快速濾過型凈化結(jié)合液相色譜-蒸發(fā)光散射法檢測茶葉中5 種糖類成分

董曉倩，白春蓉，蘭 韜，田 旭，祁 娟，王 翠，丁 潔，劉松南,*

（1.北京食品科學(xué)研究院北京市茶葉質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站，北京 100162；2.國家茶葉產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測中心（四川），四川 雅安 625300；3.中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院，北京 100191）

茶葉是以茶樹鮮葉為原料采用特定工藝加工而成的產(chǎn)品，因原料和工藝特點(diǎn)茶葉本身含有一定的糖類成分。茶葉中的可溶性糖類成分主要有果糖、葡萄糖、蔗糖等，這些糖類成分是茶湯中主要的甜味來源，對茶湯的滋味及品質(zhì)起重要作用，有助于形成各品種各等級茶葉固有的感官品質(zhì)特征[1]。在茶葉加工過程中人為添加蔗糖等糖類成分能夠改善茶葉的口感、提升干茶的光澤度和緊結(jié)度，從而虛假提升茶葉的品質(zhì)，還能增加茶葉的質(zhì)量。不法生產(chǎn)廠家正是抓住這些特點(diǎn)，在茶葉加工過程中通過加糖達(dá)到以次充好、增加質(zhì)量進(jìn)而牟利的目的[2]。根據(jù)GB/T 30766—2014《茶葉分類》的規(guī)定，茶葉產(chǎn)品不得含有任何添加物[3]。人為加糖不僅擾亂了傳統(tǒng)茶葉市場，讓守法廠商處于被動境地。同時(shí)，由于蔗糖等糖類易吸潮、易變質(zhì)和易滋生細(xì)菌等特點(diǎn)，人為的加糖對茶葉質(zhì)量安全也有較大的隱患。因此，茶葉中的糖類含量分析是茶葉品質(zhì)管理的必要手段。

因果糖、葡萄糖、蔗糖等糖類成分不屬于食品添加劑[4]，不在我國茶葉食品質(zhì)量和安全標(biāo)準(zhǔn)的控制范圍內(nèi)，我國也沒有適用于茶葉中這些糖類成分的檢測方法，這導(dǎo)致茶葉中添加糖類成分的摻假行為長期不受行業(yè)監(jiān)管，不法加糖行為不被查處，合法廠商的正當(dāng)權(quán)益長期受到侵犯，消費(fèi)者的知情權(quán)和健康權(quán)利得不到保障。為確保茶葉中糖類成分含量在正常、合理范圍內(nèi)，需要開發(fā)適用于茶葉中主要糖類成分的準(zhǔn)確定量檢測方法，獲取茶葉中主要糖類成分的含量數(shù)據(jù)。

目前，糖類成分的檢測主要有薄層色譜法[5]、酶法、液相色譜-蒸發(fā)光散射法/示差折光檢測法/電霧式檢測法[6-8]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[9-10]、氣相色譜法[11-12]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[13]、毛細(xì)管電泳法[14-15]等。其中，薄層色譜法多用于定性及半定量分析，精密度和準(zhǔn)確度較差；酶法能檢測的糖類有限，不能同時(shí)檢測多種糖成分；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和毛細(xì)管電泳法需要柱前衍生，操作復(fù)雜、重復(fù)性差[16]；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法操作簡便、選擇性好，但是設(shè)備昂貴，檢測成本高。液相色譜-示差折光檢測法操作簡便、適用范圍廣，但是檢測結(jié)果易受溫度、流速等影響，且對梯度洗脫適應(yīng)性較差。蒸發(fā)光散射檢測器是一種質(zhì)量型檢測器，用于無紫外吸收或者紫外末端吸收的大分子物質(zhì)的定性定量檢測，適合用于糖類成分的定量分析測定。

在對茶葉中糖類成分的檢測研究中，大多為用水提取后直接上機(jī)分析，對其凈化的研究較少[17-18]。GB 5009.8—2016《食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測定》第一法（高效液相色譜法）中也沒有凈化步驟，其適用范圍也沒有茶葉這一食品類別[19]。而茶葉的水提物中含有大量的干擾物質(zhì)，如果不進(jìn)行凈化將會嚴(yán)重影響色譜柱壽命及儀器系統(tǒng)，因此凈化步驟對于茶葉樣品前處理非常重要?？焖贋V過型凈化（multi-plug filtration cleanup，m-PFC）技術(shù)是在QuEChERS凈化基礎(chǔ)之上進(jìn)一步簡化形成的一種快速新型的凈化技術(shù)，操作簡便、快速，便于機(jī)械化，前處理效率高，廣泛應(yīng)用于農(nóng)殘檢測的凈化[20-22]，目前鮮見該方法應(yīng)用在糖類成分檢測過程中。

聚酰胺粉是由酰胺基單體聚合而成的高分子聚合物，具有比表面積大、吸附性良好等特點(diǎn)，目前已應(yīng)用于天然有機(jī)苷原、黃酮類、多酚類等成分的提取[23-25]，但將聚酰胺粉作為糖類成分檢測的凈化材料尚鮮見文獻(xiàn)報(bào)道?？紤]到茶葉中含有大量的茶多酚、黃酮等成分，在糖類檢測過程中這些成分會隨著提取溶劑進(jìn)入提取液中干擾檢測，需要進(jìn)行凈化。聚酰胺粉因具有吸附前述成分的功效，有作為凈化吸附劑的可能性。

本實(shí)驗(yàn)擬結(jié)合m-PFC前處理手段，考察聚酰胺粉作為凈化吸附劑填料的可能性，建立液相色譜-蒸發(fā)光散射法同時(shí)檢測茶葉中5 種可溶性糖類成分的方法，以期為茶葉中糖類成分的準(zhǔn)確定量檢測以及摻雜糖類現(xiàn)象的監(jiān)督監(jiān)管提供技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶葉（綠茶、白茶、花茶、紅茶、烏龍茶、普洱茶各30 個(gè)），包括吳裕泰、正興德、京華、張一元、七彩云南、八馬、憶江南、福茗源、天福、中茶10 個(gè)品牌。

鼠李糖（純度98%）、果糖（純度99%）、葡萄糖（純度98%）、蔗糖（純度99%）、麥芽糖（純度98%）上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；乙腈（色譜純）西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；聚酰胺粉（100～200 目，經(jīng)改性處理）、N-丙基乙二胺（N-propylethylenediamine，PSA）（40～60 μm）、多壁碳納米管（multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs）（10～20 nm）、石墨化碳黑（graphitized carbon black，GCB）（120～400 目）、m-PFC凈化柱管 北京科德諾思技術(shù)有限公司；實(shí)驗(yàn)用水由Milli-Q純水機(jī)（0.22 μm過濾膜，美國Millipore公司）制得。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A液相色譜儀（配有蒸發(fā)光散射檢測器）、AEL200分析天平（感量0.1 mg）、UV-2600紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；JJ500電子天平（感量0.01 g）常熟雙杰測試儀器廠；KQ-250B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；H1650高速臺式離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液：準(zhǔn)確稱取鼠李糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖1.000 0 g分別至10 mL容量瓶中，用10%乙腈溶液定容至刻度，混勻，配制成質(zhì)量濃度為100 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液，4 ℃冰箱冷藏保存，有效期為1 個(gè)月。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確吸取5 種糖類成分標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液各1.00 mL于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，混勻，配制成質(zhì)量濃度10.0 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，4 ℃冰箱冷藏保存，有效期為7 d。

1.3.2 提取

取茶葉樣品經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過80 目篩，裝袋密封保存，備用。

稱取上述茶葉粉末1 g（精確至0.001 g）于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入20.0 mL水旋渦提取1 min，靜置提取10 min，期間振搖一次。向上述溶液中加入10 mL二氯甲烷，旋渦混勻1 min，靜置5 min后再次旋渦1 min，于3 500 r/min離心10 min，收集上層溶液，待凈化。

1.3.3 凈化

將m-PFC柱管下接0.22 μm有機(jī)微孔濾膜，吸取前述上層溶液1.00 mL移入m-PFC柱管內(nèi)，安裝注射桿并緩慢推動，控制流出速率1 滴/s，同時(shí)直接收集凈化液于進(jìn)樣瓶中，上機(jī)分析。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：迪科瑪Polyamino HILIC 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），配備相應(yīng)保護(hù)柱；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積10 μL；流動相：水和乙腈；梯度洗脫程序見表1。流速1.0 mL/min；漂移管溫度70 ℃；氮?dú)鈮毫?50 kPa。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.3.5 提取液及凈化液中茶多酚、游離氨基酸、咖啡堿、黃酮含量的測定

提取液及凈化液中茶多酚、游離氨基酸、咖啡堿含量的測定分別按照GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》、GB/T 8314—2013《茶 游離氨基酸總量的測定》、GB/T 8312—2013《茶 咖啡堿測定》進(jìn)行測定；黃酮含量參照何書美等[26]的方法進(jìn)行測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

圖譜采集及數(shù)據(jù)定量分析采用Lab Solution數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)及Excel進(jìn)行，圖像處理采用Origin 8.0進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

GB 5009.8—2016第一法對糖類成分的分析采用乙腈-水（70∶30，V/V）等度洗脫的方式，本實(shí)驗(yàn)首先采用該方法進(jìn)行糖類成分的分析，結(jié)果表明5 種糖混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液能夠達(dá)到基線分離、分離效果較好，但是當(dāng)采用該條件分析烏龍茶實(shí)際樣品時(shí)，在蔗糖峰附近存在1 個(gè)干擾峰（圖1a），影響其準(zhǔn)確定量。當(dāng)采用梯度洗脫時(shí)，干擾峰與蔗糖峰達(dá)到基線分離（圖1b），滿足分析要求，因此本實(shí)驗(yàn)采用梯度洗脫的方式對糖類成分進(jìn)行分析，梯度洗脫程序見表1，5 種糖類成分的色譜圖見圖1c。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液及烏龍茶樣品中糖類成分色譜圖Fig.1 Chromatograms of saccharides in standard solution and oolong tea samples

2.2 提取條件的優(yōu)化

2.2.1 提取方式的選擇

實(shí)驗(yàn)比較振蕩提取法、加熱提取法和超聲輔助提取法對5 種糖類成分的提取效率，結(jié)果表明采用3 種不同的方式提取時(shí)，回收率沒有顯著差異。采用振蕩提取方法簡便、易于操作，因此本實(shí)驗(yàn)選取振蕩提取進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 提取溶劑的選擇

研究表明有機(jī)溶劑乙腈的存在會減少提取液中雜質(zhì)的含量[27]，利于后續(xù)的凈化操作，但其對糖類成分提取效率的影響不得而知。本實(shí)驗(yàn)以白茶為例，向其添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的5 種糖，通過回收率考察提取溶液中水/乙腈比例（0%、30%、50%、70%、100%）對糖類成分提取效果的影響。結(jié)果表明，隨著提取溶液中乙腈比例的減少，糖類成分的提取回收率不斷增加，當(dāng)用純水提取時(shí)，5 種糖的回收率最高（圖2），表明乙腈的存在雖然會減少雜質(zhì)的溶出，但是會影響糖類成分的提取效率，因此本實(shí)驗(yàn)選取用純水進(jìn)行提取。

圖2 提取溶液中水/乙腈的比例對5 種糖分回收率的影響Fig.2 Effect of solvent composition,water/acetonitrile ratio on the recoveries of five saccharides

采用純水提取時(shí)，提取溶液中的雜質(zhì)較多，不利于后續(xù)的凈化，因此本實(shí)驗(yàn)首先采用有機(jī)試劑反萃取的方式去除提取液中部分雜質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)比較了在水中溶解度較低的乙酸乙酯（8.3 g/100 mL、20 ℃）、二氯甲烷（1.3 g/100 mL、20 ℃）作為反萃溶劑的除雜效果。結(jié)果表明，乙酸乙酯和二氯甲烷都能夠明顯去除提取液中的色素成分，且不會影響待測糖類成分的回收率?？紤]到乙酸乙酯在水中溶解度更大，影響提取溶液的體積，同時(shí)密度比水小，會在提取液的上層，不利于后續(xù)步驟中提取液的取出，因此本實(shí)驗(yàn)選取二氯甲烷作為反萃溶劑進(jìn)行凈化。

2.2.3 提取次數(shù)的選擇

按照1.3.2節(jié)的方法分別提取1、2、3 次，凈化后上機(jī)分析，考察提取次數(shù)對提取效率的影響。結(jié)果表明在提取第一次時(shí)5 種糖的回收率均在98%以上，滿足分析要求，因此本實(shí)驗(yàn)選擇提取一次進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 凈化條件的優(yōu)化

茶葉提取液中主要的雜質(zhì)成分為茶多酚、色素、生物堿等，如不進(jìn)行凈化處理會對色譜柱、檢測器等儀器系統(tǒng)造成很大的污染。因此本實(shí)驗(yàn)首先考察聚酰胺粉和PSA的用量對茶葉提取液中雜質(zhì)的去除效果。

在凈化過程中，最常用的凈化劑有MWCNTs、GCB、C18、PSA等。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果表明，C18對去除茶葉提取液中雜質(zhì)效果甚微[28]，因此本實(shí)驗(yàn)不再考察C18對雜質(zhì)的吸附效果。聚酰胺粉是一種由酰胺基單體聚合而成的高分子化合物，內(nèi)含的酰胺鍵能夠與醌類、酚類、硝基類化合物形成氫鍵而具有吸附作用[29]，理論上而言對于茶葉提取液中雜質(zhì)成分具有吸附作用。本實(shí)驗(yàn)考察MWCNTs、GCB、PSA、聚酰胺粉作為凈化劑使用的可能性。

2.3.1 凈化劑對5 種糖吸附效果評價(jià)

在考察凈化劑去除雜質(zhì)的效果前，首先考察不同吸附劑對目標(biāo)物的吸附能力，以確保凈化劑在去除雜質(zhì)的同時(shí)，不會影響待測化合物的回收率。將質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的5 種糖混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別經(jīng)200 mg聚酰胺粉、GCB、MWCNTs、PSA直接凈化后上機(jī)檢測，考察4 種凈化劑對5 種糖的吸附效果。結(jié)果表明，聚酰胺粉和PSA對5 種糖吸附效果不明顯，MWCNTs和GCB對5 種糖呈現(xiàn)不同程度的吸附作用，尤其是對蔗糖和麥芽糖的吸附效果極為明顯（圖3a）。分別稱取不同質(zhì)量的MWCNTs和GCB凈化劑，制備成m-PFC凈化柱，按照前述操作進(jìn)行凈化，考察不同質(zhì)量的兩種凈化劑對糖類成分的吸附能力，結(jié)果見圖3b、c。由圖3可知，當(dāng)用量為15 mg時(shí)，MWCNTs和GCB已經(jīng)對單糖（鼠李糖、果糖、葡萄糖）產(chǎn)生了吸附作用，對于雙糖（蔗糖、麥芽糖）的吸附更為嚴(yán)重，不具備作為糖類成分檢測時(shí)凈化劑的能力，因此本實(shí)驗(yàn)僅選取聚酰胺粉和PSA進(jìn)行后續(xù)研究。

圖3 凈化劑對5 種糖類成分回收率的影響Fig.3 Effects of sorbents on the recoveries of five saccharides

2.3.2 凈化劑對雜質(zhì)去除效果評價(jià)

由圖4可知，除了游離氨基酸外，聚酰胺粉對茶多酚、咖啡因和黃酮的去除效果明顯優(yōu)于PSA。當(dāng)采用200 mg聚酰胺粉進(jìn)行凈化時(shí)，能夠去除80%以上的大分子多酚和黃酮類物質(zhì)。選取水提物顏色最深的普洱熟茶作為研究對象，考察不同用量的聚酰胺粉和PSA對色素去除的效果。由圖5可以發(fā)現(xiàn)，PSA對于色素類物質(zhì)的去除幾乎沒有作用。而隨著聚酰胺粉用量的增加，凈化液的顏色逐漸變淺，且澄清透明，表明聚酰胺粉對于去除茶葉水提物中的色素具有很好的效果?？紤]到PSA對于茶葉水提液的凈化效果較差，同時(shí)過多的凈化劑不利于凈化液的獲得，本研究最終僅選用聚酰胺粉一種凈化劑，用量200 mg進(jìn)行后續(xù)的凈化實(shí)驗(yàn)。將聚酰胺粉填裝至m-PFC柱管制成凈化柱后分別對6 類茶葉提取液進(jìn)行凈化，結(jié)果表明僅有花茶、普洱茶凈化后仍有些許顏色外，其他茶葉提取液均無色澄清透明，凈化效果較好（圖6）。

圖4 聚酰胺粉和PSA對雜質(zhì)去除效果評價(jià)Fig.4 Evaluation of removal efficiency of polyamide powder and PSA on interfering components

圖5 聚酰胺粉及PSA用量對普洱茶色素去除效果Fig.5 Effect of different amounts of polyamide powder and PSA on pigment removal from Pu’er tea

圖6 6 種不同茶葉凈化前后比較Fig.6 Comparison of six different tea samples before and after purifciation

2.4 線性關(guān)系、檢出限（limits of detection，LOD）及定量限（limits of quantification，LOQ）

準(zhǔn)確配制鼠李糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以質(zhì)量濃度的常用對數(shù)為橫坐標(biāo)、峰面積的常用對數(shù)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。當(dāng)鼠李糖質(zhì)量濃度為10.00 mg/mL，果糖質(zhì)量濃度為2.00 mg/mL，葡萄糖、蔗糖、麥芽糖質(zhì)量濃度為5.00 mg/mL時(shí)，出現(xiàn)平頭色譜峰，蒸發(fā)光散射檢測器響應(yīng)值達(dá)到飽和，分別稀釋至9.50、1.50、4.50 mg/mL后得到良好色譜峰。以信噪比等于3時(shí)所對應(yīng)的糖質(zhì)量濃度為儀器的LOD，得出鼠李糖的LOD為0.05 mg/mL，果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖的LOD為0.02 mg/mL。綜上，鼠李糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖的線性范圍分別為0.05～9.50、0.02～1.50、0.02～4.50、0.02～4.50、0.02～4.50 mg/mL。在其相應(yīng)的線性范圍內(nèi)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)以信噪比3和10分別作為方法的LOD和LOQ，結(jié)果見表2。峰面積對數(shù)與其質(zhì)量濃度對數(shù)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)大于0.99，LOD為0.04～0.1 g/100 g，LOQ為0.10～0.20 g/100 g。

表2 5 種糖類成分的線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、LOD及LOQTable 2 Linear ranges,regression equations,correlation coefficients,LODs and LOQs of five saccharides

2.5 回收率及精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

選取已準(zhǔn)確測定各糖含量的綠茶樣品（其中蔗糖含量為1.0 g/100 g，鼠李糖含量小于0.10 g/100 g，果糖、葡萄糖、麥芽糖含量均小于0.04 g/100 g），然后按照蔗糖添加0.50、1.0、1.5 g/100 g（0.5、1、1.5 倍本底），其余4 種糖添加0.10、1.0、10 g/100 g三個(gè)水平進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，進(jìn)樣濃度超出線性范圍時(shí)進(jìn)行適當(dāng)稀釋，每個(gè)添加量做6 次平行，扣除本底含量后分別計(jì)算回收率。表3表明，5 種糖類成分在3 個(gè)水平的平均加標(biāo)回收率范圍為91.0%～103%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0%～4.6%，滿足分析要求。

表3 5 種糖類成分的加標(biāo)回收及精密度實(shí)驗(yàn)Table 3 Recoveries and precision RSDs of five saccharides

2.6 與國標(biāo)方法結(jié)果的比較

參照國標(biāo)方法不進(jìn)行凈化直接上機(jī)分析，進(jìn)樣100 針后，柱壓明顯升高（由6 MPa升至10 MPa），說明有較多雜質(zhì)殘留在柱頭上。而本方法凈化去除了大部分雜質(zhì)，上機(jī)溶液澄清透明（圖6），進(jìn)樣100 針后柱壓無明顯變化，說明本方法明顯延長了色譜柱的使用壽命。同時(shí)，本方法凈化步驟簡單、操作方便、易于通過批量化操作提高前處理效率。

2.7 實(shí)際樣品檢測結(jié)果

隨機(jī)選取180 個(gè)茶葉樣品（綠茶、白茶、花茶、紅茶、烏龍茶、普洱茶各30 個(gè)），按照本實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行糖類成分的檢測，結(jié)果表明，不同茶葉中糖類成分各有不同，鼠李糖和麥芽糖的含量最低，所分析樣品中均未檢出，果糖、葡萄糖、蔗糖均有不同程度的檢出，其中果糖含量范圍為0.04～0.55 g/100 g，葡萄糖含量范圍為0.04～0.60 g/100 g，蔗糖含量范圍為0.04～6.14 g/100 g，說明果糖、葡萄糖和蔗糖在茶葉中普遍存在，含量差異較大。對于茶葉中是否添加蔗糖，需進(jìn)行進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)合m-PFC技術(shù)和液相色譜-蒸發(fā)光散射法，建立茶葉中鼠李糖等5 種糖類成分的檢測方法。相較于其他檢測方法，本方法創(chuàng)新使用了聚酰胺粉作為凈化材料，開發(fā)了適用于茶葉中5 種糖類成分檢測的m-PFC凈化小柱。相較于傳統(tǒng)的GCB、MWCNTs固相萃取柱，本小柱價(jià)格低廉、操作簡便快速、便于批量化實(shí)驗(yàn)。凈化步驟減少了上機(jī)溶液中的雜質(zhì)，較大限度地延長色譜柱使用壽命，保護(hù)液相色譜流路系統(tǒng)。方法的線性、回收率及精密度等符合理化檢驗(yàn)要求[30]，為茶葉中糖類成分的精確定量及是否添加了糖類成分預(yù)測提供了可靠技術(shù)手段。