制曲方式對(duì)豉香型白酒酒曲理化因子及細(xì)菌群落的影響

王宇良，李志溥，蘇澤佳，梁景龍,2，白衛(wèi)東,2，費(fèi)永濤,2，趙文紅,2,*，方毅斐

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部嶺南特色食品綠色加工與智能制造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510225；3.廣東省九江酒廠，廣東 佛山 528203）

中國白酒類型繁多，可根據(jù)地域、發(fā)酵材料、釀造工藝、所用酒曲及酒體風(fēng)味進(jìn)行區(qū)分[1]。白酒香型概念在中國第三屆品酒大會(huì)上被首次提出，而豉香型白酒在1984年被確立，是繼濃、醬、清、米4 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)之后第1個(gè)出現(xiàn)的獨(dú)立香型[2]，也是珠三角地區(qū)所特有的傳統(tǒng)白酒，因其具有獨(dú)特的豉香味而得名，其復(fù)雜的釀造過程可大致分為制曲、投罐發(fā)酵、蒸餾、陳肉醞浸等，其中制曲是釀造過程中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一，酒曲的質(zhì)量直接決定了豉香型白酒的產(chǎn)量和品質(zhì)。

豉香型白酒酒曲屬于小曲[3]，以大米、黃豆為主要原料，加入餅丸（母曲）、酒餅葉及各種中草藥等輔料所制成，是豉香型白酒釀造過程中的唯一糖化發(fā)酵劑[4-5]。傳統(tǒng)酒曲的制作存在勞動(dòng)強(qiáng)度大、生產(chǎn)效率低和高生產(chǎn)成本等缺點(diǎn)，同時(shí)以人工操作為主的生產(chǎn)操作，使得制曲過程易受環(huán)境因素影響，導(dǎo)致酒曲質(zhì)量難以穩(wěn)定，因此近年來豉香型白酒酒曲的制作開始引進(jìn)機(jī)械化制曲技術(shù)，機(jī)械制曲工藝如圖1所示。機(jī)械制曲與傳統(tǒng)制曲有明顯不同，首先在原料上，機(jī)械制曲在與傳統(tǒng)制曲所用原料相同的基礎(chǔ)上額外添加了麥麩，使得酒曲質(zhì)地松散，區(qū)別于傳統(tǒng)制曲大酒餅的緊密質(zhì)地，其次機(jī)械制曲的發(fā)酵過程在集進(jìn)料，控溫調(diào)濕、控風(fēng)和翻曲、培養(yǎng)、出料及清洗等于一體的全封閉機(jī)械化自動(dòng)化圓盤制曲機(jī)中進(jìn)行[6]，代替了傳統(tǒng)人工操作，大大降低了生產(chǎn)成本和勞動(dòng)強(qiáng)度，提高了酒曲的生產(chǎn)效率及質(zhì)量的穩(wěn)定性。雖然機(jī)械化制曲能夠有效解決傳統(tǒng)制曲存在的問題，但由于機(jī)械制曲和傳統(tǒng)制曲存在較大差異，在酒曲發(fā)酵過程是否會(huì)導(dǎo)致微生物的生長演替情況、菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生差異，以及酒曲發(fā)酵力、糖化力等理化因子有無差異，均成為機(jī)械化制曲能否代替?zhèn)鹘y(tǒng)制曲關(guān)鍵問題。目前已對(duì)豉香型白酒傳統(tǒng)制曲過程中的細(xì)菌群落進(jìn)行研究，但機(jī)械制曲和傳統(tǒng)制曲過程細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異尚不清晰，因此，本研究通過分析表征酒曲品質(zhì)的理化因子，同時(shí)采用高通量對(duì)機(jī)械制曲和傳統(tǒng)制曲過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，并結(jié)合相關(guān)性分析菌群和理化因子間的作用關(guān)系，對(duì)推動(dòng)豉香型白酒機(jī)械化制曲的創(chuàng)新和應(yīng)用具有重要意義。

圖1 機(jī)械制曲工藝流程Fig.1 Flow chart of mechanized Qu making

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

廣東某酒廠機(jī)械制曲不同時(shí)間段樣品：由制曲開始0 h至制曲結(jié)束120 h，隔6 h取樣一次，其中0～96 h為發(fā)酵期，96～120 h為干燥期；傳統(tǒng)制曲不同時(shí)間段樣品：由制曲開始0 h至制曲結(jié)束144 h，隔6 h取樣一次，其中0～120 h為發(fā)酵期，120～144 h為干燥期。兩種制曲方式過程中，發(fā)酵期溫度均保持在32～45 ℃，干燥期保持在45～55 ℃。

氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液 廣東銘固化學(xué)科技有限公司；酚酞 廣州化學(xué)試劑廠；3,5-二硝基水楊酸溶液、福林-酚試劑、L-干酪素、糖化酶、α-淀粉酶、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液 上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇、無水碳酸鈉、碘化鉀、碘、五水硫酸銅、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、三氯己酸 天津永大有限公司；乳酸、葡萄糖 麥克林試劑有限公司；可溶性淀粉 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C pH計(jì) 艾力特國際貿(mào)易有限公司；TU-1901紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HC130水分測(cè)定儀 上海梅特勒-托利多儀器有限公司；SPX智能生化培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠；Illumina MiSeq測(cè)序儀 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 理化因子的測(cè)定

水分、發(fā)酵力、酯化力、糖化力測(cè)定根據(jù)QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》，酸度、氨基酸態(tài)氮測(cè)定參考杜亞飛等[7]采用連續(xù)滴定法，液化力測(cè)定參考沙均響等[8]采用分光光度法，酸性蛋白酶活力測(cè)定參考鄭東影等[9]采用福林-酚法。

1.3.2 微生物多樣性解析

1.3.2.1 樣品總DNA提取

DNA提取按照DNA提取試劑盒E.Z.N.A.?Soil DNA Kit的說明書進(jìn)行。提取后對(duì)DNA進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）提取及MiSeq Illumina測(cè)序

PCR擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)區(qū)域16S V3～V4區(qū)，細(xì)菌16S引物338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG），真菌引物806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT），對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定、純化以及定量后構(gòu)建PE文庫，進(jìn)行Illumina測(cè)序，由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel、Origin 2020、Qiime1.9.1、Mothur等結(jié)合R語言軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 制曲方式對(duì)酒曲理化因子的影響

2.1.1 制曲過程中水分的變化

水分是衡量曲是否達(dá)到儲(chǔ)藏標(biāo)準(zhǔn)的一個(gè)主要指標(biāo)，一般來說水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于13%為宜[3]。如圖2所示，在整個(gè)制曲過程中，傳統(tǒng)制曲和機(jī)械制曲中水分含量均隨時(shí)間延長緩慢降低，其中傳統(tǒng)制曲最高水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)由初始的（40.78±1.82）%降低至干燥結(jié)束時(shí)的（10.32±0.10）%，而機(jī)械制曲則由初始最高水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（33.65±1.74）%降低至干燥結(jié)束時(shí)的（7.35±0.17）%。兩者制曲過程的不同導(dǎo)致兩者水分含量的變化趨勢(shì)有所不同，傳統(tǒng)制曲過程除混料壓餅成型前階段均晾掛在餅房中進(jìn)行自然發(fā)酵，因此其水分含量變化趨勢(shì)呈隨時(shí)間持續(xù)降低，而機(jī)械制曲全程均在封閉的圓盤制曲儀中，在制曲過程的前4 d為機(jī)械控水，使得其水分含量呈階梯式下降趨勢(shì)。而兩者就質(zhì)地而言，傳統(tǒng)制曲為整塊狀，機(jī)械制曲為松散狀，因此傳統(tǒng)制曲中水分含量會(huì)略高于機(jī)械制曲，兩者最終水分含量存在顯著差異（P＜0.05）。

圖2 制曲過程中水分變化Fig.2 Change of moisture during Qu making

2.1.2 制曲過程中酸度的變化

曲中酸度是評(píng)定大曲質(zhì)量的重要指標(biāo)，酸度主要是由產(chǎn)酸微生物如乳桿菌等在曲中進(jìn)行有機(jī)酸代謝而形成，還有一部分來源于有機(jī)物的降解。它是大曲中微生物綜合作用的結(jié)果，適當(dāng)?shù)乃岫饶軌蛞种拼笄杏泻﹄s菌的代謝，也為有益微生物提供了某些生化反應(yīng)的前體物質(zhì)[10]。如圖3所示，在制曲過程中，傳統(tǒng)制曲的酸度在發(fā)酵初期迅速升高，由（0.22±0.01 ）mmol/10 g 上升至（0.88±0.03）mmol/10 g，在36 h后開始降低至干燥完成后酸度僅有（0.30±0.01）mmol/10 g。而機(jī)械制曲的酸度變化則呈緩慢積累過程，初始酸度為（0.38±0.01）mmol/10 g，在90 h到達(dá)峰值（0.63±0.02）mmol/10 g，而后迅速降低至（0.40±0.01）mmol/10 g，到最后干燥完成時(shí)酸度為（0.463±0.01）mmol/10 g，比傳統(tǒng)制曲高0.16 mmol/10 g，存在顯著差異（P＜0.01）。榮瑞金等[11]在對(duì)醬香型白酒的研究中發(fā)現(xiàn)，水分含量高的酒曲酸度顯著高于水分含量低的酒曲，所以兩者酸度迅速下降的原因可能是水分含量變化所引起，在傳統(tǒng)制曲中，24 h后培養(yǎng)房濕度緩慢下降，而機(jī)械制曲中90 h后也進(jìn)入鼓風(fēng)干燥的過程，水分含量的減少進(jìn)而影響了產(chǎn)酸微生物的生命代謝活動(dòng)，酸性物質(zhì)也可能會(huì)在該階段有所揮發(fā)。

圖3 制曲過程中酸度變化Fig.3 Change of acidity during Qu making

2.1.3 制曲過程中氨基酸態(tài)氮的變化

氨基酸態(tài)氮是衡量曲優(yōu)劣的一項(xiàng)重要指標(biāo)，利用氨基酸態(tài)氮的指標(biāo)反映制曲過程中自身微生物以及酶降解蛋白質(zhì)的能力，含量越高表明曲中所積累的復(fù)合香氣物質(zhì)越多、微生物活力越強(qiáng)[12]。由圖4可知，傳統(tǒng)制曲和機(jī)械制曲的初始氨基酸態(tài)氮含量分別為（125.59±11.71）mg/g和（104.65±4.81）mg/g，均在制曲42 h到達(dá)峰值，分別為（384.29±27.76）mg/g和（312.27±3.58）mg/g，制曲結(jié)束時(shí)傳統(tǒng)制曲中氨基酸態(tài)氮顯著高于機(jī)械制曲（P＜0.01），含量分別為（311.31±10.25）mg/g和（233.00±10.12）mg/g。

圖4 制曲過程中氨基酸態(tài)氮變化Fig.4 Change of amino nitrogen content during Qu making

2.1.4 制曲過程中發(fā)酵力的變化

影響發(fā)酵力的主要微生物是釀酒酵母，釀酒酵母在無氧條件將原料中的糖類物質(zhì)分解產(chǎn)生醇類物質(zhì)以及二氧化碳[13]。同時(shí)，不同酵母之間也存在著相互作用關(guān)系，有研究結(jié)果顯示，在釀造過程中，異常漢遜酵母的生長受釀酒酵母的抑制，并且釀酒酵母對(duì)發(fā)酵力的影響高于異常漢遜酵母[14]。由圖5可知，傳統(tǒng)制曲和機(jī)械制曲的初始發(fā)酵力分別為（1.328±0.09）U和（1.348±0.14）U，傳統(tǒng)制曲在78 h達(dá)到峰值（5.067±0.341）U，機(jī)械制曲則在36 h達(dá)到峰值（4.605±0.145）U，制曲結(jié)束時(shí)傳統(tǒng)制曲發(fā)酵力顯著高于機(jī)械制曲（P＜0.01），分別為（4.532±0.039）U和（3.220±0.094）U。

圖5 制曲過程中發(fā)酵力變化Fig.5 Change of fermentation power during Qu making

2.1.5 制曲過程中酯化力的變化

酯化力是酯化酶活性的表現(xiàn)，酯化酶是脂肪酶和酯酶的統(tǒng)稱，酯化酶可以由酵母菌、細(xì)菌、霉菌等微生物生成。其中最主要的產(chǎn)酯微生物是酵母菌，酵母菌通過脂肪酸與輔酶A的結(jié)合活化，形成?；o酶A與醇類物質(zhì)合成相應(yīng)酯類，醇和?；鵆oA再在醇?；D(zhuǎn)移酶的作用下生物催化生成相應(yīng)的酯類物質(zhì)，這就是酵母中酯類合成的主要途徑[15]。由圖6可知，傳統(tǒng)制曲和機(jī)械制曲的初始酯化力分別為（211±26.98）mg/（g·100 h）和（184.66±6.66）mg/（g·100 h），傳制曲在30 h達(dá)到峰值（547.66±12.76）mg/（g·100 h），機(jī)械制曲則在36 h達(dá)到峰值（511.66±23.01）mg/（g·100 h），制曲結(jié)束時(shí)傳統(tǒng)制曲發(fā)酵力顯著高于機(jī)械制曲（P＜0.05），分別為（498±26.28）mg/（g·100 h）和（433.65±34.25）mg/（g·100 h）。

圖6 制曲過程中酯化力變化Fig.6 Change of esterification power during Qu making

2.1.6 制曲過程中液化力的變化

液化力主要是受曲中微生物體內(nèi)的淀粉酶活性影響，淀粉酶可由多種微生物所代謝出，主要由細(xì)菌和真菌產(chǎn)生，如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、根霉、黑曲霉等[16]。由圖7可知，傳統(tǒng)制曲的液化力由培養(yǎng)初始的（0.276±0.02）g/（g·h）至72 h達(dá)到峰值（3.521±0.12）g/（g·h），隨后呈波動(dòng)變化趨勢(shì)，制曲結(jié)束時(shí)其液化力為（1.95±0.08）g/（g·h）；機(jī)械制曲則由發(fā)酵初始（0.60±0.04）g/（g·h）至30 h達(dá)到峰值（4.04±0.135）g/（g·h），制曲結(jié)束時(shí)其液化力為（1.88±0.095）g/（g·h）。兩者液化力動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)相似，干燥期結(jié)束后液化力無顯著差異（P＞0.05）。

圖7 制曲過程中液化力變化Fig.7 Change of liquefaction power during Qu making

2.1.7 制曲過程中糖化力的變化

糖化力是衡量酒曲是否合格的一項(xiàng)重要指標(biāo)。糖化力是影響出酒率的重要因素之一，糖化力高低主要與細(xì)菌群落的代謝過程有關(guān)[17]。相關(guān)研究表明，糖化力還與發(fā)酵原料有關(guān)，原料中的淀粉含量能夠影響曲中霉菌代謝糖化酶的能力[18]。由圖8可知，傳統(tǒng)制曲和機(jī)械制曲的初始酯化力分別為（139.92±12.06）mg/（g·h）和（168.33±9.03）mg/（g·h），傳統(tǒng)制曲在72 h達(dá)到峰值（565.66±15.10）mg/（g·h），機(jī)械制曲則在84 h達(dá)到峰值（353.78±4.14）mg/（g·h），制曲結(jié)束時(shí)傳統(tǒng)制曲的糖化力顯著高于機(jī)械制曲（P＜0.01），分別為（455.96±23.16）mg/（g·h）和（233.36±19.17）mg/（g·h）。

圖8 制曲過程中糖化力變化Fig.8 Change of saccharifying power during Qu making

2.1.8 制曲過程中酸性蛋白酶活力的變化

蛋白酶能夠分解蛋白質(zhì)生成氨基酸，而氨基酸可以作為風(fēng)味物質(zhì)。酒中許多風(fēng)味物質(zhì)來源于蛋白質(zhì)和蛋白酶，高活性的酸性蛋白酶能夠加強(qiáng)酒質(zhì)[19-20]；在不同大曲樣品的水解酶活性研究中發(fā)現(xiàn)，蛋白酶對(duì)醬香型大曲的質(zhì)量有重要作用[21]。因此，酸性蛋白酶與曲中的風(fēng)味和后續(xù)發(fā)酵酒體具有密切聯(lián)系。由圖9可知，傳統(tǒng)制曲和機(jī)械制曲的初始酸性蛋白酶活力分別為（33.08±2.58）U/g和（21.68±1.23）U/g，傳統(tǒng)制曲在60 h達(dá)到峰值（66.91±1.67）U/g，機(jī)械制曲則在39～51 U/g之間浮動(dòng)，制曲結(jié)束時(shí)傳統(tǒng)制曲與機(jī)械制曲之間無顯著差異（P＞0.05），分別為（51.85±4.95）U/g和（40.71±4.03）U/g。

圖9 制曲過程中酸性蛋白酶活變化Fig.9 Change of acid protease activity during Qu making

2.2 傳統(tǒng)制曲與機(jī)械制曲過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

傳統(tǒng)和機(jī)械制曲過程中共鑒定出18 種（相對(duì)豐度大于1%）屬水平微生物群落（圖10），包括乳桿菌屬（Lactobacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、片球菌屬（Pediococcus）、魏氏菌屬（Weissella）、青枯菌屬（Ralstonia）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）、微小桿菌屬（Exiguobacterium）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、庫特氏菌屬（Kurthia）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、腸球菌屬（Enterococcus）、葡萄糖酸桿菌屬（Glutamicibacter）、裂孢菌屬（Thermobifida）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、腸桿菌屬（Enterobacter）、芽殖桿菌屬（Gemmobacter）、海洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus），其中傳統(tǒng)和機(jī)械制曲中的核心細(xì)菌屬均為Lactobacillus、Bacillus、Pediococcus和Weissella，分別占兩組總菌落數(shù)的80%以上，這4 種菌屬為藥曲中的常見菌屬，它們的代謝產(chǎn)物可對(duì)酒的風(fēng)味起促進(jìn)作用[22]，同時(shí)還是醬香型等白酒發(fā)酵過程中的重要功能微生物[23-25]。通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，兩組中Lactobacillus、Bacillus、Pediococcus和Weissella有明顯差異，機(jī)械制曲結(jié)束時(shí)的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為Bacillus（71.20%），傳統(tǒng)制曲中Bacillus的相對(duì)含量僅為0.38%；傳統(tǒng)制曲結(jié)束時(shí)的主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為Lactobacillus（68.30%），而機(jī)械制曲中Lactobacillus的相對(duì)含量僅為9.71%，同時(shí)Pediococcus和Weissella在機(jī)械制曲中的含量明顯低于傳統(tǒng)制曲，其中在制曲結(jié)束時(shí)，Pediococcus在傳統(tǒng)制曲和機(jī)械制曲中的含量分別為17.10%和2.20%，Weissella為7.70%和0.28%。Lactobacillus和Bacillus等主要功能性菌屬在兩組間存在差異，可能與機(jī)械制曲的環(huán)境及散曲的質(zhì)地相關(guān)，機(jī)械制曲過程采用大型鼓風(fēng)機(jī)控濕，該階段鼓風(fēng)機(jī)將大量空氣吹入環(huán)境中，同時(shí)散曲的質(zhì)地松散，在制曲過程中定時(shí)攪拌，使得散曲能夠充分與環(huán)境中的氧氣接觸，為Bacillus等好氧菌[26]提供充足氧氣，且機(jī)械制曲額外添加的麩皮具有良好的保濕效果，這就為Bacillus等菌屬提供了舒適的生長條件，但這同時(shí)也抑制了Lactobacillus、Weissella等兼性厭氧和厭氧菌的生長。相關(guān)研究表明，Lactobacillus、Weissella可代謝產(chǎn)生多種有機(jī)酸，不僅能夠提高酒曲酸度抑制不耐酸雜菌的生長，還能為酒體中的風(fēng)味物質(zhì)提供前體物[27-29]。Bacillus除了與揮發(fā)性酸的產(chǎn)生有關(guān)，同時(shí)還是蛋白酶和淀粉酶的重要來源，還可代謝4-甲基吡嗪、乙偶姻等風(fēng)味物質(zhì)[30-31]，高活力的Bacillus對(duì)酒體風(fēng)味品質(zhì)有重要貢獻(xiàn)作用[32-33]。在茅臺(tái)酒曲的研究中發(fā)現(xiàn)，人工制曲和機(jī)械制曲的優(yōu)勢(shì)菌屬和動(dòng)態(tài)變化雖沒有顯著差異，但機(jī)械制作的大曲比手工制作的大曲含有更多的Bacillus，而Bacillus是醬香型白酒發(fā)酵過程中最主要的功能菌，有利于醬香型白酒的制曲發(fā)酵[34]。

圖10 細(xì)菌屬水平物種豐度圖Fig.10 Relative abundance of bacterial genera in Qu samples at different fermentation times

2.3 機(jī)械制曲主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌間及理化因子的相關(guān)性分析

為揭示細(xì)菌群落間的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系以及對(duì)理化因子的影響，選取機(jī)械制曲過程中的核心且與傳統(tǒng)制曲存在顯著差異的細(xì)菌屬與理化因子進(jìn)行相關(guān)性分析，如圖11所示，發(fā)現(xiàn)Bacillus與Lactobacillus、Pediococcus和Weissella間存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，由于機(jī)械制曲和傳統(tǒng)制曲的質(zhì)地及生產(chǎn)環(huán)境不同，使得兩者雖主要核心菌屬相同，但核心菌種間的組成比例不同，機(jī)械制曲過程中的環(huán)境適宜Bacillus的生長，其大量繁殖從而導(dǎo)致Lactobacillus、Pediococcus和Weissella的生長受到抑制[29]，同時(shí)在傳統(tǒng)制曲中，較高豐富度的Lactobacillus可能會(huì)合成抗生素和細(xì)菌素，導(dǎo)致傳統(tǒng)制曲中Bacillus的生長受到抑制，這與唐鰻秋等[35]對(duì)四川黃酒麥曲的研究結(jié)果一致，該結(jié)果表明機(jī)械制曲過程要合理科學(xué)控制干燥時(shí)進(jìn)風(fēng)量及散曲攪拌頻率，將制曲過程中的氧氣含量控制在合理范圍內(nèi)，使得優(yōu)勢(shì)菌群結(jié)構(gòu)處于相對(duì)平衡狀態(tài)。此外Lactobacillus與氨基酸態(tài)氮、發(fā)酵力、酯化力、糖化力和酸性蛋白酶呈正相關(guān)；Bacillus與酸度、氨基酸態(tài)氮和液化力呈正相關(guān)；Pediococcus、Weissella與氨基酸態(tài)氮、發(fā)酵力、酯化力、液化力和酸性蛋白酶呈負(fù)相關(guān)與酸度呈正相關(guān)。以上結(jié)果表明，機(jī)械制曲過程保持一個(gè)相對(duì)合適的氧氣含量環(huán)境和相對(duì)穩(wěn)定環(huán)境變化，既有利于Lactobacillus、Bacillus、Weissella等核心功能微生物的平衡生長，又有利于提高酒曲品質(zhì)。

圖11 機(jī)械制曲過程細(xì)菌群落與理化因子相關(guān)性分析Fig.11 Correlation between bacterial community and physicochemical properties of Qu during mechanized making

3 結(jié)論

通過測(cè)定豉香型白酒傳統(tǒng)和機(jī)械制曲過程中水分、酸度、氨基酸態(tài)氮、發(fā)酵力、酯化力、液化力、糖化力、酸性蛋白酶發(fā)現(xiàn)，在制曲結(jié)束時(shí)，傳統(tǒng)制曲的水分、氨基酸態(tài)氮、發(fā)酵力、酯化力和糖化力顯著高于（P＜0.05）機(jī)械制曲，機(jī)械制曲的酸度高于傳統(tǒng)制曲；兩者液化力、酸性蛋白酶活力分別穩(wěn)定在40～50 U/g和1.8 g/（g·h）左右，無顯著差異（P＞0.05）。采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)豉香型白酒傳統(tǒng)和機(jī)械制曲過程中的細(xì)菌群落進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn)，兩者制曲過程中的主要核心細(xì)菌屬雖相似，均為Lactobacillus、Bacillus、Pediococcus和Weissella，占兩組總菌落數(shù)的80%以上，但核心細(xì)菌屬間的占比存在顯著差異（P＜0.05），傳統(tǒng)制曲中Lactobacillus（傳統(tǒng)制曲：68.30%；機(jī)械制曲：9.71%）、Pediococcus（傳統(tǒng)制曲：17.10%；機(jī)械制曲：2.20%）和Weissella（傳統(tǒng)制曲：7.70%；機(jī)械制曲：0.28%）顯著高于機(jī)械制曲，機(jī)械制曲中Bacillus（傳統(tǒng)制曲：0.38%；機(jī)械制曲：71.20%）顯著高于傳統(tǒng)制曲。通過核心菌屬與理化因子相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，Lactobacillus、Bacillus、Pediococcus和Weissella均與表征酒曲品質(zhì)的理化因子間存在明顯相關(guān)性，其中Lactobacillus與氨基酸態(tài)氮、發(fā)酵力、酯化力、糖化力和酸性蛋白酶呈正相關(guān)；Bacillus與酸度、氨基酸態(tài)氮和液化力呈正相關(guān)，Lactobacillus和Bacillus同時(shí)為兩種制曲方式中差異最顯著的細(xì)菌屬，由于機(jī)械制曲過程中添加了麥麩及制曲環(huán)境的不同，使得其與傳統(tǒng)制曲的質(zhì)地及制曲過程中與氧氣的接觸量有所差異，如若能在機(jī)械制曲過程中合理科學(xué)地控制制曲環(huán)境中氧氣含量以及保持環(huán)境變化的相對(duì)穩(wěn)定，這樣既有利于好氧及厭氧核心功能微生物的平衡生長，又有利于提高酒曲品質(zhì)。機(jī)械制曲相較于傳統(tǒng)制曲，不僅有較高的生產(chǎn)效率和較低生產(chǎn)成本，還能夠有效提高制曲環(huán)境的質(zhì)量，此外，豉香型白酒酒曲中除細(xì)菌微生物群落外，還含有豐富的真菌微生物群落，真菌同樣對(duì)發(fā)酵力、酯化力和液化力等表征指標(biāo)有著重要影響作用，細(xì)菌和真菌間的協(xié)同發(fā)酵作用最終決定了酒曲品質(zhì)，同時(shí)，機(jī)械制曲在原料中添加的麩皮可能更有利于好氧真菌的生長，在后續(xù)研究中可探究其中真菌微生物群落的演替情況，同時(shí)結(jié)合細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，以此更加全面地分析兩種制曲方式之間產(chǎn)生差異的原因。本研究通過分析對(duì)比兩種制曲方式的理化因子及細(xì)菌微生物等指標(biāo)間的差異，為豉香型白酒機(jī)械化制曲的發(fā)展及后續(xù)應(yīng)用提供一定參考意義。