基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)探討酸棗仁皂苷A 改善阿爾茨海默病小鼠認(rèn)知功能障礙的機(jī)制

王 翠，肖洪賀，聞彩名，趙宇萌，田 雨，劉 月，楊靜嫻

1. 大連市中心醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 大連 116089

2. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116620

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是一種與衰老相關(guān)的漸進(jìn)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙、學(xué)習(xí)記憶能力減退、日常生活能力逐漸喪失等。其典型病理特征為神經(jīng)元之間β 淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）沉積形成老年斑、神經(jīng)元內(nèi)Tau 蛋白過(guò)度磷酸化形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangle，NFT），以及由此引發(fā)的彌漫性炎性壞死病灶和神經(jīng)元大量死亡。目前關(guān)于AD 的發(fā)病機(jī)制尚未清楚，但Aβ 聚集被公認(rèn)為是其核心機(jī)制，具有神經(jīng)毒性的Aβ42聚集形成不溶性淀粉樣斑塊，激活膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)毒性介質(zhì)和炎癥因子，進(jìn)而促使神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)斑塊形成，最終損害局部神經(jīng)元[1-5]。此外，慢性炎癥性疾病如動(dòng)脈粥樣硬化、肥胖/代謝綜合征、2 型糖尿病和重度抑郁等都是AD 發(fā)生發(fā)展的危險(xiǎn)因素[6]。AD的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，目前對(duì)其理解還很局限，因此從不同角度開展對(duì)AD 發(fā)病機(jī)制和治療的研究已成為本領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為心藏神、肝藏魂、脾藏意、腎藏精，AD 與五臟中心、肝、脾、腎的功能失調(diào)密切相關(guān)，因此中醫(yī)臨床上常以養(yǎng)心安神、補(bǔ)腎填精、益氣健脾、平肝開竅來(lái)治療AD[7-8]。酸棗仁有養(yǎng)肝寧心、安神生津的功效，是《中國(guó)藥典》收載的治療失眠最常用的單味中藥。研究表明，AD 患者中有25%～40%伴有睡眠結(jié)構(gòu)改變[9]，睡眠障礙可加速Aβ 沉積，影響腦內(nèi)微環(huán)境，干擾海馬神經(jīng)干細(xì)胞活性而抑制神經(jīng)再生，從而加重AD 的病理進(jìn)程[10-12]。酸棗仁皂苷A（jujuboside A，JuA）是酸棗仁Ziziphi SpinosaeSemen中含量最高的一種皂苷成分，除具有鎮(zhèn)靜催眠、抗焦慮、抗抑郁等作用外，還有抗氧化、抗炎、抗凋亡和神經(jīng)保護(hù)等多種生物活性[13]。本課題組前期研究及他人研究均已發(fā)現(xiàn)，JuA 可抑制AD 小鼠腦內(nèi)炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激損傷，促進(jìn)Aβ清除，減輕腦組織損傷[14-15]，并激活內(nèi)源神經(jīng)干細(xì)胞促進(jìn)海馬神經(jīng)再生[16]。以上研究表明JuA 具備治療AD 的潛力，但其相關(guān)作用機(jī)制尚不十分清楚。本研究以淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）/早老蛋白1（pesenilin 1，PS1）雙轉(zhuǎn)基因小鼠作為 AD 模型，采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序（transcriptome sequencing，RNA-Seq）技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)方法，分析JuA 治療AD 的潛在靶基因及相關(guān)信號(hào)通路，并予以實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以闡明JuA 治療AD的分子機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

野生型C57BL/6 小鼠10 只，7 月齡SPF 級(jí)APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠50 只，購(gòu)自江蘇華創(chuàng)信諾醫(yī)藥科技有限公司，合格證號(hào)SCXK（蘇）2020-0009，動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（遼）2019-0004，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理批準(zhǔn)號(hào)YN2022-039-56。動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由進(jìn)食進(jìn)水，室溫20～25 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，每日12 h 光照維持，晝夜循環(huán)。

1.2 藥品與試劑

JuA（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.78%，批號(hào)22032904）購(gòu)自成都普菲德生物科技有限公司；鹽酸多奈哌齊片（安理申，國(guó)藥準(zhǔn)字H20050978，批號(hào)2203026）由衛(wèi)材（中國(guó)）藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；尼氏（Nissl）染色液（批號(hào)C0117）購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（批號(hào)D006-1-2）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；組織冰凍切片OCT 包埋劑（批號(hào)4583）購(gòu)自美國(guó)Sakura 公司；TRIzol 試劑（批號(hào)T101100）購(gòu)自上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司公司；三氯甲烷（批號(hào)0706106）購(gòu)自上海申博化工有限公司；異丙醇（批號(hào)20170901）購(gòu)自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)G592）購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；qRT-PCR檢測(cè)試劑盒（批號(hào)31598800）購(gòu)自瑞士Roche 公司；RNA 6000 Nano kit 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)5067-1511）購(gòu)自美國(guó)Agilent 公司；葡萄糖激酶（glucokinase，Gck）抗體（批號(hào)sc-17819）購(gòu)自圣克魯斯生物技術(shù)有限公司；HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗（批號(hào)bs-40295G-HRP）購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；GAPDH 抗體（批號(hào)WL01114）購(gòu)自萬(wàn)類生物科技有限公司。

1.3 儀器

Ti-s 型倒置熒光顯微鏡及成像系統(tǒng)（日本尼康公司）；HM 525NX 型冰凍切片（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；MS-1 型水迷宮分析系統(tǒng)（成都儀器廠）；Illumina HiSeq 6000 型測(cè)序儀（美國(guó)Illumina公司）；DW-86L386 型超低溫冰箱（青島海爾集團(tuán)）；5424R 型低溫離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）；CFXconnect qRT-PCR 儀、Power Pac Universal Power Supply 型通用電泳儀、Trans-Blot SD 半干式蛋白轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；5200Multi 型凝膠成像儀（上海天能公司）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組與給藥

APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠50 只，按體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組及JuA 低、中、高劑量組和鹽酸多奈哌齊組，每組10 只；另取野生型C57BL/6 小鼠10 只作為對(duì)照組。依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[13,17]和本課題組前期研究結(jié)果，將JuA 的給藥劑量確定為5、10、20 mg/kg（ip 給藥），1 次/d，連續(xù)21 d；模型組和對(duì)照組ip等體積生理鹽水；多奈哌齊組按人與小鼠等效劑量換算為0.65 mg/kg（ig 給藥），1 次/d，連續(xù)21 d。

2.2 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)

連續(xù)給藥21 d 后，采用Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。前5 d 為定位航行實(shí)驗(yàn)，第6 天為空間探索實(shí)驗(yàn)。①定向航行實(shí)驗(yàn)：將小鼠隨機(jī)面朝池壁放入水中，其游泳軌跡圖由拍攝系統(tǒng)自動(dòng)采集、分析，將游泳路程和找到平臺(tái)并在其上停留15 s 所需時(shí)間定義為逃避潛伏期，每天以4 次訓(xùn)練中潛伏期的平均值作為當(dāng)日成績(jī)，評(píng)估小鼠的學(xué)習(xí)能力；②空間探索實(shí)驗(yàn)：第6 天撤去平臺(tái)，選擇原平臺(tái)的對(duì)側(cè)作為入水點(diǎn)，記錄小鼠在60 s 內(nèi)穿越原平臺(tái)的次數(shù)、在原平臺(tái)所在象限停留時(shí)間百分比及第1 次穿越平臺(tái)前的游泳距離，評(píng)估小鼠的記憶能力。

2.3 腦組織樣本處理與Nissl 染色

水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小鼠ip 4%水合氯醛麻醉，心臟灌流后取腦，冰凍包埋、?80 ℃速凍，用冰凍切片進(jìn)行連續(xù)冠狀切片（10 μm）。將腦切片用4%多聚甲醛固定10 min 后，放入Nissl 染液中，待尼氏體清晰后終止反應(yīng)；再依次經(jīng)70%、100%乙醇脫水30 s，二甲苯透化5 min，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察皮層、海馬尼氏體的數(shù)量。

2.4 HE 染色

將腦片用4%多聚甲醛固定10 min 后，置于50 ℃的蘇木素中5 min，流水洗去殘余液體后置于分化液中10～20 s，用潤(rùn)洗2 次；放入0.5%氨水中反藍(lán)10 s，ddH2O 再次潤(rùn)洗；放入伊紅染液中3～5 s，ddH2O潤(rùn)洗2 次；用不同濃度乙醇進(jìn)行梯度脫水后，二甲苯透化5 min，中性樹脂膠封片，在顯微鏡下觀察皮層和海馬組織形態(tài)變化。

2.5 總RNA 提取與RNA-Seq 分析

取對(duì)照組、模型組與JuA 高劑量組小鼠各3 只，切取腦內(nèi)海馬組織，委托上海派森諾生物科技有限公司進(jìn)行RNA 提取與RNA-Seq 測(cè)序。將腦組織切成小塊，用TRIzol 裂解液低溫提取總RNA，質(zhì)檢合格后通過(guò)帶有Oligo（dT）的磁珠富集具有polyA的mRNA，以片段化的mRNA 為模板合成雙鏈cDNA，隨后對(duì)cDNA 進(jìn)行末端修復(fù)、加A 尾并連接測(cè)序接頭；通過(guò)AMPure XP beads 篩選cDNA，PCR 擴(kuò)增后，再對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化處理，最終獲得cDNA 文庫(kù)。采用Illumina HiSeq 6000 型測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序分析[18-19]。

2.6 基因本體（gene ontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的原始數(shù)據(jù)（raw data）進(jìn)行過(guò)濾，篩選得到高質(zhì)量數(shù)據(jù)信息；用DESeq v1.20.0 軟件研究各組之間的差異表達(dá)基因，將條件設(shè)置為差異倍數(shù)|log2FC|＞1，顯著性P＜0.05，對(duì)9 個(gè)樣品的mRNA 進(jìn)行差異表達(dá)基因的篩選。為了掌握差異基因所參與的生物學(xué)過(guò)程、分子功能和細(xì)胞組分，使用GO 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)所獲得基因進(jìn)行富集分析；再用KEGG 進(jìn)行代謝通路的富集分析，從而獲取關(guān)鍵通路信息，并通過(guò)R 語(yǔ)言將相關(guān)信息進(jìn)行可視化分析[18-19]。

2.7 qRT-PCR 檢測(cè)基因表達(dá)

用TRIzol 提取海馬組織總RNA，檢測(cè)其濃度和完整性后按試劑盒說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，以GAPDH 為內(nèi)參基因，定量檢測(cè)目的基因表達(dá)水平。引物序列見(jiàn)表1。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃、3 min，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，40 個(gè)循環(huán)；反應(yīng)完畢使用2?ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，以對(duì)篩選出的關(guān)鍵基因表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2.8 Western blotting 檢測(cè)蛋白表達(dá)

提取各組小鼠海馬組織總蛋白，采用BCA 法測(cè)定蛋白濃度；將待測(cè)蛋白液上樣到10% SDSPAGE 凝膠電泳上進(jìn)行分離，然后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，用5%脫脂牛奶封閉2 h 后，加入Gck 一抗，4 ℃孵育過(guò)夜；次日，用TBST 洗膜3 次，每次15 min，孵育二抗，TBST 洗膜3 次，每次15 min，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，凝膠成像儀拍照，用Image J軟件分析圖像灰度值，以GAPDH 作為內(nèi)參，計(jì)算相應(yīng)蛋白表達(dá)量。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用GraphPad Prism 5.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，水迷宮實(shí)驗(yàn)中的逃避潛伏期數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量雙因素方差分析（Two-way ANOVA）；多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩組間比較采用雙尾學(xué)生檢驗(yàn)（Two-tailed Students’ test）。細(xì)胞計(jì)數(shù)采用Image J 軟件定量分析。

3 結(jié)果

3.1 JuA 提高AD 小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力

定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（圖1-A、B），通過(guò)訓(xùn)練后各組小鼠的逃避潛伏期呈逐日下降趨勢(shì)。與對(duì)照組比較，模型組小鼠從第2 天起逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)（P＜0.01）；經(jīng)低、中、高3 個(gè)劑量組的JuA治療后，逃避潛伏期均有不同程度縮短（P＜0.05、0.01），且隨給藥劑量的增大作用逐漸增強(qiáng)，其中高劑量組的作用與陽(yáng)性對(duì)照藥多奈哌齊組相近?？臻g探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖1-C～F），各組小鼠游泳速度無(wú)明顯差異；與對(duì)照組比較，模型組小鼠到達(dá)原有平臺(tái)的游泳距離明顯增加（P＜0.01），穿越平臺(tái)次數(shù)和在目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比均顯著降低（P＜0.01），說(shuō)明模型組小鼠記憶能力明顯下降；與模型組比較，JuA 各劑量組小鼠到達(dá)原平臺(tái)的游泳距離均明顯縮短（P＜0.05、0.01），穿越平臺(tái)次數(shù)和停留在目標(biāo)象限時(shí)間百分比明顯增多（P＜0.01），其中JuA 高劑量組效果最佳。以上結(jié)果表明，JuA 能顯著改善AD 小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力，其高劑量組作用最佳。

圖1 JuA 對(duì)AD 小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的影響 (±s, n = 10)Fig. 1 Effect of JuA on learning and memory abilities of AD mice (±s, n = 10)

3.2 JuA 減輕AD 小鼠海馬與皮層的病理?yè)p傷

將小鼠腦切片進(jìn)行HE 染色后，置于顯微鏡下觀察分析。如圖2 所示，對(duì)照組皮層、海馬CA3 和DG 區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞層次清晰、排列整齊、數(shù)量多；模型組神經(jīng)細(xì)胞排列松散、數(shù)量減少、形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞核皺縮明顯，提示模型組神經(jīng)細(xì)胞明顯受損；而與模型組比較，JuA 高劑量組神經(jīng)細(xì)胞層次較為清晰，數(shù)量增多，胞質(zhì)豐富，胞核均勻，細(xì)胞核固縮明顯減輕，說(shuō)明JuA 治療后明顯減輕了AD 小鼠腦組織的病理?yè)p傷。

圖2 JuA 對(duì)AD 小鼠皮層和海馬病理?yè)p傷和尼氏體數(shù)量的影響 (×10)Fig. 2 Effect of JuA on pathological injury and number of Nissl bodies in cortex and hippocampus of mice (× 10)

Nissl 染色結(jié)果顯示，模型組小鼠皮層、海馬區(qū)的尼氏體數(shù)量均較對(duì)照組明顯減少（P＜0.01）；而JuA 高劑量組小鼠的上述區(qū)域尼氏體數(shù)量顯著多于模型組（P＜0.01），說(shuō)明JuA 對(duì)AD 小鼠的腦組織具有明顯保護(hù)作用，顯著減輕了AD 病變對(duì)腦內(nèi)神經(jīng)元的損傷。

3.3 RNA-Seq 分析

3.3.1 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估 在所建立的測(cè)序文庫(kù)中，9 組樣本堿基質(zhì)量超過(guò)Q20的比例在98.13%以上，超過(guò)Q30的比例在94.64%以上（表2），表明測(cè)序結(jié)果較好。

表2 各組樣本cDNA 文庫(kù)測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估Table 2 Quality evaluation of cDNA library sequencing data for each group of samples

3.3.2 差異表達(dá)基因分析 用DESeq v1.20.0 軟件對(duì)RNA-Seq 得到的基因數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析，以|log2FC|＞1、P＜0.05 為條件進(jìn)行篩選。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組中共有341 個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)218 個(gè)，下調(diào)123 個(gè)；與模型組比較，JuA高劑量組中差異表達(dá)基因共有94 個(gè)，其中上調(diào)66個(gè)，下調(diào)28 個(gè)（圖3）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，模型組的5 個(gè)差異基因在JuA 干預(yù)后表達(dá)趨勢(shì)被逆轉(zhuǎn)（表3），包括Gck、白細(xì)胞介素-1 受體關(guān)聯(lián)激酶3（interleukin-1 receptor associated kinase 3，Irak3）、間皮素（mesothelin，Msln）、人角蛋白（human keratin，krt80）等基因，說(shuō)明JuA 治療AD 的機(jī)制與調(diào)控這些基因表達(dá)有關(guān)。其中Gck 是葡萄糖代謝的關(guān)鍵限速酶，其基因突變可引起2 型糖尿病，從而增加AD 的患病風(fēng)險(xiǎn)或加重AD 病理進(jìn)展。本結(jié)果顯示JuA 可逆轉(zhuǎn)AD 小鼠Gck 的降低趨勢(shì)，使其表達(dá)明顯升高（P＜0.05），提示干預(yù)葡萄糖代謝可能是JuA 治療AD 的重要機(jī)制之一。

圖3 差異表達(dá)基因分析Fig. 3 Analysis of differentially expressed genes

表3 JuA 對(duì)AD 小鼠差異基因表達(dá)的影響Table 3 Effect of JuA on differential gene expressions in AD mice

3.4 GO 功能富集分析

為進(jìn)一步明確AD 病變及JuA 治療AD 所涉及基因的生物學(xué)功能變化，本研究對(duì)模型組相較于對(duì)照組選出的341 個(gè)差異基因、JuA 高劑量組相較于模型組的94 個(gè)差異基因進(jìn)行GO 功能富集分析，主要包括生物學(xué)過(guò)程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）富集分析，并設(shè)置P＜0.05 為篩選標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果顯示，模型組vs對(duì)照組的差異基因功能主要集中在細(xì)胞分泌調(diào)節(jié)、離子通道、分泌顆粒、肽激素結(jié)合與受體活性等（圖4）；而JuA 高劑量組vs模型組的差異基因功能主要富集在離子轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞骨架與胞質(zhì)膜、核受體活性等方面（圖5）。

圖4 模型組與對(duì)照組比較差異基因GO 功能富集分析Fig. 4 GO function analysis of differential genes between model group and control group

圖5 JuA 高劑量組與模型組比較差異基因GO 功能富集分析Fig. 5 GO function analysis of differential genes between JuA high-dose group and model group

3.5 KEGG 通路富集分析

利用KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)模型組vs對(duì)照組、JuA 高劑量組vs模型組的差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋分類、通路富集分析，設(shè)置P＜0.05 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，以基因比率（gene ratio）進(jìn)行排序。如圖6 所示，模型組vs對(duì)照組的341 個(gè)差異表達(dá)基因主要富集的途徑有鈣離子信號(hào)通路、環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine 3′,5′-monophosphate，cAMP）信號(hào)通路、2 型糖尿病等，說(shuō)明以上通路與AD 發(fā)病密切相關(guān)；對(duì)JuA 高劑量組vs模型組的94 個(gè)差異基因進(jìn)行富集分析，發(fā)現(xiàn)主要涉及2 型糖尿病、細(xì)胞黏附因子、白細(xì)胞介素-17（interleukin-17，IL-17）信號(hào)通路和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGFβ）信號(hào)通路上，說(shuō)明JuA 的抗AD 作用可能與調(diào)控糖尿病和炎癥相關(guān)通路有關(guān)。

圖6 差異基因的KEGG 富集分析氣泡圖Fig. 6 Diagram of KEGG enrichment analysis of differential genes

再以模型組vs對(duì)照組、JuA 高劑量組vs模型組共同調(diào)節(jié)的信號(hào)通路進(jìn)行比對(duì)分析，共篩選出88條通路，以基因比率（gene Ratio）進(jìn)行排序，對(duì)排名前10 的通路進(jìn)行核心富集基因分析。結(jié)果顯示，與JuA 治療AD 相關(guān)性最高的通路是催乳素信號(hào)通路、青少年成熟期糖尿病、脂肪消化吸收、2 型糖尿病、細(xì)胞黏附因子、IL-17 信號(hào)通路、TGF-β 信號(hào)通路等。脂肪與糖代謝的紊亂、炎癥免疫反應(yīng)等正是AD 發(fā)生發(fā)展的危險(xiǎn)因素[6]，JuA 可通過(guò)干預(yù)這些危險(xiǎn)因素防治AD。在這些信號(hào)通路中Gck 基因高頻出現(xiàn)（表4），JuA 逆轉(zhuǎn)了模型組Gck 的降低，使其表達(dá)明顯升高（表3），提示上調(diào)Gck 活性維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)，可能是JuA 發(fā)揮抗AD 作用的重要機(jī)制之一。

表4 共同調(diào)節(jié)的通路與核心富集基因Table 4 Co-regulated pathways and core enrichment genes

3.6 JuA 上調(diào)APP/PS1 小鼠腦內(nèi)Gck 基因與蛋白的表達(dá)

為進(jìn)一步驗(yàn)證上述篩選結(jié)果，采用qRT-PCR 與Western blotting 對(duì)小鼠腦內(nèi)Gck基因與蛋白表達(dá)水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。如圖7 所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠腦內(nèi)GckmRNA 和蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，JuA 高劑量組GckmRNA 和蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05），與RNA-Seq 分析結(jié)果一致，說(shuō)明JuA 治療AD 的機(jī)制與上調(diào)Gck基因與蛋白的表達(dá)有關(guān)。

圖7 JuA 對(duì)AD 小鼠腦組織Gck mRNA 和蛋白表達(dá)的影響 (±s, n = 3)Fig. 7 Effect of JuA on Gck mRNA and protein expressions in brain tissue of AD mice (±s, n = 3)

4 討論

本實(shí)驗(yàn)采用的APP/PS-1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠，表達(dá)嵌合的APP 和PS-1，能很好地模擬人類AD 腦內(nèi)的病理變化，已被廣泛應(yīng)用于AD、淀粉樣斑塊形成等相關(guān)疾病的研究[20-21]。水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果表明，7 月齡APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)與記憶能力已明顯低于對(duì)照組，而JuA 能劑量相關(guān)性提高小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其高劑量組作用最佳，與陽(yáng)性對(duì)照藥多奈哌齊相當(dāng)。HE、Nissl 染色結(jié)果顯示，模型小鼠海馬與皮層神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少、形態(tài)不規(guī)則，核皺縮明顯，尼氏體數(shù)量減少，說(shuō)明神經(jīng)元已明顯受損；而經(jīng)JuA 治療后神經(jīng)元與尼氏體數(shù)量明顯增加，細(xì)胞層次較為清晰，胞質(zhì)豐富，核固縮減輕，說(shuō)明JuA 明顯減輕了AD 小鼠腦組織的病理?yè)p傷。以上結(jié)果說(shuō)明JuA能有效保護(hù)腦組織，顯著改善AD小鼠認(rèn)知功能的障礙。

為了進(jìn)一步探討JuA 干預(yù)AD 的分子機(jī)制，治療結(jié)束后分別取對(duì)照組、模型組和JuA 高劑量組小鼠的海馬組織進(jìn)行RNA-Seq 分析。RNA-Seq 是近年發(fā)展起來(lái)的新一代高通量基因測(cè)序技術(shù)，能全面快速地獲得目標(biāo)組織或器官所有轉(zhuǎn)錄本序列信息，從整體水平研究基因功能及結(jié)構(gòu)，揭示特定的生物學(xué)過(guò)程以及疾病發(fā)生過(guò)程中的分子機(jī)制[18-19]。本研究測(cè)序分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組中共有341 個(gè)差異表達(dá)基因；與模型組比較，JuA 高劑量組有94 個(gè)差異基因，模型組的部分差異基因在JuA 干預(yù)后表達(dá)趨勢(shì)被逆轉(zhuǎn)，說(shuō)明JuA 可通過(guò)調(diào)控這些基因的表達(dá)治療AD。為明確AD 病變及JuA治療后所涉及基因的生物學(xué)功能變化，對(duì)模型組篩選出的341 個(gè)差異基因和JuA 高劑量組的94 個(gè)差異基因進(jìn)行GO 富集分析，結(jié)果顯示，模型組差異基因的功能主要集中在細(xì)胞分泌調(diào)節(jié)、離子通道、肽激素結(jié)合與受體活性等；而JuA 治療組的差異基因功能主要富集在離子轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞骨架與胞質(zhì)膜、核受體活性等方面。對(duì)上述差異基因進(jìn)行KEGG 信號(hào)通路富集分析，結(jié)果顯示，模型組涉及到鈣離子信號(hào)通路、cAMP 信號(hào)通路、2 型糖尿病等；而JuA組涉及2 型糖尿病、脂肪消化吸收、細(xì)胞黏附因子、IL-17 和TGF-β 信號(hào)通路等，說(shuō)明JuA 抗AD 的作用可能與調(diào)控代謝紊亂和炎癥反應(yīng)有關(guān)。

AD 的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，其發(fā)生發(fā)展通常與慢性炎癥相關(guān)疾病如動(dòng)脈粥樣硬化、肥胖/代謝綜合征和2 型糖尿病等有關(guān)，這些疾病的產(chǎn)生是建立在衰老過(guò)程中促炎細(xì)胞被激活引起的全身慢性炎癥基礎(chǔ)之上[6]。炎癥反應(yīng)的激活可導(dǎo)致血腦屏障通透性增加，小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，觸發(fā)淀粉樣蛋白斑塊和神經(jīng)原纖維纏結(jié)的形成，從而導(dǎo)致突觸喪失和神經(jīng)退行性病變[6,22-23]。目前關(guān)于血清各炎癥因子與AD 發(fā)病之間的關(guān)系尚未十分明確，但已有研究報(bào)道，多種促炎因子如IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-17、腫瘤壞死因子-α 等與抗炎因子IL-4、IL-10、IL-37 和TGF-β1 等的表達(dá)失衡導(dǎo)致的慢性炎癥，是引起AD 的重要因素[6]。細(xì)胞黏附分子L1 是表達(dá)于神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)膜上的跨膜蛋白，參與神經(jīng)元之間的相互識(shí)別和連接，在AD 海馬組織中能有效促進(jìn)Aβ 斑塊的清除[24]。TGF-β 超家族具有神經(jīng)保護(hù)功能，可從多方面拮抗AD 病理改變，如TGF-β1 能促進(jìn)Aβ 的清除、改善Tau 病理、調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)發(fā)生和突觸可塑性等，從而改善AD 認(rèn)知功能[25]。

本研究以模型組vs對(duì)照組、JuA 高劑量組vs模型組共同調(diào)節(jié)的信號(hào)通路進(jìn)行比對(duì)分析，共篩選出88 條通路，對(duì)排名前10 的通路進(jìn)行核心富集基因分析，結(jié)果顯示，與JuA 治療AD 相關(guān)性最高的通路是青少年成熟期糖尿病、脂肪消化吸收、2 型糖尿病、細(xì)胞黏附因子、IL-17 信號(hào)通路和TGF-β 信號(hào)通路，說(shuō)明JuA 可通過(guò)調(diào)控代謝紊亂和炎癥反應(yīng)減輕AD 病理?yè)p傷，抑制AD 的發(fā)生發(fā)展。

糖尿病是促進(jìn)AD 發(fā)生發(fā)展的危險(xiǎn)因素之一。糖尿病患者腦葡萄糖代謝異常、胰島素抵抗、晚期糖基化終末產(chǎn)物和炎性小體等加劇了腦內(nèi)免疫炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷，促進(jìn)了淀粉樣斑塊和神經(jīng)原纖維纏結(jié)的形成，從而加重了AD 的病理?yè)p傷[26-27]；鑒于糖尿病與AD 之間的聯(lián)系和目前缺乏有效治療AD 的藥物，越來(lái)越多的研究集中于用抗糖尿病藥物控制或逆轉(zhuǎn)AD[28]，其中新型降糖藥Gck 激動(dòng)劑的研發(fā)起了廣泛注意。Gck 是葡萄糖代謝過(guò)程中第1 個(gè)限速酶，能靈敏識(shí)別葡萄糖水平改變，適時(shí)調(diào)控胰島素及胰高血糖素分泌并促進(jìn)葡萄糖磷酸化，從而保持葡萄糖的穩(wěn)態(tài)，故Gck 激動(dòng)劑有望成為全新抗2 型糖尿病藥物，并對(duì)AD 的防治帶來(lái)新的希望[29-30]。本研究差異基因分析結(jié)果顯示，JuA 干預(yù)了AD 小鼠腦內(nèi)Gck、Irak3和Msln等基因，其中Gck在模型組小鼠腦內(nèi)顯著降低，而JuA治療后Gck表達(dá)明顯升高，說(shuō)明Gck 可能是JuA 治療AD 的重要靶點(diǎn)之一；在與JuA 治療AD 相關(guān)性最高的前10條通路中，Gck 基因高頻出現(xiàn)，說(shuō)明上調(diào)葡萄糖激酶活性維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)可能是JuA 發(fā)揮抗AD 作用的機(jī)制之一；經(jīng)qRT-PCR 與Western blotting 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，表明JuA 組GckmRNA 與蛋白表達(dá)均顯著高于模型組，結(jié)果與RNA-Seq 分析一致。其他差異基因未在這些通路中高頻出現(xiàn)，且與AD 的相關(guān)性目前尚不十分清楚，故有待于下一步進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上，JuA 能明顯減輕AD 小鼠腦組織病理?yè)p傷，提高小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力，其作用機(jī)制可能與調(diào)控炎癥反應(yīng)與代謝紊亂有關(guān)，其中上調(diào)GckmRNA 與蛋白表達(dá)，維持血糖平衡可能是JuA 治療AD 的重要機(jī)制之一。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突