海風藤化學成分及神經(jīng)保護活性研究

徐瑞雯，范雨欣，朱 瑩，張曉，薛貴民，曾夢楠,2，鄭曉珂,2，馮衛(wèi)生,2，陳 輝,2*

1. 河南中醫(yī)藥大學藥學院，河南 鄭州 450046

2. 呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450046

海風藤為胡椒科胡椒屬植物風藤Piperkadsura(Choisy) Ohwi 的干燥藤莖，主產(chǎn)于浙江、福建、海南、廣東、臺灣等地。海風藤味辛、苦，性微溫，歸肝經(jīng)，具有祛風濕，通經(jīng)絡，止痹病等功效[1-2]?；瘜W成分研究表明海風藤含有木脂素、生物堿、揮發(fā)油、黃酮類、環(huán)氧化合物、甾體等成分，其中新木脂素和酰胺生物堿是其主要的化學成分[3-4]。現(xiàn)代藥理研究表明海風藤具有抗炎、抗氧化、抑制血小板活化因子和神經(jīng)保護等作用，特別是在治療阿爾茨海默癥和器官缺血再灌注等方面具有顯著的藥用價值[4-6]。文獻研究表明海風藤水提物及醇提物可顯著提高Aβ 誘導的阿爾茨海默癥模型大鼠的學習記憶能力，有效改善其認知功能障礙[7-8]。但目前有關海風藤治療阿爾茨海默癥的研究多集中在總提取物或少量化合物。本課題組前期已對海風藤二氯甲烷部位的化學成分進行了初步研究[9-10]，為進一步揭示海風藤藥理活性的化學物質(zhì)基礎，本實驗綜合利用各種現(xiàn)代色譜和光譜技術，對海風藤二氯甲烷及醋酸乙酯提取物進行系統(tǒng)的化學成分研究，共分離鑒定了22 個化合物，分別為puberulin（1）、(?)-acuminatin（2）、dihydrocarinatin（3）、海風藤酮（kadsurenone，4）、山蒟素C（hancinone C，5）、3-羥基苯甲酸芐酯（3-hydroxybenzyl benzoate，6）、2-羥基苯甲酸芐酯（2-hydroxybenzyl benzoate，7）、cherrevenol D（8）、trans-2,3-diacetoxy-1-[(benzoy1oxy)methyl]-cyclohexa-4,6-diene（9）、(3R,4R)-4-O-acetyl-5-(benzoyloxymethyl)cyclohexa-1,5-diene-3,4-diol（10）、(?)-sootepoxide chlorohydrin A（11）、香草醛（vanillin，12）、細辛醛（asaronaldehyde，13）、β-細辛醚（β-asarone，14）、α-細辛醚（α-asarone，15）、胡椒內(nèi)酰胺D（piperolactam D，16）、焦谷氨酸甲酯（methyl pyroglutamate，17）、三羥基異黃酮（genistein，18）、去氫木香內(nèi)酯（dehydrocostus lactone，19）、木香內(nèi)酯（costuslactone，20）、spathulenol（21）、β-谷甾醇（β-sitosterol，22）。其中化合物3、6～8、19、20 為首次從胡椒屬植物中分離得到，化合物15、21 為首次從海風藤中分離得到；化合物4 的13C-NMR 波譜數(shù)據(jù)為首次報道。Aβ25-35誘導PC-12 細胞損傷的神經(jīng)保護作用研究顯示，化合物2、4、19、21 對Aβ25-35誘導PC-12 細胞損傷具有顯著保護作用，其半數(shù)效應濃度（median effective concentration，EC50）值分別為11.1、27.3、32.9、29.3 μmol/L。

1 儀器與材料

Bruker AVANCE III 500 型核磁共振儀、Bruker maxis HD 型飛行時間質(zhì)譜（德國Bruker 公司）；N-1000 型旋轉蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；SHB-B95A 型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；DFZ-3 型真空干燥箱（上海醫(yī)用恒溫設備廠）；Thermo Nicolet IS10 型紅外光譜儀（美國熱電公司）；LC52 型高壓制備液相色譜儀（賽譜銳思北京科技有限公司，SP-5030 型半制備型高壓輸液泵，UV200 型紫外檢測器，Easychrom 型色譜工作站；色譜柱為YMC-Pack ODS-A（250 mm×20 mm，5m）；Multiskan FC 型酶標儀（美國Thermo公司）；薄層色譜硅膠GF254、柱色譜硅膠（200～300 目，青島海洋化工廠）；Sephadex LH-20（Pharmacia Biotech 公司）；ODS（40～60m，YMC 公司）；甲醇，色譜純（天津市四友精細化學品有限公司）；其他試劑均為分析級；薄層色譜硅膠選用10～40m 的粒徑，以0.5% CMC-Na 制板，陰干，105 ℃活化0.5 h。實時無標記細胞動態(tài)分析儀（安捷倫生物）；Aβ25-35（生工生物工程上海股份有限公司）；白藜蘆醇（批號A10111，上海源葉生物科技有限公司）。

PC-12 細胞購于中國科學院上海細胞庫。海風藤于2018 年6 月采購于安徽亳州藥材市場，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學藥學院陳隨清教授鑒定為胡椒科胡椒屬植物風藤P.kadsura(Choisy) Ohwi 的干燥藤莖。憑證樣本（20180609I）存放于河南中醫(yī)藥大學中藥化學研究室。

2 方法

2.1 提取與分離

海風藤藥材粗粉（40 kg），二氯甲烷冷浸提取3次，每次24 h，繼續(xù)用醋酸乙酯冷浸提取3 次，提取液經(jīng)減壓濃縮，得到二氯甲烷部位浸膏600 g，醋酸乙酯部位浸膏450 g。二氯甲烷部位總浸膏進行硅膠柱色譜分離，依次用石油醚-丙酮（100∶0→0∶100）梯度洗脫，得到13 個組分（Fr. 1～13）。Fr. 3（76 g）進行硅膠柱色譜分離，依次用石油醚-丙酮（100∶0→0∶100）梯度洗脫，得到2 個流分（Fr.3a～3b）。Fr. 3b 經(jīng)ODS 柱色譜分離，依次用甲醇-水（30%～100%）梯度洗脫，得到7 個亞組分（Fr.3b-1～3b-7）。Fr. 3b-2（50%甲醇洗脫部位，38.6 g）經(jīng)制備型HPLC 制備（65%甲醇-水）得化合物12（10.0 mg，tR＝38.4 min）、13（22.6 mg，tR＝42.9 min）。Fr. 3b-3 經(jīng)制備型HPLC 制備（80%甲醇-水）得化合物21（5.0 mg，tR＝31.8 min）、11（2.0 mg，tR＝21.0 min）Fr. 6（32.5 g）經(jīng)ODS 柱色譜分離，依次用甲醇-水（30%～100%）梯度洗脫，得到7個亞組分（Fr. 6-1～6-7）。Fr.6-4（70%甲醇洗脫部位，11.4 g）經(jīng)制備型HPLC 制備（85%甲醇-水）得化合物1（4.0 mg，tR＝21.4 min）、8（5.7 mg，tR＝40.3 min）、9（10.3 mg，tR＝41.0 min）。Fr. 7（30.1 g）經(jīng)ODS 柱色譜分離，依次用甲醇-水（30%～100%）梯度洗脫，得到9 個亞組分（Fr. 7-1～7-9）。Fr. 7-3（70%甲醇洗脫部位，13.5 g）經(jīng)制備型HPLC制備（70%甲醇-水）制備得化合物10（2.5 mg，tR＝20.0 min）、2（9.5 mg，tR＝39.0 min）、3（3.5 mg，tR＝41.2 min）。Fr. 7-5 經(jīng)硅膠柱色譜分離，依次用石油醚-丙酮（100∶0→0∶100）梯度洗脫，經(jīng)制備型HPLC 制備（60%甲醇-水）得化合物4（20.0 mg，tR＝44.0 min）、5（3.4 mg，tR＝42.0 min）。

Fr. 8（38.8 g）經(jīng)MCI 柱色譜分離，依次用甲醇-水（30%～100%）梯度洗脫，得到9 個亞組分（Fr.8-1～8-9）。Fr. 8-5（60%甲醇洗脫部位，18.1 g）經(jīng)硅膠柱色譜分離，依次用石油醚：丙酮（50∶0→0∶100）梯度洗脫，得到7 個流分（Fr. 8-5a～8-5g）；Fr. 8-5e 經(jīng)制備型HPLC 制備（60%甲醇-水）得化合物6（12.0 mg，tR＝28.0 min）、7（2.0 mg，tR＝22.0 min）、19（2.6 mg，tR＝23.0 min）。

Fr. 10（31.0 g）經(jīng)硅膠柱色譜分離，依次用石油醚-丙酮（100∶0→0∶100）梯度洗脫，得到10個流分（Fr. 10-1～10-10）。Fr. 10-6（12.5 g）經(jīng)MCI柱色譜分離，依次用甲醇-水（30%～100%）梯度洗脫，得到5 個亞組分（Fr. 10-6a～10-6e）。Fr. 10-6a（30%甲醇洗脫部位，4.8 g）經(jīng)硅膠柱色譜分離，依次用石油醚-丙酮（50∶0→0∶100）梯度洗脫，經(jīng)制備型HPLC 制備（70%甲醇-水）得化合物18（6.0 mg，tR＝27.0 min）、17（7.5 mg，tR＝46.0 min）、16（20.0 mg，tR＝57.0 min）。

醋酸乙酯部位總浸膏（450 g）經(jīng)硅膠柱色譜分離，依次用石油醚-丙酮系統(tǒng)（50∶1→0∶100）梯度洗脫，得到8 個流分（Fr. A～H）。Fr. G（45.0 g）經(jīng)硅膠柱色譜分離，依次用石油醚：丙酮（50∶0→0∶100）梯度洗脫，得到6 個組分（Fr. G-1～G-6）。Fr. G-3 經(jīng)凝膠柱色譜分離得到6 個流分（Fr.G-3-1～G-3-6），F(xiàn)r. G-3-3 經(jīng)制備型HPLC 制備（30%甲醇-水）得化合物22（10.2 mg，tR＝30.0 min）。Fr.G-3-2 半制備型HPLC 制備（28%甲醇-水）得化合物20（2.0 mg，tR＝9.0 min）、14（2.6 mg，tR＝48.0 min）、15（2.3 mg，tR＝36.3 min）。

2.2 細胞培養(yǎng)

PC-12 細胞用含10%FBS 的1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)，放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細胞生長狀況，待細胞長至布皿80%時進行消化傳代。每48 小時更換新鮮培養(yǎng)基，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

2.3 MTT 法檢測化合物對Aβ25-35 誘導PC-12 細胞的保護作用

取生長狀態(tài)良好，融合度為90%的PC-12 細胞，以2×104個/mL 接種于96 孔板中。培養(yǎng)24 h 后分為對照組、模型組（20 μmol/L Aβ25-35）、陽性藥組（20 μmol/L Aβ25-35＋10 μmol/L 白藜蘆醇）和各給藥組（20 μmol/L Aβ25-35＋10 μmol/L 待測化合物），培養(yǎng)24 h 后，每孔加入MTT 溶液（5 mg/mL）20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸凈培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min 使其完全溶解。酶標儀490 nm測定各孔吸光度（A）值。

2.4 實時無標記動態(tài)細胞分析技術（realtime cellular analysis，RTCA）檢測化合物的EC50 值

取生長狀態(tài)良好，融合度為90%的PC-12 細胞，以1×104個/mL，每孔200 μL 接種于16 孔板中。24 h 后分為對照組、模型組（20 μmol/L Aβ25-35）和不同濃度給藥組（0.01、0.1、1、10、50、100 μmol/L待測化合物），繼續(xù)培養(yǎng)72 h。細胞實時分析系統(tǒng)檢測細胞活力，計算各化合物的EC50值[11]。

3 結構鑒定

化合物1：無色油狀物，易溶于氯仿。ESI-MSm/z: 407 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ:6.89 (2H, d,J= 12.0 Hz, H-5′, 6′), 6.73 (2H, s, H-2,2′), 5.96 (2H, s, OCH2O), 5.85 (1H, ddd,J= 13.5, 6.5,1.0 Hz, H-10), 5.32 (1H, s, H-8), 5.16 (2H, dd,J=13.5, 1.0 Hz, H-11), 3.38 (3H, s, 1-OCH3), 3.05 (2H,d,J= 6.5 Hz, H-9), 2.98 (1H, s, H-5), 2.72 (1H, dt,J=8.5, 7.0 Hz, H-7), 2.42 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-6), 2.21(3H, s, 8-OAc), 1.02 (3H, d,J= 7.0 Hz, 7-CH3)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δ: 197.5 (C-4), 169.2(8-OAc), 148.8 (C-3′, 4′), 146.4 (C-2), 140.0 (C-1′),135.1 (C-3), 134.3 (C-10), 121.5 (C-6′), 117.6 (C-11),108.3 (C-5′), 108.1 (C-2′), 101.0 (OCH2O), 88.4(C-1), 75.1 (C-8), 60.7 (C-5), 54.0 (1-OCH3), 51.5(C-6), 46.6 (C-7), 32.4 (C-9), 21.2 (8-OAc), 13.1(7-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[12]，故鑒定化合物1 為puberulin。

化合物4：無色油狀物，易溶于氯仿。ESI-MSm/z: 379 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ:7.03 (1H, d,J= 1.7 Hz, H-2), 6.88 (2H, overlapped,H-5, 6), 6.22 (1H, d,J= 1.3 Hz, H-6′), 5.90 (1H, s,H-3′), 5.85 (1H, m, H-8′), 5.24 (1H, s, H-7), 5.13 (2H,m, H-9′), 3.91 (6H, s, 3, 4-OCH3), 3.14 (2H, m, H-7′),3.05 (3H, s, 5′-OCH3), 2.71 (1H, m, H-8), 1.14 (3H, d,J= 7.0 Hz, H-9)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3) 顯示了21 個碳信號，結合1H-NMR、HMBC 及HSQC首次歸屬了碳譜數(shù)據(jù)，結果如下：δ: 187.3 (C-2′),173.1 (C-4′), 148.8 (C-5), 148.6 (C-4), 142.7 (C-1′),135.1 (C-8′), 132.7 (C-6′), 132.0 (C-1), 118.2 (C-9′),117.2 (C-2), 110.7 (C-3), 109.0 (C-6), 104.7 (C-3′),94.7 (C-7), 81.2 (C-5′), 55.9 (3, 4-OCH3), 50.5(5′-OCH3), 46.8 (C-8), 33.3 (C-7′), 16.2 (C-9)。其理化性質(zhì)及1H-NMR 波譜數(shù)據(jù)與文獻報道一致[15]，故鑒定化合物4 為海風藤酮。

化合物5：白色結晶（氯仿）。ESI-MSm/z: 411[M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ: 6.98 (1H,s, H-7), 6.51 (1H, s, H-2), 6.51 (1H, s, H-5), 6.17 (1H,s, H-6′), 5.89 (1H, m, H-8′), 5.85 (1H, s, H-3′), 5.12(2H, t,J= 15.6 Hz, H-9′), 3.86 (9H, s, 3, 4, 5-OCH3),3.80 (3H, s, 4′-OCH3), 3.28 (3H, s, 5′-OCH3), 3.16(2H, m, H-7′), 1.70 (3H, d,J= 1.1 Hz, H-9)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δ: 187.6 (C-2′), 173.4(C-4′), 152.8 (C-5), 141.9 (C-3, 1′), 139.5 (C-4), 136.7(C-1, 6′), 133.4 (C-7, 8′), 127.3 (C-8), 115.9 (C-9′),106.2 (C-6, 3′), 104.9 (C-2), 79.7 (C-5′),59.7(4′-OCH3), 55.4 (3, 4, 5-OCH3), 51.4 (5′-OCH3), 32.4(C-7′), 12.9 (C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[15]，故鑒定化合物5 為山蒟素C。

化合物6：淡黃色油狀物，易溶于氯仿。ESI-MSm/z: 251 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ:8.11 (2H, d,J= 7.8 Hz, H-2′, 6′), 7.59 (1H, t,J= 7.3 Hz, H-4′), 7.47 (2H, t,J= 7.7 Hz, H-3′, 5′), 7.28 (1H,overlapped, H-5), 7.03 (1H, d,J= 7.5 Hz, H-6), 6.96(1H, s, H-2), 6.84 (1H, dd,J= 8.1, 2.5 Hz, H-4), 5.35(2H, s, H-7)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δ: 166.5(C-7′), 155.8 (C-3), 137.7 (C-1), 133.1 (C-4′), 130.0(C-5), 129.9 (C-1′), 129.7 (C-2′, 6′), 128.4 (C-3′, 5′),120.2 (C-6), 115.2 (C-2), 114.9 (C-4), 66.3 (C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[16]，故鑒定化合物6 為3-羥基苯甲酸芐酯。

化合物7：淡黃色油狀物，易溶于氯仿。ESI-MSm/z: 251 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ:8.09 (2H, d,J= 7.6 Hz, H-2′, 6′), 7.59 (1H, t,J= 7.4 Hz, H-4′), 7.46 (2H, t,J= 7.4 Hz, H-3′, 5′), 7.39 (1H,d,J= 7.4 Hz, H-6), 7.32 (1H, t,J= 7.7 Hz, H-4), 7.00(1H, d,J= 8.0 Hz, H-3), 6.95 (1H, t,J= 7.4 Hz, H-5),5.40 (2H, s, H-7)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δ:168.7 (C-7′), 155.7 (C-2), 133.7 (C-4′), 132.2 (C-6),131.1 (C-4), 130.0 (C-2′, 6′), 129.2 (C-1), 128.5 (C-3′,5′), 121.7.(C-1′), 120.6 (C-5), 117.6 (C-3), 63.8 (C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[17]，故鑒定化合物7 為2-羥基苯甲酸芐酯。

化合物8：淡黃色油狀物，易溶于氯仿。ESI-MSm/z: 311 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ:8.08 (2H, dd,J= 8.0, 1.3 Hz, H-2′, 6′), 7.58 (1H, t,J=8.0 Hz, H-4′), 7.47 (2H, t,J= 8.0 Hz, H-3′, 5′), 6.12(1H, d,J= 5.6 Hz, H-6), 6.08 (1H, dd,J= 9.4, 5.6 Hz,H-5), 5.88 (1H, dd,J= 9.4, 3.9 Hz, H-4), 5.54 (1H,dd,J= 7.6, 3.9 Hz, H-3), 5.09 (1H, d,J= 13.4 Hz,H-7a), 4.98 (1H, d,J= 13.4 Hz, H-7b), 4.55 (1H, d,J= 7.6 Hz, H-2), 2.09 (3H, s, H-2′′)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δ: 171.1 (C-1′′), 166.4 (C-7′), 135.1(C-1), 133.2 (C-4′), 129.7 (C-2′, 6′), 129.7 (C-1′),128.5 (C-3′, 5′), 125.5 (C-5), 125.1 (C-6), 122.8 (C-4),75.1 (C-3), 70.2 (C-2), 64.7 (C-7), 21.3 (C-2′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[18]，故鑒定化合物 8 為cherrevenol D。

化合物12：無色油狀物，易溶于氯仿。ESI-MSm/z: 175 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ:9.85 (1H, s, H-7), 7.45 (1H, dd,J= 8.5, 1.5 Hz, H-6),7.44 (1H, d,J= 1.5 Hz, H-2), 7.07 (1H, d,J= 8.5 Hz,H-5), 3.99 (3H, s, 3-OCH3)；13C-NMR (125 MHz,CDCl3)δ: 190.9 (C-7), 151.7 (C-4), 147.1 (C-3), 129.8(C-1), 127.5 (C-6), 114.4 (C-5), 108.7 (C-2), 56.1(3-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[21]，故鑒定化合物12 為香草醛。

化合物13：白色粉末，易溶于氯仿。ESI-MSm/z:219 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ: 10.34(1H, s, H-7), 7.35 (1H, s, H-6), 6.51 (1H, s, H-3), 3.97(3H, s, 8-OCH3), 3.96 (3H, s, 9-OCH3), 3.88 (3H, s,10-OCH3)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δ: 188.0(C-7), 158.7 (C-4), 156.8 (C-5), 143.5 (C-2), 117.4(C-1), 109.0 (C-6), 96.0 (C-3), 56.3 (10-OCH3),56.2 (8-OCH3), 56.2 (9-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[22]，故鑒定化合物13 為細辛醛。

化合物14：黃色油狀物，易溶于氯仿。ESI-MSm/z: 231 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ:6.72 (1H, s, H-2), 6.56 (1H, s, H-5), 5.99 (1H, ddt,J=16.8, 10.4, 6.4 Hz, H-2′), 5.04 (2H, m, H-3′), 3.90(3H, s, 4-OCH3), 3.85 (3H, s, 3-OCH3), 3.83 (3H, s,6-OCH3), 3.35 (2H, d,J= 6.4 Hz, H-1′)；13C-NMR(125 MHz, CDCl3)δ: 151.4 (C-2), 147.9 (C-4), 143.0(C-3), 137.3 (C-2′), 120.1 (C-1), 114.0 (C-2), 98.1(C-5), 115.2 (C-3′), 56.6 (6-OCH3), 56.6 (4-OCH3),56.3 (3-OCH3), 33.7 (C-1′)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[23]，故鑒定化合物14 為β-細辛醚。

化合物15：白色粉末，易溶于氯仿。ESI-MSm/z:231 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ: 6.96(1H, s, H-2), 6.67 (1H, dd,J= 15.8, 1.6 Hz, H-1′),6.51 (1H, s, H-5), 6.12 (1H, dq,J= 15.8, 6.6 Hz,H-2′), 3.83 (3H, s, 6-OCH3), 3.79 (3H, s, 3-OCH3),3.77 (3H, s, 4-OCH3), 1.91 (3H, d,J= 6.6 Hz, H-3′)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δ: 150.7 (C-6), 148.7(C-4), 143.4 (C-3), 125.1 (C-1′), 124.4 (C-2′), 119.0(C-1), 109.8 (C-2), 98.0 (C-5), 56,7 (6-OCH3), 56.3(4-OCH3), 56.1 (3-OCH3), 18.8 (C-3′)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[23]，故鑒定化合物15 為α-細辛醚。

化合物16：黃色晶體（甲醇）。ESI-MSm/z: 318[M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CD3OD)δ: 9.36 (1H,m, H-5), 7.85 (1H, m, H-8), 7.48 (2H, m, H-6), 7.23(1H, s, H-9), 4.42 (3H, s, 4-OCH3), 3.95 (3H, s,3-OCH3)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD)δ: 168.3(C-11), 153.1 (C-2, 4), 139.5 (C-3), 134.1 (C-10),133.2 (C-9a), 128.1 (C-8), 127.1 (C-5), 126.9 (C-5a),126.2 (C-4a), 125.5 (C-6), 124.8 (C-7), 111.7 (C-10a),105.9 (C-1, 9), 61.6 (4-OCH3), 60.6 (3-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[24]，故鑒定化合物16 為胡椒內(nèi)酰胺D。

化合物17：無色晶體（甲醇）。ESI-MSm/z:144[M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CD3OD)δ: 4.29 (1H,dd,J= 9.0, 4.4 Hz, H-5), 3.75 (3H, s, H-1′), 2.47 (1H,m, H-4), 2.33 (2H, m, H-3), 2.15 (1H, m, H-4)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD)δ: 181.1 (C-2), 174.5(C-6), 57.1 (C-5), 52.9 (C-1′), 30.3 (C-3), 25.3 (C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[25]，故鑒定化合物17 為焦谷氨酸甲酯。

化合物18：黃色粉末，易溶于甲醇。ESI-MSm/z:293 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ: 8.04(1H, s, H-2), 7.37 (2H, d,J= 8.3 Hz, H-2′, 6′), 6.84(2H, t,J= 8.3 Hz, H-3′, 5′), 6.32 (1H, d,J= 2.0 Hz,H-8), 6.21 (1H, t,J= 2.0 Hz, H-6)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δ: 180.8 (C-4), 165.2 (C-7), 162.2(C-5), 158.4 (C-4′), 157.4 (C-9), 153.3 (C-2), 130.0(C-2′, 6′), 122.0 (C-3), 123.3 (C-1′), 114.9 (C-3′, 5′),104.7 (C-10), 99.0 (C-6), 93.5 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[26]，故鑒定化合物18 為三羥基異黃酮。

化合物19：黃色油狀物，易溶于氯仿。ESI-MSm/z: 255 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ:6.23 (1H, d,J= 3.4 Hz, H-13a), 5.51 (1H, d,J= 2.9 Hz, H-13b), 5.29 (1H, brs, H-15a), 5.09 (1H, brs,H-15b), 4.92 (1H, brs, H-14a), 4.84 (1H, brs, H-14b),3.98 (1H, t,J= 9.3 Hz, H-6), 2.94 (1H, overlapped,H-1), 2.90 (1H, overlapped, H-7), 2.88 (1H,overlapped, H-5), 2.53(1H, m, H-3b), 2.50 (1H,overlapped, H-9a), 2.50 (1H, overlapped, H-9b), 2.26(1H, m, H-8a), 2.18 (1H, m, H-8b), 2.23 (1H, m,H-3a), 1.97 (1H, m, H-2a), 1.89 (1H, m, H-2b)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δ: 170.0 (C-12), 151.2(C-4), 149.2 (C-10), 139.8 (C-11), 120.2 (C-13), 112.6(C-14), 109.6 (C-15), 85.2 (C-6), 52.0 (C-5), 47.7(C-1), 45.1 (C-7), 36.3 (C-9), 32.6 (C-3), 30.9 (C-8),30.3 (C-2)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[27]，故鑒定化合物19 為去氫木香內(nèi)酯。

化合物20：黃色油狀物，易溶于氯仿。ESI-MSm/z: 255 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ:6.25 (1H, d,J= 3.4 Hz, H-13b), 5.50 (1H, d,J= 3.0 Hz, H-13a), 4.83 (1H, d,J= 10.5 Hz, H-1), 4.72 (1H,d,J= 9.7 Hz, H-5), 4.55 (1H, t,J= 9.3 Hz, H-6), 2.55(1H, t,J= 9.3 Hz, H-7), 2.44 (1H, overlapped, H-9a),2.43 (1H, m, H-3b), 2.43 (1H, overlapped, H-9b), 2.31(1H, m, H-8a) , 2.29 (1H, m, H-3a), 2.27 (1H, m,H-8b), 2.02 (1H, m, H-2a), 1.99 (1H, m, H-2b), 1.66(3H, s, H-15), 1.40 (3H, s, H-14)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δ: 170.4 (C-12), 141.4 (C-11), 140.1(C-4), 136.6 (C-10), 127.1 (C-5), 127.0 (C-1), 119.6(C-13), 81.9 (C-6), 50.4 (C-5), 41.3 (C-3), 39.5 (C-9),28.0 (C-2), 26.2 (C-8), 17.3 (C-15), 16.1 (C-14)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[28]，故鑒定化合物20 為木香內(nèi)酯。

化合物21：無色油狀物，易溶于氯仿。ESI-MSm/z: 243 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ:4.70 (2H, d,J= 13.1 Hz, H-15), 2.44 (1H, dd,J=13.1, 6.1 Hz, H-1), 2.23 (1H, m, H-9a), 2.07 (1H, m,H-9b), 2.00 (1H, m, H-3a), 1.92 (1H, m, H-3b), 1.79(1H, m, H-5), 1.66 (1H, m, H-2a), 1.56 (1H, m, H-8a),1.55 (1H, m, H-2b), 1.34 (1H, m, H-8b), 1.30 (3H, s,H-14), 1.01 (3H, s, H-13), 0.99 (3H, s, H-12), 0.73(1H, m, H-7), 0.49 (1H, dd,J= 11.2, 9.5 Hz, H-6)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δ: 153.4 (C-10), 106.3(C-15), 81.0 (C-4), 54.3 (C-5), 53.4 (C-1), 41.7 (C-3),38.9 (C-9), 30.0 (C-6), 27.5 (C-7), 26.7 (C-2), 26.1(C-14), 24.8 (C-8), 20.2 (C-12), 16.3 (C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[29]，故鑒定化合物21 為spathulenol。

化合物22：白色粉末，易溶于氯仿。ESI-MSm/z:437 [M＋Na]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ: 5.36(1H, m, H-6), 3.54 (3H, m, H-3), 2.29 (2H, m, H-4),2.02 (1H, m, H-8), 1.87 (1H, overlapped, H-1a), 1.86(1H, overlapped, H-2a), 1.86 (1H, overlapped, H-7a),1.60 (1H, overlapped, H-7b), 1.60 (1H, overlapped,H-2b), 1.12 (1H, overlapped, H-1b), 0.93 (3H, s,H-19), 0.83 (3H, d,J= 6.5 Hz, H-21), 0.76 (3H, t,J=7.5 Hz, H-29), 0.75 (3H, d,J= 6.8 Hz, H-26), 0.73(3H, d,J= 7.0 Hz, H-27), 0.60 (3H, s, H-18)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δ: 140.9 (C-5), 121.9(C-6), 72.0 (C-3), 56.9 (C-14, 17), 50.3 (C-9), 46.3(C-24), 42.5 (C-13, 4), 40.0 (C-12), 37.4 (C-1), 36.7(C-10), 36.5 (C-20), 34.5 (C-28), 32.1 (C-8), 31.8(C-2, 7), 29.5 (C-25), 28.9 (C-16), 26.3 (C-22), 24.5(C-15), 23.2 (C-23), 21.2 (C-11), 20.2 (C-27), 20.0(C-21), 19.8 (C-19), 19.5 (C-26), 19.2 (C-29), 12.1(C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[21]，故鑒定化合物22 為β-谷甾醇。

4 對Aβ25-35 誘導PC-12 細胞損傷的保護作用

體外建立Aβ25-35誘導PC-12 細胞損傷模型，對海風藤中分離鑒定的部分新木脂素類化合物（1～4）和倍半萜類化合物（19、21）進行活性篩選。結果顯示，在10 μmol/L 濃度下，與對照組相比，化合物2、4、19、21 可顯著提高PC-12 細胞活力（P＜0.05、0.01，圖1），其EC50值分別為11.1、27.3、32.9、29.3 μmol/L，陽性對照藥白藜蘆醇的EC50值為14.3 μmol/L。

5 討論

本實驗從海風藤二氯甲烷和醋酸乙酯提取物中分離鑒定了22 個化合物，其中化合物1～5 為新木脂素類化合物，化合物6～15 為芳香酯、芳香醛及簡單苯丙素類化合物，化合物16、17 為酰胺生物堿類化合物，化合物18 為異黃酮類化合物，化合物19～22 為倍半萜及甾體類化合物。其中，化合物3、6～8、19～20 為首次從胡椒屬中分離得到，化合物15、21 為首次從海風藤中分離得到。其中化合物4 的13C-NMR 波譜數(shù)據(jù)為首次報道。體外神經(jīng)保護活性結果表明新木脂素類化合物（2、4）和倍半萜類化合物（19、21）對Aβ25-35誘導PC-12 細胞損傷具有顯著保護作用。本研究不僅進一步豐富了海風藤中化學成分的結構多樣性，而且對海風藤在治療和預防阿爾茨海默癥等神經(jīng)退行性疾病方面的研究具有一定的參考價值。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突