SSH技術(shù)在絲狀真菌功能基因篩選中的應用

張蕾蕾　余永濤　何生虎　葛松

摘要：抑制性消減雜交（SSH）技術(shù)是基于抑制性PCR和消減雜交技術(shù)發(fā)展起來的一種高效分離差異表達基因的方法。因其具有特異性高、假陽性率低、背景低、快速高效等特點，已廣泛應用于絲狀內(nèi)生真菌功能基因篩選中。主要對抑制性消減雜交技術(shù)的原理、技術(shù)流程、特點及其在絲狀真菌生長發(fā)育、代謝活性物質(zhì)及致病基因等方面的應用作簡要綜述。

關(guān)鍵詞：抑制性消減雜交（SSH）技術(shù)；差異基因；絲狀真菌；篩選

中圖分類號：Q949.32；Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）03-0500-05

近年來隨著分子生物學的不斷發(fā)展，差異表達基因已逐漸成為功能基因組學研究的熱點，分離、克隆、敲除某些具有特定功能的差異表達基因可為進一步揭示生物性狀的調(diào)控機制奠定基礎。目前，用于差異表達基因研究的技術(shù)主要有差異顯示PCR （Differential display PCR，DDRT-PCR）、代表性差異分析PCR（Representational difference analysis PCR，RDA-PCR）、抑制性消減雜交（Suppression subtractive hybridization，SSH）技術(shù)、互補脫氧核糖核酸擴增片段長度多態(tài)性技術(shù)（DNA amplified fragment length polymorphism，cDNA-AFLP）、cDNA微陣列（cDNA microarray）技術(shù)、限制性酶切片段差異顯示（Restriction fragment differential display PCR，RFDD-PCR）。其中SSH技術(shù)是一種以抑制性PCR反應為基礎，將標準化測試cDNA單鏈步驟和消減雜交步驟合為一體的高效分離差異表達基因技術(shù)。該技術(shù)具有操作簡便、特異性高、假陽性率低、靈敏度高、重復性好、周期性短、背景低、一次可同時分離上百個差異基因等優(yōu)點，因其獨特的優(yōu)越性而被廣泛應用于差異表達基因的研究中。絲狀真菌是傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)中抗生素、酶制劑和有機酸的主要生產(chǎn)者，在自然界中扮演著各種復雜有機物分解者的角色，也是植物和動物疾病的主要病原微生物，研究與絲狀真菌物質(zhì)代謝、合成、致病相關(guān)的差異表達基因，可為進一步篩選絲狀真菌的功能基因，并闡明其在各種生物過程中的調(diào)控機制提供理論依據(jù)。近年來，SSH技術(shù)憑借其獨特的優(yōu)越性，被廣泛應用于絲狀真菌物質(zhì)代謝、合成、生長發(fā)育及致病相關(guān)基因等的研究中。本文主要對SSH技術(shù)在絲狀真菌差異表達基因的研究和應用進行綜述。

1 SSH技術(shù)

1.1 SSH技術(shù)的原理

SSH技術(shù)是由Diatcheuko等[1]發(fā)現(xiàn)的一種比較和分離不同細胞系、不同組織間或同一細胞系、同一組織間在不同條件下的差異表達基因的技術(shù)。SSH以抑制性PCR技術(shù)為基礎，并與均一化和消減雜交技術(shù)相結(jié)合，在非目的雙鏈DNA片段兩端連接相同的接頭，使其具有反向末端重復序列，從而抑制非目的片段的擴增，以達到選擇性擴增目的片段的目的。均一化可保證低豐度差異表達基因不被丟失，而高豐度差異表達基因又不被過量分離。消減雜交則可以消除試驗組（Tester）與對照組（Driver）的同源序列，形成一種e型分子（e型分子的兩個5′端有兩個不同的接頭），從而確保差異表達基因片段進行指數(shù)擴增。

1.2 SSH技術(shù)的基本步驟

SSH技術(shù)主要包括cDNA合成與酶切、接頭連接、兩輪消減雜交和兩輪選擇性PCR擴增等步驟。首先分別提取試驗組和對照組總RNA、純化mRNA，反轉(zhuǎn)錄mRNA合成雙鏈cDNA。用Rsa Ⅰ等內(nèi)切酶分別將兩組cDNA酶切，使其變?yōu)槠骄L度為600 bp左右的平末端雙鏈cDNA片段。然后將酶切后的試驗組cDNA分為兩份，一份與接頭1連接，另一份與接頭2連接。再分別向連接不同接頭的試驗組cDNA中加入過量的對照組cDNA，進行第一輪消減雜交，雜交完畢后形成a、b、c、d 4種產(chǎn)物，a是單鏈試驗組cDNA，b是自身退火的試驗組雙鏈cDNA，c是試驗組和對照組的異源雙鏈cDNA，d是對照組cDNA。在兩份第一輪雜交產(chǎn)物中分別再加入新鮮變性對照組cDNA進行第二輪雜交，進一步消除試驗組和對照組共有序列。第二輪雜交完畢后，將接頭補平，然后進行兩輪選擇性PCR。第一輪PCR以接頭外側(cè)序列為引物結(jié)合位點，其中只有差異表達基因目標片段形成的e型分子以指數(shù)級大量擴增，而其他分子不能擴增或只能線性擴增；第二輪PCR擴增時，以接頭內(nèi)側(cè)序列為引物結(jié)合位點，進一步選擇性擴增目標片段，從而極大提高擴增的特異性并降低非目的片段的背景干擾，使最終的PCR產(chǎn)物中絕大部分為e型分子。

1.3 SSH技術(shù)的優(yōu)點與缺點

SSH技術(shù)具有操作簡便、快速高效、假陽性率低等優(yōu)點。該技術(shù)克服了差異顯示、代表性差異分析等技術(shù)假陽性率高、雜交次數(shù)多等缺陷，可同時分離數(shù)十個甚至數(shù)百個差異表達基因，經(jīng)過一輪消減雜交，即可實現(xiàn)對差異表達基因1 000～5 000倍的富集，篩選周期相對其他基因分離方法大大縮短。SSH技術(shù)還可保證高、低豐度差異表達基因都能有效分離，克服了差異顯示法中低豐度差異表達基因不易被分離的缺點。高富集度、低背景和消減混合物中cDNA豐度的均一化也是抑制性消減雜交技術(shù)成為快速克隆差異表達基因的理想方法的主要原因之一。SSH技術(shù)與其他基因分離技術(shù)相比也存在一些不足。SSH技術(shù)一次不能同時進行數(shù)個樣本之間的分析研究，它不適于檢測較復雜和cDNA較長的樣本的差異表達基因。在消減雜交過程中，消減文庫中cDNA已經(jīng)被酶切，不再是全長cDNA，給差異表達基因全長cDNA序列的獲得帶來較大難度和巨大的工作量；SSH技術(shù)無法篩選出完全無酶切位點或酶切位點較少的基因片段，非酶切位點區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)的點突變、小缺失或插入序列也不能被有效地發(fā)現(xiàn)。

2 SSH技術(shù)在絲狀真菌研究中的應用

2.1 SSH技術(shù)在絲狀真菌物質(zhì)合成和代謝相關(guān)基因篩選中的應用

絲狀真菌是傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)中抗生素、酶制劑和有機酸的主要生產(chǎn)者，研究調(diào)控絲狀真菌物質(zhì)合成和代謝相關(guān)的基因是絲狀真菌研究的核心問題。近年來國內(nèi)外對部分絲狀真菌的差異表達基因展開了一系列研究，為進一步獲得絲狀真菌物質(zhì)合成和代謝調(diào)控相關(guān)功能基因提供了大量備選基因，在絲狀真菌生物合成研究和應用中具有重要意義。賴衛(wèi)華等[2]對紅曲菌（Monascus aurantiacus）進行誘導培養(yǎng)，選育出不產(chǎn)橘霉素和高產(chǎn)橘霉素的菌株，應用SSH技術(shù)構(gòu)建出紅曲菌的消減cDNA文庫，轉(zhuǎn)染大腸桿菌進行文庫擴增，文庫擴增后得到283個克隆個體，為進一步篩選紅曲菌中與產(chǎn)橘霉素性狀相關(guān)的基因奠定了重要基礎。Chi等[3]應用SSH技術(shù)研究了紫杉醇產(chǎn)生菌樹狀多節(jié)孢（Nodulisporium sylviforme）在調(diào)控紫杉醇合成中的作用，為進一步揭示真菌合成紫杉醇的調(diào)控機制提供了重要依據(jù)。為了選育遺傳性狀穩(wěn)定且高產(chǎn)的紫杉醇菌株，趙凱等[4]分別采用硫酸二乙酯和紫外線與硫酸二乙酯復合誘變處理菌株HD1-3孢子，成功地構(gòu)建了高產(chǎn)紫杉醇菌株UD11-14與菌株HD1-3差異表達的cDNA消減文庫，為尋找、分離微生物生物合成紫杉醇相關(guān)基因和利用基因工程或代謝工程手段定向設計改造菌株奠定了基礎。Jochen等[5]應用SSH技術(shù)研究齊整小核菌（Sclerotium rolfsii）中合成硬葡聚糖的調(diào)控基因，最終分離出調(diào)控硬葡聚糖合成的基因，加快了齊整小核菌物質(zhì)合成、代謝機制研究的進程，為進一步闡釋該真菌在物質(zhì)合成、代謝過程中與宿主相互作用關(guān)系提供了依據(jù)。王丹楓等[6]以深黃被孢霉（Mortierella isabellina）高產(chǎn)誘變菌株和原始菌株為試驗材料，采用SSH技術(shù)成功構(gòu)建了深黃被孢霉高產(chǎn)誘變菌株差異表達文庫，為高產(chǎn)誘變菌株表達基因的篩選和鑒定提供了備選基因文庫。為了闡釋黑曲霉（Aspergillus niger）產(chǎn)糖化酶的分子機理，朱俊晨等[7]以藍光誘導黑曲霉，采用SSH技術(shù)構(gòu)建了藍光誘導的黑曲霉消減cDNA文庫，并通過文庫篩選和測序獲得了包括糖化酶在內(nèi)的13個功能基因。Xu等[8]采用SSH技術(shù)研究靈芝（Ganoderma lucidum）細胞在靜置培養(yǎng)和振蕩培養(yǎng)中單體靈芝酸的合成，并進一步鑒定差異表達的基因，對于了解靈芝酸的生物合成途徑、進一步探討靈芝酸合成的調(diào)控機制及構(gòu)建高產(chǎn)靈芝酸的工程菌株具有重要意義。

為了分離和鑒定黑曲霉木聚糖代謝相關(guān)基因，朱匯源[9]應用SSH技術(shù)成功構(gòu)建了黑曲霉木聚糖誘導正向消減文庫，獲得了大量木聚糖代謝相關(guān)酶的基因， 該研究對優(yōu)化黑曲霉的發(fā)酵、 產(chǎn)酶過程及菌株的定向遺傳改造具有重要的推動作用。Castillo等[10]為了研究產(chǎn)青霉菌在以葡萄糖和乳糖為碳源的條件下，全基因序列中影響菌體代謝差異表達的基因，應用SSH技術(shù)研究在不同碳源媒介中的差異基因，其研究結(jié)果為進一步研究產(chǎn)青霉菌在不同碳源下的代謝機制提供了理論基礎。Wu等[11]應用SSH技術(shù)研究擔子菌（Phanerochaete chr- ysosporium）在初級代謝和次級代謝轉(zhuǎn)換中差異表達的基因，成功構(gòu)建了擔子菌在代謝轉(zhuǎn)換中差異基因的cDNA文庫。

2.2 SSH技術(shù)在絲狀真菌生長發(fā)育調(diào)控基因篩選中的應用

Zhang等[12]應用SSH技術(shù)成功分離出紅曲霉（Monascus pilosus）突變株MK-1和原始菌株紅曲霉IFO4520差異表達基因，并對MK-1突變株的30個上游表達序列標簽進行鑒定，其中10個上游表達序列標簽與編碼紅曲霉生長發(fā)育中4-磷酸磷脂酰肌醇-5-激酶轉(zhuǎn)錄蛋白的功能基因相一致，其結(jié)果推動了紅曲霉突變株中合成色素基因的研究。為了研究金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae）微循環(huán)產(chǎn)孢的分子機制，張石柱[13]以微循環(huán)產(chǎn)孢時期的綠僵菌為試驗組，以正常產(chǎn)孢時期的綠僵菌菌絲為對照組，利用SSH技術(shù)成功構(gòu)建了綠僵菌CQMa102 微循環(huán)產(chǎn)孢時期的差減文庫，并對差減文庫進行了篩選，最后用生物信息學方法對得到的ESTs（Expression sequence tag）進行分析，比較其與數(shù)據(jù)庫中已知蛋白序列的同源性， 進一步研究ESTs編碼蛋白的功能，CQMa102微循環(huán)產(chǎn)孢方式奠定了理論基礎。Peng等[14]應用SSH技術(shù)分離促進綠僵菌產(chǎn)孢的正調(diào)節(jié)基因，其研究結(jié)果推動了從分子水平上研究綠僵菌的產(chǎn)孢機制。Gesing等[15]為了研究絲狀真菌子實體分化受哪些基因控制，采用SSH技術(shù)構(gòu)建不同性別和生長發(fā)育時期的火絲菌（Pyronema）的差異消減cDNA文庫，比較不同性別和生長發(fā)育時期的火絲菌的差異表達基因，這一研究為絲狀真菌生長發(fā)育中調(diào)控基因的研究奠定了基礎。Xu等[16]采用SSH技術(shù)系統(tǒng)研究靈芝在振蕩培養(yǎng)和靜置培養(yǎng)下的差異表達基因，成功構(gòu)建了差異基因的cDNA文庫，并分離出編碼靈芝發(fā)育中一些功能氨基酸的基因，而這些基因合成的氨基酸與促分裂源活化蛋白激酶具有相似功能，靜置培養(yǎng)中，這一基因高度表達。這一研究為進一步系統(tǒng)地從分子水平上研究靈芝促絲裂原活化蛋白激酶的功能提供了理論基礎。Gras等[17] 為了研究在磷酸鹽缺乏條件下培養(yǎng)的nuc-2A突變粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）的轉(zhuǎn)座子差異表達，采用SSH技術(shù)成功構(gòu)建了突變菌株和正常菌株在磷酸鹽缺乏條件下的抑制消減cDNA文庫，推動了從基因組學上研究磷酸鹽在粗糙脈孢菌生長發(fā)育中的作用。Van der nest等[18] 為了研究Amylostereum areolatum中植物的不相容性基因，應用SSH技術(shù)構(gòu)建處于各個時期的細胞的消減cDNA文庫，其研究結(jié)果為進一步研究擔子菌綱絲狀真菌的不相容性提供了理論基礎，在Amylostereum areolatum的研究中起到尤為重要的作用。姜華等[19]利用SSH技術(shù)從稻瘟菌繼代接種菌株間分離出了差異表達基因，研究發(fā)現(xiàn)盡管這些菌株表型上沒有明顯差異，但在分子水平上仍然可能存在著變化，基因本體論分類表明這些EST序列對應蛋白的功能涉及生命活動的諸多方面，其中合成相關(guān)蛋白最多，其次是傳導相關(guān)蛋白，這些蛋白參與了細胞的生長發(fā)育信號感知等生物過程。周汛等[20]應用SSH技術(shù)成功構(gòu)建了高特異性的申克孢子絲菌（Sporothrix schenckii）菌絲相和酵母相的正反cDNA消減文庫，并對其差異表達的基因進行了生物信息學分析，以探討差異表達基因與酵母相以及與菌絲相雙相轉(zhuǎn)換的相關(guān)性。其研究結(jié)果為進一步篩選鑒定菌相轉(zhuǎn)換相關(guān)差異基因奠定了基礎，有助于闡明申克孢子絲菌雙相轉(zhuǎn)換的分子機制。譚玉梅等[21]為鑒定謝瓦氏曲霉間型變種產(chǎn)孢相關(guān)的基因，采用SSH技術(shù)以低滲條件下產(chǎn)生的子囊孢子和高滲條件下產(chǎn)生的分生孢子為材料分別與營養(yǎng)菌絲體構(gòu)建兩個正反向文庫，篩選可能參與有性產(chǎn)孢調(diào)控的基因13條，可能參與無性產(chǎn)孢調(diào)控的基因10條，為進一步研究謝瓦氏曲霉間型變種產(chǎn)孢相關(guān)的基因提供了基因文庫。

2.3 SSH技術(shù)在絲狀真菌致病基因篩選中的應用

絲狀真菌是植物和動物的一類重要致病菌，能夠?qū)е轮参锖蛣游锇l(fā)病以及糧食等貯藏過程中的腐敗變質(zhì)，帶來的經(jīng)濟損失難以估量。SSH技術(shù)廣泛用于一些絲狀真菌致病基因的研究中。在絲狀真菌致病基因的研究技術(shù)中，SSH技術(shù)可以建立完整的基因文庫，減少Southern blot、PCR、DNA測序、RACE等技術(shù)大批量篩選、克隆致病基因的盲目性，極大地提高了特異性。殷從松[22]應用SSH技術(shù)構(gòu)建了金龜子綠僵菌在蝗蟲體內(nèi)特異表達基因的差減文庫，推動了金龜子綠僵菌致病相關(guān)基因Mmnt1和Mpt的克隆及功能分析的進一步發(fā)展。趙國慶[23]應用SSH技術(shù)比較糠秕馬拉色菌的菌絲態(tài)和酵母態(tài)之間的mRNA差異，分析糠秕馬拉色菌的菌絲態(tài)和酵母態(tài)的基因表達差異，了解其酵母態(tài)轉(zhuǎn)化為菌絲態(tài)的相關(guān)分子機理，成功建立了糠秕馬拉色菌菌絲態(tài)和酵母態(tài)細胞的差異表達cDNA文庫，為進一步深入研究糠秕馬拉色菌的致病機制奠定了基礎。Maranhao等[24]為了研究紅色毛廯菌侵入機體、致使機體致病的機理，應用SSH技術(shù)分離以機體脂質(zhì)為碳源的紅色毛廯菌過度表達的基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)假定合成蛋白類的基因與參與真菌蛋白類代謝、信號傳遞、防御等功能的基因相似。Liu等[25]為研究硫化羰在控制植物致病中的作用，以經(jīng)過硫化羰熏蒸過的互隔交鏈孢霉（Alternaria alternate）菌株為試驗組，未熏蒸過的菌株為對照組，應用SSH技術(shù)分離、克隆試驗組和對照組中差異表達的基因，其結(jié)果為系統(tǒng)研究硫化羰控制植物致病性提供了堅實的理論依據(jù)。Kim等[26]以感染稻瘟病菌的植株為試驗組，未感染稻瘟病菌的植株為對照組，應用SSH技術(shù)對稻瘟病菌的群體結(jié)構(gòu)和變異基因進行了研究。劉同寶[27]利用SSH技術(shù)構(gòu)建稻瘟病菌發(fā)育24 h附著胞與稻瘟病菌菌絲/孢子cDNA的差減文庫，進一步應用RT-PCR技術(shù)驗證在稻瘟病菌附著中特意表達的基因，研究結(jié)果表明構(gòu)建的cDNA文庫在篩選稻瘟病菌附著胞特異表達基因中取得了很好的結(jié)果，為應用SSH技術(shù)篩選稻瘟病菌附著胞特異表達基因奠定了基礎。姜兆遠等[28]為鑒定及分析水稻抗稻瘟病SSH-cDNA抗性文庫中差異表達基因，應用SSH技術(shù)成功構(gòu)建了水稻抗稻瘟病SSH-cDNA抗性文庫，篩選出與已知功能蛋白同源性較高的基因序列，該研究為控制和防治稻瘟病提供了新的理論和途徑。胡海燕[29]利用SSH技術(shù)分離水稻對穗瘟防衛(wèi)反應相關(guān)基因，并根據(jù)信息學對篩選的差異基因的功能進行研究，該研究為水稻對穗瘟防衛(wèi)反應相關(guān)基因的進一步篩選提供了依據(jù)。陳濤[30]試圖從水稻的T-DNA突變體中找到水稻紋枯病的抗性相關(guān)基因，應用SSH技術(shù)構(gòu)建了經(jīng)紋枯病菌誘導表達的正向和反向抑制差減，為篩選水稻紋枯病的抗性相關(guān)基因提供了基因文庫。

2.4 SSH技術(shù)在絲狀真菌毒物降解相關(guān)基因篩選中的應用

絲狀真菌（如白僵菌、綠僵菌、哈氏木霉等）在工業(yè)污染物防治中發(fā)揮了重要作用。姚琳[31]通過SSH技術(shù)構(gòu)建哈茨木霉誘導菌絲體cDNA文庫，從整體上了解在誘導抗病過程中哈茨木霉抗性相關(guān)基因的表達情況及抗病機制的運行，為進一步利用這些基因奠定了基礎。Faedda等[32]采用SSH技術(shù)研究哈茨木霉吸附土壤中重金屬的機制，發(fā)現(xiàn)人工誘導的重金屬環(huán)境下，哈茨木霉的基因出現(xiàn)明顯的差異，為進一步分離、克隆哈茨木霉中降解重金屬基因奠定了基礎。Puglisi等[33]采用SSH技術(shù)鑒定哈茨木霉菌在一價和二價汞的處理下培養(yǎng)基因的差異表達。結(jié)果分離出8個差異表達基因，這8個基因與哈茨木霉降解一價和二價汞離子的能力呈正相關(guān)，為從分子水平上系統(tǒng)研究哈茨木霉降解土壤中重金屬的機制提供了理論基礎。

3 展望

SSH技術(shù)憑借其特異性強、假陽性率低、靈敏度高和快速簡便等優(yōu)點，被廣泛應用于生命科學和醫(yī)學等各個領域差異表達基因的系統(tǒng)研究中。然而SSH技術(shù)仍然存在不足之處，如SSH技術(shù)不能應用于完全無酶切位點的基因片段或酶切位點較少的基因組，一些低豐度變化的細胞因子、轉(zhuǎn)錄因子等不能通過這種方法被檢出，SSH技術(shù)一次只能對復雜且具有細微差異的兩個樣品之間的差異表達的基因進行比較，不能同時進行數(shù)個樣本之間的分析研究，需要較多的起始材料等。在后續(xù)的研究中，應將SSH技術(shù)與其他的研究差異表達基因技術(shù)結(jié)合起來應用，從而提高篩選的范圍和準確性。與cDNA微陣列技術(shù)、反向Northern雜交技術(shù)、實時定量PCR技術(shù)、RACE技術(shù)、基因組比較分析法（Genomic comparative analysis）等技術(shù)聯(lián)合使用，實現(xiàn)多種技術(shù)的優(yōu)勢互補，以達到高效、靈敏和特異性地分離鑒定差異表達基因的目的。近年來，隨著SSH技術(shù)的發(fā)展，SSH技術(shù)已經(jīng)廣泛應用于絲狀真菌的物質(zhì)合成、代謝、生理發(fā)育調(diào)控基因、致病基因、降解工業(yè)毒物基因的研究中，推動從分子水平上對于絲狀真菌功能基因的研究，選育出對人類生活起積極作用的高產(chǎn)絲狀真菌，敲除危害絲狀真菌宿主植物的有害基因，使絲狀真菌更好地服務于人類。

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