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    三種抗菌藥物微生物限度檢查方法學(xué)驗(yàn)證研究

    2023-12-18 13:09:12蔣天逖曹聰聰
    生物化工 2023年5期
    關(guān)鍵詞:過濾法平皿試液

    蔣天逖,曹聰聰

    (長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院,湖南長(zhǎng)沙 410219)

    對(duì)于非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料的微生物污染程度的檢查,《中國(guó)藥典》制定了微生物限度檢查法[1],主要檢查項(xiàng)目有需氧菌總數(shù)、霉菌數(shù)和酵母菌總數(shù)及控制菌(指藥品中特定的菌體)檢查[2]。藥品微生物限度檢查的主要目的是通過微生物數(shù)量的定量檢測(cè)以準(zhǔn)確反映藥品侵蝕程度,繼而確定樣品微生物具體含量[3]。

    微生物在日常生活中不可或缺,可參與大自然循環(huán),分解有機(jī)物,產(chǎn)生代謝產(chǎn)物,其中部分代謝產(chǎn)物會(huì)導(dǎo)致人畜疾病、食物腐敗或霉?fàn)€等,具有分布廣、種類多、繁殖快的特點(diǎn)[4]。在藥品中,可造成藥物污染的微生物種類繁多,如生活中隨處可見的細(xì)菌、酵母菌和霉菌,其中絕大部分是致病菌。由于藥物在生產(chǎn)過程中原料、輔料和生產(chǎn)工藝的差異,不同種類藥物受到微生物污染程度也不盡相同。而藥品在生產(chǎn)過程中受污染的微生物越多,其變質(zhì)越快,有效期越短,甚至將導(dǎo)致服藥者產(chǎn)生發(fā)熱、感染、中毒、過敏等不良反應(yīng),從而造成各種臨床疾病的可能性就越多[5-6]。

    研究表明,導(dǎo)致藥物活性降低的原因一般有兩種:(1)部分微生物存在于藥品中,繼而導(dǎo)致部分藥品效果缺失或完全喪失;(2)樣品存儲(chǔ)年限較久而導(dǎo)致其部分失效[7-8]。因此,藥品生產(chǎn)、流通、儲(chǔ)存等環(huán)節(jié)均需嚴(yán)格遵循相應(yīng)的質(zhì)量把控、管理規(guī)范,從而最大限度降低藥品受到微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)及污染程度。為實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo),驗(yàn)證不同抗菌藥物的微生物限度檢查方法有效性,改善相關(guān)檢測(cè)技術(shù)也非常必要。

    1 材料與方法

    1.1 儀器與試劑

    BSC-1500IIA2 生物安全柜,上海中庸檢驗(yàn)設(shè)備有限公司;SW-CJ-2D 超凈工作臺(tái),蘇州凈化設(shè)備有限公司;HTY 無菌隔離器,浙江泰林生物技術(shù)股份有限公司;HR 封閉式/開放式兩用無菌檢查薄膜過濾器,北京恒瑞天創(chuàng)機(jī)電設(shè)備有限公司;標(biāo)準(zhǔn)型PH 計(jì)PB-10/C,上海精密科學(xué)儀器有限公司;移液槍,上海精密科學(xué)儀器有限公司;FC104 電子天平,上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司;智能高壓蒸汽滅菌器,艾德生儀器有限公司;25℃SPX-250B-Z 型生化培養(yǎng)箱、35℃SPX-250B-Z 型生化培養(yǎng)箱,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;勻漿儀,杭州高得醫(yī)療器械有限公司。

    大腸埃希菌(Escherichiacoli)[CMCC(B)44102]、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]、白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001],0.5 ~1.0×103cfu/顆,中國(guó)食品藥品檢定研究院。營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、BL增菌培養(yǎng)基、沙氏培養(yǎng)基,中國(guó)藥品生物制品檢定所;培養(yǎng)基所用蛋白胨、氯化鈉等其他試劑均由廣東翁江化學(xué)試劑有限公司提供。鹽酸莫西沙星(批號(hào):180304)、諾氟沙星(批號(hào):180210)、阿奇霉素(批號(hào):180401),湖南迪諾制藥有限公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 沖洗劑制備

    配置0.9%氯化鈉溶液和0.1%蛋白胨氯化鈉緩沖液,高壓滅菌后備用。

    1.2.2 菌液制備

    取兩種新鮮培養(yǎng)物(金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌)同時(shí)分別接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基,而后取白色念珠菌新鮮培養(yǎng)物接種到沙氏液體培養(yǎng)基,按《中國(guó)藥典》描述的具體方法,將其制備成50 ~100 個(gè)/mL水平,分為一式三份待用。

    1.2.3 供試液制備

    取10 g 藥物樣品到100 mL 無菌氯化鈉溶液(濃度0.9%),制成供試液(1 ∶10),若存在不溶性顆粒,則可500 r/min 離心處理5 min,而后取上層液體,確保供試液均勻。

    1.2.4 試驗(yàn)方法

    1.2.4.1 平皿菌落計(jì)數(shù)法(平皿法)

    采用常規(guī)平皿傾注法進(jìn)行試驗(yàn)。分別取1 ∶10的供試品溶液9.9 mL,加入試驗(yàn)菌液各0.1 mL,充分混勻后吸取混合溶液1 mL 至無菌平皿中,傾注胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基,先后經(jīng)過混勻、凝固等操作步驟,平行制備2 組。將大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌在30~35 ℃培養(yǎng)3 d,白色念珠菌在30~35 ℃培養(yǎng)5 d。計(jì)數(shù),計(jì)算各組的平均菌落數(shù)。

    1.2.4.2 洗脫法

    取供試液使用直徑為50 mm、孔徑0.45 μm 的濾膜進(jìn)行減壓抽濾,而后取出濾膜使用100 mL滅菌生理鹽水緩慢流動(dòng)沖洗,總用量不超過1 000 mL。取1 mL沖洗液放入雙碟中,先后加入等量的營(yíng)養(yǎng)瓊脂和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基,并先后在35 ℃培養(yǎng)48 h、27 ℃培養(yǎng)72 h 后取出計(jì)算菌數(shù)。

    1.2.4.3 薄膜過濾法(薄膜法)

    分別取1 ∶10 的供試品溶液1.0 mL 至薄膜過濾器中,用0.7%氯化鈉蛋白胨溶液沖洗3 次,每次用量100 mL,在最后一次沖洗前加入0.1 mL 菌液進(jìn)行過濾,轉(zhuǎn)移濾膜,將細(xì)菌表面貼于胰蛋白酶瓊脂培養(yǎng)基上,按規(guī)定培養(yǎng)計(jì)數(shù)。

    1.2.4.4 回收率測(cè)定

    分別取前述步驟中制備的菌液,將其稀釋至指定濃度(30 ~100 cfu/mL),而后將其加入至供試液中,并取1 mL 溶液進(jìn)行培養(yǎng)基計(jì)數(shù),計(jì)算回收率。

    1.2.5 數(shù)據(jù)分析

    實(shí)驗(yàn)過程中的數(shù)據(jù)收集整理采用Excel 2010軟件。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 樣品檢出情況

    使用三種藥物重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次,平皿菌落計(jì)數(shù)法細(xì)菌數(shù)、洗脫法細(xì)菌數(shù)、薄膜過濾法細(xì)菌數(shù)具體見表1??梢钥吹?,3 種藥物供試樣品中薄膜過濾法檢出細(xì)菌數(shù)均最多。

    表1 三種方法樣品檢出細(xì)菌數(shù)(單位:個(gè)/g)

    2.2 回收率

    如表2 所示,3 種藥物使用薄膜過濾法檢測(cè)細(xì)菌回收率均最高,鹽酸莫西沙星中金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌和白色念珠菌的回收率分別為78.00%、81.25%、75.38%,諾氟沙星中的回收率分別為70.00%、72.50%、84.62%,阿奇霉素中的回收率分別為72.00%、75.00%、80.00%。

    表2 三種驗(yàn)證方法對(duì)菌種的回收率

    2.3 討論

    需氧菌總數(shù)、霉菌數(shù)、酵母菌總數(shù)及控制菌(指藥品中特定的菌體)等是非規(guī)定的滅菌制劑(及其原料)、輔料等藥品組分中微生物存在情況及具體污染程度的主要檢查項(xiàng)目。本試驗(yàn)研究中采取薄膜過濾法檢查鹽酸莫西沙星、阿奇霉素和諾氟沙星的需氧菌總數(shù)、控制菌(大腸埃希菌)總數(shù)和鹽酸莫西沙星的霉菌數(shù),所得結(jié)果均符合《中國(guó)藥典》規(guī)定。三種抗菌藥物微生物限度檢查結(jié)果比較,莫西沙星的抑菌活性強(qiáng)于其余兩者,通過不同稀釋級(jí)供試液和不同檢查方法得出薄膜過濾法適用于鹽酸莫西沙星、阿奇霉素和諾氟沙星的微生物限度檢查[9]。

    本研究發(fā)現(xiàn)薄膜法樣品中菌數(shù)測(cè)定結(jié)果和回收率顯著高于平皿法和洗脫法,可能與以下原因有關(guān)。(1)平皿菌落計(jì)數(shù)法是將供試液按照設(shè)定程度予以稀釋后直接接種于平皿并進(jìn)行菌數(shù)測(cè)定的方法,雖然稀釋劑和培養(yǎng)基會(huì)對(duì)抗菌藥物中的抑菌成分進(jìn)行稀釋,其抑菌能力有所降低,但是不至于完全消失,因此會(huì)影響細(xì)菌的生長(zhǎng)過程,同時(shí)降低其檢出率和回收率。(2)洗脫法的操作過程中細(xì)菌會(huì)吸附在濾膜表面或鑲嵌在纖維膜的間隙中,很難通過沖洗洗脫下來,因此會(huì)出現(xiàn)檢出率和回收率低。(3)薄膜法在具體操作過程中則會(huì)使用稀釋液對(duì)濾膜進(jìn)行反復(fù)沖洗,該處理方式會(huì)極大降低抑菌成分濃度,甚至在微生物限度檢查層面會(huì)降低原有成分的抑菌效果。需要注意的是,在具體操作過程中,薄膜過濾法必須首先將供試液加入濾罐中,先混勻沖洗液再進(jìn)行減壓抽濾,否則抑菌成分不能徹底去除,將直接影響測(cè)定結(jié)果[10]。

    3 結(jié)論

    薄膜法在過濾樣品過程中,將微生物留在濾膜表面,藥品中的抑菌成分則在無菌沖洗液的反復(fù)沖洗下有效去除,培養(yǎng)過程中其營(yíng)養(yǎng)成分和代謝物也可以通過濾膜上的微孔不斷進(jìn)行交換。總的來說,薄膜法不僅能增大取樣量,實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具代表性,還可以有效減少外部環(huán)境或操作因素的干擾,操作過程更為方便實(shí)用,簡(jiǎn)化了微生物的檢測(cè)程序,可在相關(guān)領(lǐng)域推廣應(yīng)用。

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