小分子抗生素通過連接子進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)，利用抗菌肽靶向細(xì)菌細(xì)胞膜，再切斷抗菌肽與抗生素間的共價(jià)連接釋放活性小分子抗生素，能夠同時(shí)結(jié)合小分子的細(xì)胞內(nèi)殺菌功能與抗菌肽的廣譜殺菌和針對(duì)多重耐藥菌的高活性特點(diǎn)，獲得比以上兩者單純聯(lián)用更好的抗菌效果。Matsuzaki等[33]在爪蟾抗菌肽類似肽9P2-2和富脯氨酸抗菌肽oncocin兩種多肽的C端與N端分別引入Cys，再通過二硫鍵或硫醚鍵與氨芐西林衍生分子共價(jià)連接，得到了可切斷或不可切斷的抗菌肽-小分子抗生素偶聯(lián)分子。通過篩選發(fā)現(xiàn)，9P2-2在N端引入Cys后再通過二硫鍵連接氨芐西林衍生分子的偶聯(lián)分子Amp-SS-9P2-2在抗革蘭陰性菌的活性上有著顯著提高。針對(duì)具有耐藥性的鮑曼不動(dòng)桿菌，Amp-SS-9P2-2的MIC可達(dá)2.5 μmol/L，低于單獨(dú)使用氨芐西林時(shí)的320 μmol/L或單獨(dú)使用9P2-2的10 μmol/L，而同劑量的氨芐西林與9P2-2單純聯(lián)用時(shí)MIC也只能達(dá)到10 μmol/L。

3.6 與其他材料聚合

將抗菌肽與其他材料相聚合，形成復(fù)合材料，可以突出抗菌肽的廣譜抗菌優(yōu)勢，彌補(bǔ)其價(jià)格較昂貴、具有潛在毒性等缺陷，并同時(shí)實(shí)現(xiàn)其他材料的功能。程飚等[34]將抗菌肽cecropin通過端基與側(cè)鏈的氨基與透明質(zhì)酸（HA）的羧基通過縮合反應(yīng)結(jié)合，再與氧化葡萄糖（ODEX）和富血小板血漿簇（PRP）通過席夫堿交聯(lián)制成水凝膠ODEX/HA-AMP/PRP，用以幫助慢性感染的傷口愈合。這種包含抗菌肽在內(nèi)的多組分水凝膠將各組分功能整合，在包裹傷口后可以緩慢釋放抗菌肽和PRP，通過抗菌肽消殺細(xì)菌緩解炎癥，通過PRP促進(jìn)膠原增殖收縮和血管生成。在糖尿病傷口感染的小鼠模型中，ODEX/HA-AMP/PRP明顯抑制了傷口處的細(xì)菌生長，處理3d時(shí)傷口處的銅綠假單胞菌和金黃葡萄球菌數(shù)量為106數(shù)量級(jí)，明顯優(yōu)于單純紗布包扎處理情況下的108數(shù)量級(jí)；ODEX/HA-AMP/PRP也加快了傷口愈合速度，處理14 d的傷口面積減小為開始的10%左右，明顯優(yōu)于單純紗布包扎處理情況下的50%。

3.7 引入納米載體

最后，使用納米載體加載抗菌肽用于體內(nèi)遞送，能夠克服抗菌肽的酶解不穩(wěn)定性和脫靶毒性等缺點(diǎn)，從而提高抗菌肽的藥代動(dòng)力學(xué)與藥效數(shù)據(jù)[35]。Lee等[36]使用DSPE-PEG修飾HnMc抗菌肽中Cys的側(cè)鏈巰基，再將修飾后的DSPE-PEG-HnMc與PLGA-PEG以質(zhì)量比2： 8共同自組裝，形成了平均粒徑為60 nm的HnMc納米膠束。該納米膠束中，疏水的PLGA與DSPE被包裹在膠束中心，親水的PEG和HnMc抗菌肽分布在表面，因而可以主動(dòng)靶向并破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜；而同在膠束表面的PEG鏈則可以保護(hù)HnMc抗菌肽免受非特異性蛋白的吸附和降解。HnMc納米膠束在0.1 mg/mL的濃度下也能夠?qū)δ退幍你~綠假單胞菌和金黃葡萄球菌實(shí)現(xiàn)80%的生長抑制效果；HnMc納米膠束的MHC為1 mg/mL，毒性較低；在耐藥銅綠假單胞菌肺部感染的小鼠模型中，HnMc納米膠束成功延長了小鼠的生存時(shí)間，在2.5 mg/kg劑量下生存時(shí)間由不經(jīng)處理的6 d延長到16 d以上。

上述研究中所涉及的氨基酸序列及修飾手段總結(jié)可見表1。除了以上提及的氨基酸替換或化學(xué)修飾手段外，使用D構(gòu)型或其他非天然氨基酸替換、聚乙二醇或糖基化修飾等方法均為抗菌肽結(jié)構(gòu)優(yōu)化常見思路[12，37]。

4 結(jié)論與展望

本文主要綜述了抗菌肽作用機(jī)理、結(jié)構(gòu)優(yōu)化思路和近年來的臨床前研究進(jìn)展。相較于傳統(tǒng)抗生素，抗菌肽主要針對(duì)細(xì)胞膜的作用機(jī)制在抗菌廣譜性與抗多重耐藥性上具有明顯優(yōu)勢。通過多種修飾手段對(duì)抗菌肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化的思路，如化學(xué)修飾和計(jì)算機(jī)輔助篩選等方法，在抗菌肽研究中已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用。盡管上述結(jié)構(gòu)優(yōu)化手段在臨床和產(chǎn)業(yè)化階段應(yīng)用還未全面推廣，但隨著針對(duì)耐藥菌的新型抗菌藥物需求的不斷增大，具有廣譜性、對(duì)耐藥菌高活性和高生物相容性優(yōu)點(diǎn)的抗菌肽將來必然會(huì)成為臨床研究熱點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

Mohammed I， Said D G， Dua H S， et al. Human antimicrobial peptides in ocular surface defense[J]. Prog Retin Eye Res， 2017， 61（1）： 1-22.

Kang H K， Kim C， Seo C H， et al. The therapeutic applications of antimicrobial peptides （AMPs）： A patent review[J]. J Microbiol， 2017， 55（1）： 1-12.

Lei J， Sun L， Huang S， et al. The antimicrobial peptides and their potential clinical applications[J]. Am J Transl Res， 2019， 11（7）： 3919-3931.

Mookherjee N， Anderson M A， Haagsman H P ， et al. Antimicrobial host defence peptides： Functions and clinical potential[J]. Nat Rev Drug Discov， 2020， 19（5）： 311-332.

Roudi R， Syn N L， Roudbary M， et al. Antimicrobial peptides as biologic and immunotherapeutic agents against cancer： A comprehensive overview[J]. Front Immunol， 2017， 8（1）： 1320.

Zhang L J， Gallo R L. Antimicrobial peptides[J]. Curr Biol， 2016， 26（1）： R14-R19.

Pfalzgraff A， Brandenburg K， Weindl G， et al. Antimicrobial peptides and their therapeutic potential for bacterial skin infections and wounds[J]. Front Pharmacol， 2018， 9（1）： 281.

Tania V， Michela B， Andrea R， et al. Multitalented synthetic antimicrobial peptides and their antibacterial， antifungal and antiviral mechanisms[J]. Int J Mol Sci， 2022， 23（1）： 545.

Hye Been K， Jiwon S. Antimicrobial peptides under clinical investigation[J]. Pept Sci， 2019， 111（5）： e24122.

Costa F， Teixeira C， Gomes P， et al. Clinical application of AMPs[J]. Adv Exp Med Biol， 2019， 1117（1）： 281-298.

Mahlapuu M， H?kansson J， Ringstad L， et al. Antimicrobial peptides： An emerging category of therapeutic agents[J]. Front Cell Infect Microbiol， 2016， 6（1）： 194.

Wenyi L， Frances S， Neil S， et al. Chemically modified and conjugated antimicrobial peptides against superbugs[J]. Chem Soc Rev， 2021， 50（8）： 4932-4973.

Walsh C. Molecular mechanisms that confer antibacterial drug resistance[J]. Nature， 2000， 406（6797）： 775-781.

Davies J， Davies D. Origins and evolution of antibiotic resistance[J]. Microbiol Mol Biol Rev， 2010， 74（3）： 417-433.

Xuan J Q， Feng W G， Wang J Y， et al. Antimicrobial peptides for combating drug-resistant bacterial infections[J]. Drug Resist Updat， 2023， 68（1）： 100954.

Zhang Q Y， Yan Z B， Meng Y M， et al. Antimicrobial peptides： Mechanism of action， activity and clinical potential[J]. Military Med Res， 2021， 8（1）： 48.

Kumar P， Kizhakkedathu J N， Straus S K， et al. Antimicrobial peptides： Diversity， mechanism of action and strategies to improve the activity and biocompatibility in vivo[J]. Biomolecules. 2018， 8（1）： 4.

Lee T H， Hall K N， Aguilar M I， et al. Antimicrobial peptide structure and mechanism of action： A focus on the role of membrane structure[J]. Curr Top Med Chem， 2016， 16（1）： 25-39.

Hale J D， Hancock R E. Alternative mechanisms of action of cationic antimicrobial peptides on bacteria[J]. Expert Rev Anti Infect Ther， 2007， 5（6）： 951-959.

Arias M， Piga K B， Hyndman M E， et al. Improving the activity of Trp-rich antimicrobial peptides by Arg/Lys substitutions and changing the length of cationic residues[J]. Biomolecules， 2018， 8（2）： 19.

Hancock R E. Cationic peptides： Effectors in innate immunity and novel antimicrobials[J]. Lancet Infect Dis， 2001， 1（3）： 156-164.

Dathe M， Wieprecht T. Structural features of helical antimicrobial peptides： Their potential to modulate activity on model membranes and biological cells[J]. Biochimica et Biophysica Acta， 1999， 1462（1-2）： 71-87.

Chu-Kung A F， Nguyen R， Bozzelli K N， et al. Chain length dependence of antimicrobial peptide-fatty acid conjugate activity[J]. J Colloid Interf Sci， 2010， 345（2）： 160-167.

You Y H， Liu H Y， Zhu Y Z， et al. Rational design of stapled antimicrobial peptides[J]. Amino Acids， 2023， 55（1）： 421-442.

Breij A， Riool M， Cordfunke R A， et al. The antimicrobial peptide SAAP-148 combats drug-resistant bacteria and biofilms[J]. Sci Transl Med， 2018， 10（423）： eaan4044.

Stone T A， Cole G B， Lake R D， et al. Positive charge patterning and hydrophobicity of membrane active antimicrobial peptides as determinants of activity， toxicity， and pharmacokinetic stability[J]. J Med Chem， 2019， 62（13）： 6276-6286.

Gou S H， Li B B， Ouyang X， et al. Novel broad-spectrum antimicrobial peptide derived from anoplin and its activity on bacterial pneumonia in mice[J]. J Med Chem， 2021， 64（15）： 11247-11266.

Wang Z H， Li Q K， Li J Z， et al. pH-responsive antimicrobial peptide with selective killing activity for bacterial abscess therapy[J]. J Med Chem， 2022， 65（7）： 5355-5373.

Mwangi J， Yin Y， Wang G， et al. The antimicrobial peptide ZY4 combats multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii infection[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2019， 116（52）： 26516-26522.

Mourtada R， Herce H D， Yin D J， et al. Design of stapled antimicrobial peptides that are stable， nontoxic and kill antibiotic-resistant bacteria in mice[J]. Nat Biotechnol， 2019， 37（10）： 1186-1197.

Kamysz E， Sikorska E， Jaskiewicz M， et al. Lipidated analogs of the LL-37-derived peptide fragment KR12 -structural analysis， surface-active properties and antimicrobial activity[J]. Int J Mol Sci， 2020， 21（3）： 887-908.

Li W， Lin F， Hung A， et al. Enhancing proline-rich antimicrobial peptide action by homodimerization： Influence of bifunctional linker[J]. Chem Sci， 2022， 13（8）： 2226-2237.

Yamauchi R， Kawano K， Yamaoka Y， et al. Development of antimicrobial peptide-antibiotic conjugates to improve the outer membrane permeability of antibiotics against gram-negative bacteria[J]. ACS Infect Dis， 2022， 8（1）： 2339-2347.

Wei S K， Xu P C， Yao Z X， et al. A composite hydrogel with co-delivery of antimicrobial peptides and platelet-rich plasma to enhance healing of infected wounds in diabetes[J]. Acta Biomaterialia， 2021， 124（1）： 205-218.

Cesaro A， Lin S， Pardi N， et al. Advanced delivery systems for peptide antibiotics[J]. Adv Drug Deliv Rev， 2023， 196（1）： 114733.

Park S， Ko C， Hyeon H， et al. Imaging and targeted antibacterial therapy using chimeric antimicrobial peptide micelles[J]. ACS Appl Mater Interf， 2020， 12（49）： 54306-54315.

Gan B H， Gaynord J， Rowe S M， et al. The multifaceted nature of antimicrobial peptides： Current synthetic chemistry approaches and future directions[J]. Chem Soc Rev， 2021， 50（13）： 7820-7880.