基于大氣壓化學(xué)電離的GC-MS/MS法測定動物源性食品中8 種酰胺類除草劑殘留

楊志金，林彬彬，黃旭良，陳倩妮，林小蓮，藍(lán)燕珊

（廈門市食品藥品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，福建 廈門 361013）

酰胺類除草劑是一類具有R1(R2)—N—CO—R3結(jié)構(gòu)通式的除草劑，能除去一年生禾本科及若干闊葉雜草，廣泛用于大豆、玉米、花生、棉花的種植，具有除草譜廣、效果突出、施用方便、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，在全球除草劑市場中位列第三[1]。由于酰胺類除草劑水溶性較強(qiáng)、土壤吸附常數(shù)較低，容易通過滲透轉(zhuǎn)移到淺層地下水或隨雨水徑流進(jìn)入地表水，附著在土壤及沉積物中，再通過生物富集、積累和放大，對生態(tài)系統(tǒng)和人類健康產(chǎn)生危害[2]。

大氣壓化學(xué)電離（atmospheric pressure chemical ionization，APCI）是一種可產(chǎn)生較少碎片的“軟”電離技術(shù)，在液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜中已成熟應(yīng)用于弱極性和非極性化合物測定[3]。傳統(tǒng)的氣相色譜-電子電離串聯(lián)質(zhì)譜（gas chromatography-electron impact-tandem mass spectrometry，GC-EI-MS/MS）只能選擇目標(biāo)物的碎片離子，作為多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）的母離子。基于APCI的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GC-APCI-MS/MS）可產(chǎn)生目標(biāo)物的分子離子或準(zhǔn)分子離子，從而形成高選擇性和高靈敏度的MRM通道，為定性和定量分析提供理想的條件[4]。Van Bavel等[5]應(yīng)用于食品和環(huán)境樣品中二噁英的穩(wěn)定、精確定量，通過跨實(shí)驗(yàn)室比對發(fā)現(xiàn)可替代傳統(tǒng)的高分辨磁質(zhì)譜[6-7]，已獲得歐盟法規(guī)EU 2017/644[8]（食品）和EU 2017/771[9]（飼料）作為確證方法的認(rèn)可。耿霞等[10]應(yīng)用于改善食品和環(huán)境分析中10 種多溴聯(lián)苯和28 種多溴聯(lián)苯醚的定量和定性分析能力。Raro等[11-12]應(yīng)用于興奮劑控制分析中篩選和測定外源性合成代謝雄激素類固醇。郁歡歡等[13]應(yīng)用于蔬菜中農(nóng)藥殘留測定，23 種農(nóng)藥在0.01～20.00 μg/L范圍內(nèi)線性良好，該方法抗基質(zhì)干擾能力較強(qiáng)，具有良好的適用性。

動物源性食品基質(zhì)復(fù)雜，通常含有較高含量的磷脂、蛋白質(zhì)、油脂、糖類等內(nèi)源性干擾物，前處理多采用凝膠滲透色譜凈化[14-15]、固相萃取[16-17]、QuEChERS[18-19]。酰胺類除草劑測定多采用氣相色譜[20-21]、GC-MS[22-23]、GC-MS/MS[24-26]、液相色譜[27]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜[28-31]。目前，GC-APCI-MS/MS在農(nóng)藥殘留檢測中尚未推廣應(yīng)用，對酰胺類除草劑的檢測鮮見報(bào)道。本研究采用基于APCI的GC-MS/MS檢測技術(shù)，選擇增強(qiáng)型脂質(zhì)去除產(chǎn)品EMR-Lipid凈化，改進(jìn)氮吹濃縮轉(zhuǎn)換溶劑為溶劑稀釋，建立動物源性食品中甲草胺、乙草胺、丙草胺、丁草胺、敵草胺、吡唑草胺、二甲吩草胺、異丙甲草胺的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉、豬肝、雞蛋、牛奶 市售。

甲草胺、乙草胺、丙草胺、丁草胺、敵草胺、異丙甲草胺標(biāo)準(zhǔn)溶液 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所；吡唑草胺、二甲吩草胺標(biāo)準(zhǔn)溶液 德國Dr Ehrenstorfer公司；乙酸乙酯、乙腈（均為色譜純）德國Merck公司；QuEChERS萃取鹽包（含6 g無水硫酸鎂、1.5 g乙酸鈉）天津博納艾杰爾科技有限公司；EMRLipid dSPE凈化管（含1 g增強(qiáng)型脂質(zhì)去除材料）、EMRLipid Polish反萃管（含1.6 g NaCl、0.4 g無水MgSO4）、陶瓷均質(zhì)子 美國Agilent公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B-Xevo TQ-XS氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（配APCI源）美國Waters公司；GM 200刀式研磨儀 德國Retsch公司；Vortex 4 Basic渦旋混合器 德國IKA公司；CF15RN高速冷凍離心機(jī)日本Hitachi公司；Research plus單道手動可調(diào)移液器 德國Eppendorf公司；Milli-Q超純水發(fā)生器美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

DB-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣高純氦氣，恒定柱流量1.2 mL/min，進(jìn)樣口溫度280 ℃，脈沖不分流進(jìn)樣，脈沖壓力32 psi，持續(xù)時(shí)間1.2 min，柱箱溫度初始60 ℃保持1 min，以40 ℃/min升到170 ℃，再以10 ℃/min升到300 ℃保持3 min；色譜-質(zhì)譜接口溫度280 ℃，進(jìn)樣體積1 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

APCI源；正離子掃描；MRM掃描模式；離子源溫度150 ℃；電暈針電流0～3 min為20 μA，3 min后為8 μA；輔助氣（N2）流量400 L/h；錐孔氣（N2）流量0～3 min為0 L/h，3 min后為250 L/h；噴霧器壓力7.0 bar；碰撞氣（Ar）流量0.15 mL/min；色譜柱出口尾吹氣（N2）流量350 mL/min。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（1.0 mg/L）：將標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成10.0 mg/L的儲備液，儲存于－18 ℃，各取1.0 mL儲備液混合，用乙酸乙酯定容10 mL。

溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)溶液：吸取一定體積的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，用乙腈-乙酸乙酯溶液（1∶9，V/V）稀釋成質(zhì)量濃度為0.5～50.0 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液：吸取一定體積的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，用樣品前處理得到的溶液稀釋成質(zhì)量濃度為0.5～50.0 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.4 樣品的前處理

稱取5 g制備試樣，加入5 mL水（牛奶不加水）、10.0 mL乙腈及1 顆陶瓷均質(zhì)子，渦旋混合1 min，超聲提取10 min。加入QuEChERS萃取鹽包，渦旋混勻1 min，4 500 r/min離心10 min，吸取5 mL上清液加入預(yù)先用3 mL水活化的EMR-Lipid dSPE凈化管中，并放入1 顆陶瓷均質(zhì)子，渦旋振蕩1 min，將上述上清液倒入EMR-Lipid Polish反萃管并放入1 顆陶瓷均質(zhì)子，渦旋振蕩1 min，9 000 r/min低溫高速離心5 min，取上清液過微孔濾膜，按乙腈濾液-乙酸乙酯（1∶9，V/V）進(jìn)行混勻。

1.3.5 基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）評估

吸取一定體積混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，分別用乙酸乙酯和空白樣品前處理得到的溶液，配制系列梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液，由標(biāo)準(zhǔn)溶液得到的回歸方程斜率，ME計(jì)算公式如下：

ME＞0%為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，ME＜0%為基質(zhì)減弱效應(yīng)；|ME|＜20%為弱ME，20%≤|ME|≤50%為中等程度ME，|ME|＞50%為強(qiáng)ME。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采集和定性定量采用MassLynx V4.2 SCN982，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用Excel（2016版），圖像處理采用Origin 2018。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化

APCI的電離發(fā)生在大氣壓環(huán)境，由于電離室內(nèi)存在氮?dú)夥肿雍臀⒘克?，通過電暈針放電使化合物電離的過程出現(xiàn)2 種模式：電荷轉(zhuǎn)移M＋·和質(zhì)子化[M＋H]＋[32]。由于酰胺基—N—(C＝O)—中的氧原子有1 對孤對電子，可與氫質(zhì)子結(jié)合，容易產(chǎn)生[M＋H]＋峰，因此選擇質(zhì)子化模式。在優(yōu)化確定APCI離子源的電暈針電流、輔助氣流量、錐孔氣流量后，對錐孔電壓、特征子離子及其碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，選取響應(yīng)強(qiáng)度高、干擾小的2 對離子作為定量定性離子，建立MRM方法，優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)見表1，選擇離子色譜圖見圖1。

圖1 8 種酰胺類除草劑標(biāo)準(zhǔn)品的MRM色譜圖（10.0 μg/L）Fig.1 MRM chromatograms of eight amide herbicide standards(10.0 μg/L)

表1 8 種酰胺類除草劑的質(zhì)譜參數(shù)及保留時(shí)間Table 1 MS parameters and retention times of eight amide herbicides

2.2 前處理方法確定

有學(xué)者嘗試將QuEChERS應(yīng)用于動物源性食品的前處理[33-34]，通過增加乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠（ethylenediamine-N-propylsilane silica gel，PSA）和十八烷基鍵合硅膠（C18）用量，吸附提取液中的磷脂和脂肪類化合物。增強(qiáng)型脂質(zhì)去除產(chǎn)品EMR-Lipid是一種新型高聚物吸附材料[35]，與QuEChERS具有類似的操作流程。對樣品處理后的溶液進(jìn)行m/z50～500全掃描，考察吸附劑EMR-Lipid、50 mg/mL PSA＋50 mg/mL C18分別對豬肉、豬肝、雞蛋、牛奶的凈化效果。如圖2所示，4 種基質(zhì)在5～9 min的低沸點(diǎn)（＜200 ℃）雜質(zhì)較少，豬肉、豬肝在10～14 min的中等沸點(diǎn)（230～280 ℃）雜質(zhì)較多，雞蛋、牛奶在高于16 min的高沸點(diǎn)（＞300 ℃）較多，50 mg/mL PSA＋50 mg/mL C18對4 種基質(zhì)均起到一定的凈化效果，但EMR-Lipid材料的凈化效果更為顯著。因此，選用乙腈提取、EMR-Lipid材料凈化作為前處理方法。

圖2 EMR-Lipid與50 mg/mL PSA＋50 mg/mL C18的凈化效果對比Fig.2 Comparison of purification efficiency between EMR-Lipid and 50 mg/mL PSA+50 mg/mL C18

2.3 凈化后溶劑轉(zhuǎn)換優(yōu)化

樣品前處理使用乙腈提取后的溶液較為清澈，色素和油脂等共萃物較少，在鹽析作用下乙腈可與水分離。乙腈作為溶劑直接進(jìn)樣，會使弱極性氣相色譜柱的固定相加速流失，出現(xiàn)柱效下降、溶劑峰拖尾及色譜峰裂分等問題。因此需要將乙腈濃縮至干，再用弱極性或非極性溶劑復(fù)溶，這個(gè)過程容易造成目標(biāo)物的損失。為考察溶劑轉(zhuǎn)換過程中8 種酰胺類除草劑的損失，分別制備10 μg/L的豬肉、豬肝、雞蛋、牛奶基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1∶1∶1∶1（體積比）混合混勻，進(jìn)行氮吹濃縮至干，再用等體積乙酸乙酯溶液復(fù)溶，平行測定6 次計(jì)算平均回收率。如圖3所示，溶劑轉(zhuǎn)換過程對8 種酰胺類除草劑均造成一定的損失，平均回收率為64.1%～76.8%，個(gè)別平行樣的回收率低于60%，說明氮吹過程的回收率受氮吹操作、近干狀態(tài)判斷等影響，從而影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

圖3 8 種酰胺類除草劑經(jīng)溶劑轉(zhuǎn)換后的平均回收率Fig.3 Average recoveries of eight amide herbicides after solvent conversion

在滿足檢測靈敏度的前提下，研究使用溶劑稀釋代替溶劑轉(zhuǎn)換。比較GC進(jìn)樣常用的有機(jī)溶劑，正己烷與乙腈不互溶，丙酮可與乙腈互溶但與弱極性色譜柱的相容性較差，乙酸乙酯可與乙腈互溶且極性較弱，最終選擇用乙酸乙酯對乙腈凈化液進(jìn)行稀釋。溶劑稀釋代替溶劑轉(zhuǎn)換，可避免溶劑轉(zhuǎn)換造成的目標(biāo)物損失，簡化樣品前處理的流程提高效率，減少基質(zhì)進(jìn)樣量降低基質(zhì)干擾，但對分析儀器的靈敏度提出更高的要求。

2.4 ME評估

采用提取凈化后加標(biāo)法，配制質(zhì)量濃度為1.0、2.0、5.0、8.0、10.0 μg/L的溶劑標(biāo)準(zhǔn)液和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液，對8 種酰胺類除草劑在豬肉、豬肝、雞蛋、牛奶中的ME進(jìn)行考察。如表2所示，同一除草劑在不同動物源食品中的ME具有較大差異，4 種動物源性食品中的ME在－11%～12%之間，為弱ME，這可能是凈化后的稀釋操作，有利于降低或消除ME。

表2 8 種酰胺類除草劑在豬肉、豬肝、雞蛋、牛奶中的METable 2 Matrix effects of eight amide herbicides in pork,pig liver,eggs and milk %

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 方法的線性范圍、檢出限與定量限結(jié)果

配制質(zhì)量濃度為0.10～100 μg/L系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行測定，以質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并作線性回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程和線性范圍。如表3所示，8 種酰胺類除草劑在0.50～50 μg/L范圍內(nèi)線性良好，R2＞0.99。在空白樣品中添加8 種酰胺類除草劑，以RSN=3確定檢出限，以RSN=10確定定量限，檢出限為0.029～1.3 μg/kg，定量限為0.095～4.2 μg/kg。

表3 8 種酰胺類除草劑的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 3 Linear equations,correlation coefficients,LODs and LOQs for eight amide herbicides

為比較GC-APCI-MS/MS測定8 種酰胺類除草劑的優(yōu)勢，采用傳統(tǒng)的GC-EI-MS/MS測定作對比，色譜條件與GC-APCI-MS/MS相同，質(zhì)譜參數(shù)來自GB 23200.113—2018《植物源性食品中208 種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測定 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》[36]。如圖4所示，GC-EI-MS/MS測定的定量限均高于GC-APCI-MS/MS，兩者的比值達(dá)到4.62～310，說明GC-APCI-MS/MS具有更高的檢測靈敏度，超出的靈敏度空間允許前處理對樣品進(jìn)行稀釋，為凈化后的溶劑稀釋代替溶劑轉(zhuǎn)換提供靈敏度保障。

2.5.2 方法的回收率與精密度結(jié)果

采用樣品添加法，在豬肉、豬肝、雞蛋、牛奶的空白樣品中，分別添加不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，制成低（10 μg/kg）、中（20 μg/kg）、高（100 μg/kg）3 個(gè)水平的加標(biāo)樣品，每個(gè)添加水平重復(fù)6 次，基質(zhì)匹配外標(biāo)法計(jì)算平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），考察方法的回收率與精密度。如表4所示，8 種酰胺類除草劑在4 種動物源性食品中的加標(biāo)回收率和RSD分別為63.3%～108%和2.51%～13.8%，方法具有較好的回收率和重復(fù)性。

表4 8 種酰胺類除草劑在4 種動物源性食品中的加標(biāo)回收率和精密度Table 4 Spiked recoveries and precision of eight amide herbicides in four animal-derived foods

2.5.3 實(shí)際樣品分析結(jié)果

隨機(jī)購買市售豬肉、牛肉、羊肉、兔肉、雞肉、鴨肉、豬肝、豬腎、魚肉、蝦肉、蟹肉、花蛤、雞蛋、牛奶、蜂蜜、蜂王漿各1 份，應(yīng)用本方法測定8 種酰胺類除草劑，樣品中均未檢出。

3 結(jié)論

本研究建立基于大氣壓化學(xué)電離的GC-MS/MS法，測定動物源性食品中甲草胺、乙草胺、丙草胺、丁草胺、敵草胺、吡唑草胺、二甲吩草胺、異丙甲草胺殘留。采用乙腈提取、EMR-Lipid材料凈化的前處理方法，去除提取液中的磷脂和脂質(zhì)，使用乙酸乙酯稀釋乙腈凈化液，避免溶劑轉(zhuǎn)換造成的目標(biāo)物損失。在豬肉、豬肝、雞蛋、牛奶中進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證和ME評估，方法的準(zhǔn)確度和精密度較好，ME弱。該方法可簡便、高效、準(zhǔn)確、靈敏地適用于動物源性食品中8 種酰胺類除草劑的快速定量測定。