• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    同位素稀釋-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定雞蛋中硝基咪唑類藥物及其代謝物

    2023-12-14 12:45:54邱肖依王冬梅李佳寬王夢穎管卓龍盧躍鵬涂鳳琴
    食品科學 2023年22期
    關鍵詞:咪唑類硝基內標

    邱肖依,王冬梅,李佳寬,許 晴,王夢穎,管卓龍,盧躍鵬,涂鳳琴

    (武漢食品化妝品檢驗所,國家市場監(jiān)管重點實驗室(食用油質量與安全),湖北 武漢 430040)

    硝基咪唑類藥物是一類含有5 位硝基取代咪唑雜環(huán)結構的化合物。甲硝唑(metronidazole,MNZ)、洛硝噠唑(ronidazole,RNZ)、地美硝唑(dimetridazole,DMZ)和異丙硝唑(ipronidazole,IPZ)是常見的硝基咪唑類藥物,羥基甲硝唑(metronidazole-OH,MNZOH)、羥基異丙硝唑(ipronidazole-O H,IPZOH)和羥甲基甲硝咪唑(1-methyl-2-hydroxymethyl-5-nitroimidazole,HMMNI)分別是MNZ、IPZ、DMZ和RNZ的代謝物。硝基咪唑類藥物被廣泛用于治療畜禽的滴蟲病、厭氧菌感染等疾病[1],有不法商家將其添加到飼料中可提高飼料的轉化率,增加動物的體質量。由于MNZ、RNZ、DMZ等含有硝基雜環(huán)的化合物具有潛在致癌、致畸作用[2],歐盟理事會將其列入A類禁用藥物,不得在任何食品中檢出[3-4],2002年我國農業(yè)部第193號公告和國家藥品監(jiān)督管理局第227號公告中規(guī)定,甲硝唑、地美硝唑及其鹽、酯及制劑不允許以促進動物生長為目的在所有食品動物中使用。GB 31650—2019《食品中獸藥最大殘留限量》[5]明確規(guī)定地美硝唑、甲硝唑允許作治療作用,但是不得在動物食品中檢出。2019年我國農業(yè)農村部第250號公告明確規(guī)定食品動物中禁止使用洛硝達唑和替硝唑。雞蛋是我國居民日常膳食中極為重要的營養(yǎng)食物,其質量安全事關人民群眾身體健康。在日常監(jiān)督抽檢工作中發(fā)現(xiàn),蛋雞的養(yǎng)殖過程存在使用硝基咪唑類藥物的情況,雞蛋中檢出硝基咪唑類藥物的現(xiàn)象時有發(fā)生,因此有必要開發(fā)硝基咪唑類藥物的快速檢測方法,進一步提高雞蛋質量安全風險監(jiān)測水平。

    目前報道的檢測硝基咪唑類藥物的測定方法主要有液相色譜法[6-10]、氣相色譜-質譜聯(lián)用法[11]、液相色譜-串聯(lián)質譜法[2-3,12-19]。對比3 種檢測方式,液相色譜法存在靈敏性不高、無法準確定性的缺點;氣相色譜-質譜聯(lián)用法前處理過程通常需要衍生化,且RNZ和HMMNI衍生產物相同,氣相色譜-質譜聯(lián)用法無法對兩者區(qū)分;液相色譜-串聯(lián)質譜法由于其靈敏度高、選擇性好、無需衍生化,在復雜基質樣品硝基咪唑類藥物的分析檢測中應用最為廣泛。我國現(xiàn)行有效的動物性食品中硝基咪唑類藥物的檢測標準主要包括GB 31658.23—2022《動物性食品中硝基咪唑類藥物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質譜法》[20]和GB/T 21318—2007《動物源食品中硝基咪唑殘留量檢驗方法》[21],前者規(guī)定了對豬牛羊和雞的肌肉和肝腎中MNZ、MNZOH、DMZ和HMMNI殘留量進行測定,后者的適用范圍包括豬雞牛的肌肉和肝腎、魚肉、奶粉和蜂蜜,兩者的測定范圍均不包含雞蛋。雞蛋中硝基咪唑類藥物的檢測方法主要參照SN/T 2624—2010《動物源性食品中多種堿性藥物殘留量的檢測方法》[22],而該方法凈化過程使用兩個固相萃取柱,前處理操作較繁瑣。當前,大部分文獻采用固相萃取法對提取液進行富集和凈化[6-9,12,15-16,23-24]。張麗媛等[15]建立液相色譜-串聯(lián)質譜法測定雞肉及雞蛋樣品中3 種硝基咪唑類藥物,PCX固相萃取柱凈化,定量限為5 μg/kg。Xia Xi等[23]采用SCX小柱對樣品進行富集凈化,結合超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定豬腎中硝基咪唑類藥物及其代謝物。馬東杰等[24]對比了PCX、MCX、SCX三種陽離子固相萃取柱對硝基咪唑類化合物的凈化效果,發(fā)現(xiàn)DMZ的平均回收率在50%左右,IPZ的平均回收率小于10%,使用HLB凈化IPZ的平均回收率也不到10%,使用PRiME HLB固相萃取柱MNZ、RNZ、IPZ、DMZ的平均回收率均達到70%以上。固相萃取柱的使用通常需活化、上樣、淋洗、洗脫,過程耗時,凈化過程中目標物流失、洗脫不完全等原因都會對實驗的回收率產生不利影響,且使用成本高。近年來,QuEChERS作為一種快速、簡單、廉價、高效、安全的前處理技術,在動物性食品獸藥殘留檢測中應用較為廣泛[10,14,25-26,29-31]。

    本研究經(jīng)過實驗對比,采用十八烷基鍵合硅膠(C18)作為凈化吸附劑,基于改良的QuEChERS技術結合同位素稀釋-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜,建立了一種同時測定雞蛋中硝基咪唑類藥物及其代謝物殘留的分析方法。該方法操作簡便、定量結果準確、靈敏度高,使用弗帕斯檢測實驗室能力驗證(food analysis performance assessment scheme,F(xiàn)APAS)對樣品進行驗證,具有良好的準確度和精密度,適用于大批量樣品的快速測定。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    硝基咪唑類化合物及內標(100 mg/L)(MNZ、RNZ、DMZ、IPZ、MNZOH、HMMNI、IPZOH、RNZ-D3、DMZ-D3、IPZ-D3、MNZOH-D2、HMMNI-D3、IPZOH-D3)北京曼哈格生物科技有限公司;乙腈(色譜純)德國Merck公司;甲酸(色譜純)上海阿拉丁生化科技股份有限公司;Oasis PRiME HLB固相萃取小柱(200 mg/6 mL)美國Waters公司;CNWBOND HC-C18SPE填料(40~63 μm)上海安譜科學儀器有限公司;水為Milli-Q系統(tǒng)制備的超純水(18.2 MΩ·cm)。

    2022年FAPAS雞蛋中硝基咪唑類藥物的測定能力驗證樣品(產品編號FCVD13-EGG2)由英國食品與環(huán)境研究院提供。

    1.2 儀器與設備

    Q-TRAP 6500質譜儀(配電噴霧電離Turbo V離子源)美國AB SCIEX公司;LC 30A液相色譜儀日本Shimadzu公司;Allegra X-15R離心機 美國Beckman公司;Vortex-Genie 2渦旋振蕩儀 美國SCND公司;PM5-2000TL超聲波清洗器 普律瑪儀器公司;N-EVAP水浴氮吹儀 美國OA公司;ME204電子天平 瑞士梅特勒-托利多公司。

    1.3 方法

    1.3.1 色譜條件

    色譜柱:Agilent Eclipse Plus C18柱(150 mm×2.1 mm,1.8 μm);柱溫:40 ℃;進樣量:2 μL,流動相:A為0.1%(體積分數(shù))甲酸溶液,B為乙腈;流速:0.3 mL/min;梯度洗脫程序:0~1.0 min,90.0% A、10.0% B;1.0~3.0 min,90.0%~40.0% A、10.0%~60.0% B;3.0~3.5 min,40.0%~10.0% A、60.0%~90.0% B;3.50~6.01min,10.0% A、90.0% B;6.01~ 6.02 min,10.0%~90.0% A、90.0%~10.0% B;6.02~9.00 min,90.0% A、10.0% B。

    1.3.2 質譜條件

    離子源:電噴霧電離(electronspray ionization,ESI)正離子模式;檢測方式:多反應監(jiān)測(multiple reaction monitoring,MRM)模式;離子源溫度500 ℃,電噴霧電壓5 000 V;氣簾氣壓力275.79 kPa;霧化氣壓力379.21 kPa;輔助加熱氣壓力379.21 kPa;碰撞氣體Medium。其他質譜參數(shù)見表1。

    表1 硝基咪唑類藥物及代謝物質譜采集參數(shù)Table 1 MS parameters for 5-nitroimidazoles and their metabolites

    1.3.3 標準工作溶液的配制

    標準溶液的制備:準確移取1 mL的RNZ、MNZ、IPZ、DMZ、MNZOH、HMMNI、IPZOH標準物質至10 mL棕色容量瓶中,用甲醇稀釋,配制成10 mg/L的混合標準儲備液。準確移取上述硝基咪唑類混合標準儲備液1 mL至100 mL棕色容量瓶中,用甲醇稀釋并定容至刻度,配制質量濃度為100 ng/mL的硝基咪唑類混合標準中間溶液。準確移取1 mL的RNZ-D3、DMZ-D3、IPZ-D3、MNZOH-D2、HMMNI-D3、IPZOH-D3標準物質,用甲醇溶解配制成10 mg/L的硝基咪唑類混合內標儲備液。準確移取硝基咪唑類混合內標標準儲備液1 mL至100 mL棕色容量瓶中,用甲醇稀釋并定容至刻度,配制質量濃度為100 ng/mL的混合內標標準中間溶液。

    取適量硝基咪唑類混合標準中間液、硝基咪唑類混合內標標準中間液,用體積分數(shù)10%乙腈溶液配制成0.5~20 ng/mL、內標質量濃度為5 ng/mL的工作曲線。

    1.3.4 試樣制備

    新鮮雞蛋洗凈后去殼,用組織勻漿機攪拌均勻,置于聚乙烯瓶中,于-20 ℃儲存。

    1.3.5 提取

    準確稱取2.0 g(精確到0.01g)混勻后的樣品,加入100 μL 100 ng/mL的硝基咪唑類混合內標標準中間溶液,再加入10 mL乙腈和1 g NaCl渦旋混合10 min,超聲10 min,以4 500 r/min離心5 min,上清液待凈化。

    1.3.6 凈化

    取5.0 mL上述提取液,加入400 mg C18,渦旋2 min,以4 500 r/min離心5 min,取全部上清液加入2mL乙腈飽和正己烷,渦旋1 min,4 500 r/min離心5 min,棄去正己烷層,于40 ℃氮吹干,加入1.0 mL 10%(體積分數(shù))乙腈溶液復溶,過0.22 μm有機濾膜,待測。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    采用Analyst軟件(AB SCIEX公司)對研究的硝基咪唑類藥物進行超高效液相色譜-串聯(lián)質譜分析、數(shù)據(jù)采集和處理,采用Microsoft Excel進行統(tǒng)計計算和圖表繪制。

    2 結果與分析

    2.1 儀器條件優(yōu)化

    2.1.1 質譜參數(shù)優(yōu)化

    使用流動注射泵以恒流方式進樣,分別將質量濃度為100 ng/mL的7 種硝基咪唑類化合物的標準溶液,以及氘代內標標準溶液依次注入到離子源中,在ESI正離子模式下進行母離子全掃描,得到最優(yōu)的各待測目標物的分子離子峰。以確定的分子離子峰為母離子進行二級質譜碎片離子掃描,獲得碎片離子信息,得到二級質譜圖,選取豐度較高子離子。根據(jù)前面選出的母、子離子,組建MRM離子對,優(yōu)化碰撞能量與去簇電壓并確定定量離子及定性離子。優(yōu)化后相關參數(shù)見1.3.2節(jié)。選出的離子對數(shù)量符合EC/657指令中使用質譜法確證的4 個識別位點的要求。

    2.1.2 色譜條件優(yōu)化

    目前報道的關于測定硝基咪唑類藥物的文獻[23-29]和標準[20-21],分析柱均使用反相色譜柱,增加色譜柱長能更有效地提高樣品基質中目標分析物和共流出物的分離度并降低基質效應(matrix effect,ME)影響[27],因此本方法采用選用柱長150 mm的C18色譜柱進行分析。實驗選用Waters XBridge C18(2.1 mm×150 mm,5 μm)和Agilent EclipsePlus C18(2.1 mm×150 mm,1.8 μm)兩種色譜柱進行考察。結果表明超微填料(粒徑≤2 μm)Agilent EclipsePlus C18色譜柱可以獲得更好的分離效果,色譜峰峰形尖銳對稱。流動相采用有機相+水相改善出峰情況,有機相比較乙腈和甲醇,兩者都可獲得較好的色譜峰形和信號響應,使用乙腈目標物能更好地實現(xiàn)基線分離,且可減少溶劑效應的干擾;在正離子掃描模式下,水相中甲酸的加入能夠增加目標物響應,改善目標物的峰形,進一步比較0.1%的甲酸溶液和5 mmol/L乙酸銨溶液(含0.1%甲酸),結果表明乙酸銨加入后部分色譜峰響應降低。因此實驗使用Agilent EclipsePlus C18色譜柱作為分析柱,選擇0.1%的甲酸溶液-乙腈作為系統(tǒng)流動相。不同粒徑填料的色譜柱及不同流動相對7 種硝基咪唑類化合物影響見圖1。

    圖1 7 種硝基咪唑類化合物的總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatograms of seven NMZs

    2.2 提取溶劑的優(yōu)化

    在7 種硝基咪唑類化合物均未檢出的空白雞蛋樣品中加入5 μg/kg硝基咪唑類化合物混合標準溶液,分別以乙腈、1%甲酸-乙腈、甲醇、乙酸乙酯有機溶劑作為提取液,對比7 種硝基咪唑類化合物的提取效果。結果表明:甲醇和乙酸乙酯的鹽析效果較差,不利于分層,且甲醇提取液雜質較多,后續(xù)凈化復雜,使用1%甲酸-乙腈和乙腈提取時,回收率無明顯差異,乙腈具有沉淀蛋白等作用,提取液顏色較淺且各目標物回收率均滿足實驗要求,綜合考慮,選擇乙腈作為提取液。不同提取溶劑對硝基咪唑類化合物回收率的影響見圖2。

    圖2 不同提取溶劑對硝基咪唑類化合物回收率的影響Fig.2 Effects of different extraction solvents on the recoveries of NMZs

    2.3 凈化方式的優(yōu)化

    近年來,新型凈化固相萃取小柱Prime HLB和QuEChERS作為快速高效的前處理技術,在動物性食品藥物殘留檢測中應用較為廣泛[10,14,24-26,28-31]。實驗對比Prime HLB和C18對硝基咪唑類藥物的凈化處理效果,結果表明,Prime HLB和C18的平均回收率沒有明顯差異,不同凈化材料對目標物回收率的影響如圖3所示。Prime HLB采用親水親脂平衡填料,使用通過策略進行固相萃取凈化,可獲得相對較好的回收率,C18對于除去非極性雜質有較好的效果,部分化合物的回收率較采用Prime HLB稍低。但是雞蛋基質復雜,采用Prime HLB凈化后部分化合物(HMMNI和IPZOH)目標峰附近仍有干擾峰,影響定量結果準確性,所以選擇C18為前處理凈化方式。經(jīng)過兩種凈化材料處理后HMMNI和IPZOH提取離子流圖見圖4。

    圖3 兩種凈化方式的凈化效率對比Fig.3 Effect of purification methods on the recoveries of NMZs

    圖4 HMMNI和IPZOH提取離子流圖Fig.4 Extracted ion chromatograms of HMMN and IPZOH

    實驗進一步考察C18不同用量(50、200、400、600 mg)對目標化合物的影響。結果表明C18用量600 mg時DMZ和IPZ峰面積相對50 mg C18增加17.8%和31.8%,C18用量400 mg HMMNI峰面積相對50 mg C18增加了6.18%,MNZ、RNZ、MNZOH和IPZOH的峰面積有下降趨勢,對比添加量50 mg和400 mg峰面積相對偏差為3.01%、3.70%、4.86%和6.39%,差異不明顯,硝基咪唑類化合物的峰面積與C18用量關系見圖5。使用400 mg C18填料對部分目標物存在吸附作用,但是吸附作用不明顯,但是凈化后HMMNI絕對響應峰面積增加,DMZ和IPZ絕對響應峰面積增加明顯,綜上分析,使用400 mg C18作為合適的吸附劑用量。

    圖5 C18吸附劑用量對硝基咪唑類化合物峰面積的影響Fig.5 Effects of the amount of C18 sorbents on the peak areas of NMZs

    2.4 方法評價

    2.4.1 線性范圍、檢出限(limit of detection,LOD)和定量限(limit of quantification,LOQ)將標準及內標混合系列工作液分別注入液相色譜-串聯(lián)質譜儀中,測定相應的峰面積,以標準系列工作液中硝基咪唑化合物的質量濃度為橫坐標,以硝基咪唑化合物與其內標的峰面積的比值為縱坐標,繪制標準曲線。結果表明,硝基咪唑化合物在0.5~20.0 ng/mL范圍內線性相關系數(shù)(r)均大于0.999,呈現(xiàn)良好的線性關系(表2)。以信噪比為3確定方法LOD,以信噪比為10確定方法LOQ,得出雞蛋基質中硝基咪唑及其代謝物的LOD在0.1~0.25 μg/kg之間,LOQ在0.3~1.0 μg/kg之間,方法的LOD均低于標準方法SN/T 2624—2010的檢測低限(1 μg/kg),方法靈敏度較高。

    表2 硝基咪唑類化合物線性方程、相關系數(shù)、LOD和LOQTable 2 Linear equations,correlation coefficients,LODs,LOQs of NMZs

    2.4.2 回收率與精密度

    對空白樣品進行低、中、高3 個水平的添加回收實驗,硝基咪唑類化合物添加量分別為0.5、1.0、5.0 μg/kg,每個添加水平進行6 次平行實驗,以考察方法的回收率和精密度。結果表明(表3),雞蛋中7 種硝基咪唑類的回收率為96.5%~112.7%,相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)為0.82%~8.14%。符合標準GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規(guī)范 食品理化檢測》[32]規(guī)定的回收率和精密度的要求。

    表3 硝基咪唑類化合物的加標回收率和精密度Table 3 Recoveries and precision RSDs of NMZs from spiked samples

    2.4.3 ME的評價

    方法按照(ME=基質標準曲線斜率/溶劑標準曲線斜率)評價ME。當ME小于0.85時,存在基質抑制效應;當ME為0.85~1.15時,ME不明顯;當ME大于1.15時,存在基質增強效應[33]。準確稱取2.0 g樣品,加入10 mL乙腈和1 g NaCl旋渦混合10 min,超聲 10 min,以4 500 r/min離心5 min,取5.0 mL上清液,凈化處理后加入7 種硝基咪唑類化合物和內標標準溶液,配制成0.5~20 ng/mL基質標準工作溶液。分別作基質和溶劑的外標和內標曲線,內標質量濃度為5 ng/mL。結果表明,除HMMNI(MEex=0.774)和RNZ(MEex=0.814)存在抑制效應外,其他幾種硝基咪唑類化合物經(jīng)過本法凈化后各基質溶液中ME不明顯。方法通過內標法進行矯正后,7 種硝基咪唑類化合物的ME不明顯,因此本法采用溶劑標準曲線和內標法測定7 種硝基咪唑類化合物含量,ME評價如表4所示。

    表4 硝基咪唑類化合物的ME評價Table 4 Matrix effects of MNZs

    2.4.4 方法比對與實際樣品分析

    采用建立的同位素稀釋-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法對FAPAS考核樣品(編號02477)雞蛋中的硝基咪唑類化合物進行測定,與標準方法SN/T 2624—2010結果進行比對。考核樣待測目標物為本方法測定的7 種硝基咪唑類化合物,DMZ靶值為5.15 μg/kg,HMMNI 靶值為11.0 μg/kg,MNZ靶值為7.81 μg/kg,MNZOH靶值為5.17 μg/kg,RNZ、IPZ和IPZOH未檢出,z值表示測定值與真值之間的偏離程度,|z|≤2則結果滿意。未檢出目標物采用加標回收的方式進行評價(加標量5.0 μg/kg)。兩種方法對DMZ、HMMNI、MNZ、MNZOH、RNZ、IPZOH的測定結果(表5)比較接近,相對偏差分別為2.28%、3.36%、2.83%、6.82%、0.20%、9.90%。能力驗證結果表明,本方法對雞蛋中4 種硝基咪唑類化合物的測定結果均在|z|≤2的置信區(qū)間。RNZ、IPZ、IPZOH采用本方法測定的加標回收率分別為101%、106%和102%,SN/T 2624—2010的加標回收率分別為101%、76.6%和92.2%。綜上,采用本方法對雞蛋中7 種硝基咪唑類化合物測定結果滿意。

    表5 雞蛋中硝基咪唑類化合物的不同分析方法比對Table 5 Comparison of different analytic methods for detection of MNZs in eggs

    應用建立的同位素稀釋-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法對購自超市和農產品批發(fā)市場的38 批次雞蛋樣品中7 種硝基咪唑類化合物進行測定。38 批次樣品中,檢出1 批次MNZ陽性樣品,甲硝唑含量為320 μg/kg,超過限量1.0 μg/kg,其他樣品均未檢出7 種硝基咪唑類化合物,說明在國家明令禁止的情況下,仍存在不法分子違規(guī)使用硝基咪唑類藥物的情況。

    3 結論

    本實驗建立了同位素稀釋-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法同時測定雞蛋中7 種硝基咪唑類藥物的方法。方法LOD為0.1~0.25 μg/kg,LOQ為0.3~1.0 μg/kg,結果準確度高,前處理操作簡便,具有快速、高效、易推廣的優(yōu)點,適用于大批量雞蛋中硝基咪唑類藥物的快速篩查、定性定量檢測,對于雞蛋中硝基咪唑類藥物殘留情況的監(jiān)測具有重要的應用價值。

    猜你喜歡
    咪唑類硝基內標
    溴代咪唑類離子液體的合成
    氣相色譜內標法測洗滌劑中的甲醇
    咪唑類離子液體在儲能和換熱應用中的研究進展
    鞍鋼技術(2021年3期)2021-06-11 05:13:50
    硝基胍烘干設備及工藝研究
    化工管理(2021年7期)2021-05-13 00:46:24
    有機熱載體熱穩(wěn)定性測定內標法的研究
    GC內標法同時測定青刺果油中4種脂肪酸
    中成藥(2018年6期)2018-07-11 03:01:32
    高塔硝基肥,科技下鄉(xiāng)助農豐收
    中國農資(2016年1期)2016-12-01 05:21:23
    核磁共振磷譜內標法測定磷脂酰膽堿的含量
    氣相色譜-質譜法測定祛痘化妝品中4種硝基咪唑類化合物
    九硝基三聯(lián)苯炸藥的合成及表征
    化工進展(2015年3期)2015-11-11 09:08:25
    免费在线观看影片大全网站| 久久免费观看电影| 精品欧美一区二区三区在线| 一本综合久久免费| 在线观看人妻少妇| 免费高清在线观看日韩| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 亚洲成人手机| 中文字幕制服av| 亚洲视频免费观看视频| 精品福利永久在线观看| 亚洲综合色网址| 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲国产成人一精品久久久| 91精品三级在线观看| 免费看十八禁软件| 亚洲国产欧美在线一区| 在线 av 中文字幕| 成年动漫av网址| 一夜夜www| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产成人精品久久二区二区免费| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 露出奶头的视频| 中文字幕人妻熟女乱码| 国产1区2区3区精品| 亚洲精品中文字幕在线视频| 在线天堂中文资源库| 大香蕉久久成人网| 午夜免费鲁丝| 中文字幕制服av| 99在线人妻在线中文字幕 | 黄片大片在线免费观看| 丰满迷人的少妇在线观看| 国产精品一区二区精品视频观看| 久久毛片免费看一区二区三区| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | av天堂久久9| 亚洲色图av天堂| 免费少妇av软件| 香蕉丝袜av| 99久久精品国产亚洲精品| 成人精品一区二区免费| 亚洲少妇的诱惑av| 天堂中文最新版在线下载| 操美女的视频在线观看| 精品高清国产在线一区| 免费黄频网站在线观看国产| 国产成人精品无人区| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 亚洲 国产 在线| av有码第一页| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产精品一区二区免费欧美| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 亚洲熟妇熟女久久| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产在视频线精品| 在线观看免费视频网站a站| 国产成人精品久久二区二区91| 一本色道久久久久久精品综合| 一本久久精品| h视频一区二区三区| 男女下面插进去视频免费观看| av又黄又爽大尺度在线免费看| 成人永久免费在线观看视频 | 午夜成年电影在线免费观看| 麻豆成人av在线观看| 另类亚洲欧美激情| 男人操女人黄网站| 成人精品一区二区免费| 天天影视国产精品| 亚洲精品自拍成人| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 欧美日韩黄片免| 91精品三级在线观看| 久久久国产成人免费| 中文字幕av电影在线播放| 老熟妇仑乱视频hdxx| 日韩三级视频一区二区三区| 99久久精品国产亚洲精品| av电影中文网址| 波多野结衣av一区二区av| 男女之事视频高清在线观看| 一本色道久久久久久精品综合| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲欧美色中文字幕在线| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 99国产综合亚洲精品| 日本vs欧美在线观看视频| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 色在线成人网| 久久精品成人免费网站| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲国产成人一精品久久久| 亚洲精品中文字幕在线视频| av有码第一页| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| a级毛片黄视频| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 一级片免费观看大全| 国产高清国产精品国产三级| 午夜两性在线视频| 视频区欧美日本亚洲| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 午夜福利视频在线观看免费| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 人人妻,人人澡人人爽秒播| 大陆偷拍与自拍| 大码成人一级视频| 亚洲专区国产一区二区| 啦啦啦 在线观看视频| 精品一区二区三区四区五区乱码| a级毛片黄视频| 国产欧美日韩一区二区三| 两性夫妻黄色片| 91精品国产国语对白视频| 国产在线一区二区三区精| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产高清videossex| 另类精品久久| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产精品一区二区在线不卡| 日韩欧美国产一区二区入口| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产一区二区 视频在线| 老司机靠b影院| 精品久久久久久久毛片微露脸| 最新在线观看一区二区三区| 午夜激情av网站| 精品乱码久久久久久99久播| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲一区中文字幕在线| 91精品三级在线观看| 视频区图区小说| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 美女午夜性视频免费| 又大又爽又粗| 亚洲av成人一区二区三| 精品国产一区二区三区四区第35| 欧美日韩成人在线一区二区| 9191精品国产免费久久| 少妇被粗大的猛进出69影院| 热99re8久久精品国产| 亚洲专区字幕在线| 日韩欧美三级三区| 国产成人欧美在线观看 | 国产免费av片在线观看野外av| 免费人妻精品一区二区三区视频| 一区二区三区国产精品乱码| 国产av一区二区精品久久| 久久精品亚洲av国产电影网| 精品卡一卡二卡四卡免费| 日韩成人在线观看一区二区三区| 成人手机av| 色综合婷婷激情| 久久狼人影院| bbb黄色大片| 高清欧美精品videossex| h视频一区二区三区| 欧美乱妇无乱码| 成人精品一区二区免费| 他把我摸到了高潮在线观看 | 亚洲第一av免费看| 中国美女看黄片| 亚洲精品久久午夜乱码| 精品人妻1区二区| 久久亚洲真实| 国产成人精品久久二区二区免费| av欧美777| 日本av免费视频播放| 咕卡用的链子| 深夜精品福利| 欧美成人免费av一区二区三区 | 99久久人妻综合| 一夜夜www| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产日韩欧美在线精品| 十八禁人妻一区二区| 美女福利国产在线| 久久天堂一区二区三区四区| 老司机午夜十八禁免费视频| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 日本黄色日本黄色录像| 色尼玛亚洲综合影院| 丝袜在线中文字幕| 欧美精品一区二区大全| 91精品国产国语对白视频| 国产又色又爽无遮挡免费看| 三级毛片av免费| 色老头精品视频在线观看| 日韩欧美三级三区| 亚洲avbb在线观看| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲欧美一区二区三区久久| 一二三四社区在线视频社区8| 在线av久久热| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 久久久久国内视频| 757午夜福利合集在线观看| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 国产97色在线日韩免费| 国产精品久久久久久精品古装| 久久中文字幕一级| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 视频在线观看一区二区三区| 美国免费a级毛片| 1024香蕉在线观看| 精品欧美一区二区三区在线| 乱人伦中国视频| 亚洲国产欧美一区二区综合| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 国产精品九九99| 色综合欧美亚洲国产小说| 老司机靠b影院| 久久久久久久精品吃奶| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 免费少妇av软件| 国产熟女午夜一区二区三区| 一边摸一边做爽爽视频免费| 99国产综合亚洲精品| 黄色丝袜av网址大全| 9热在线视频观看99| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 一二三四社区在线视频社区8| 欧美一级毛片孕妇| 丝瓜视频免费看黄片| 老鸭窝网址在线观看| 国产成人免费无遮挡视频| 国产高清激情床上av| 在线观看免费午夜福利视频| 国产精品99久久99久久久不卡| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 夫妻午夜视频| 啦啦啦免费观看视频1| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲欧美激情在线| 国产福利在线免费观看视频| 国产av国产精品国产| 中文字幕制服av| 满18在线观看网站| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 深夜精品福利| 中文字幕最新亚洲高清| 日韩视频在线欧美| 精品久久久久久电影网| 亚洲国产成人一精品久久久| 两性夫妻黄色片| a级毛片黄视频| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲色图综合在线观看| 久久av网站| 精品欧美一区二区三区在线| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 久久精品亚洲av国产电影网| 一级黄色大片毛片| 亚洲黑人精品在线| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 91精品三级在线观看| 国产区一区二久久| 久久久久久免费高清国产稀缺| 高清黄色对白视频在线免费看| 一级毛片精品| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 777米奇影视久久| 纯流量卡能插随身wifi吗| 一级,二级,三级黄色视频| 国产在视频线精品| 日韩视频一区二区在线观看| 精品国产乱子伦一区二区三区| 天天影视国产精品| 日韩大片免费观看网站| 丝瓜视频免费看黄片| 日韩大码丰满熟妇| 九色亚洲精品在线播放| 久久中文字幕一级| 99九九在线精品视频| 久久av网站| 欧美中文综合在线视频| 国产又爽黄色视频| 两人在一起打扑克的视频| 精品国产亚洲在线| 最近最新中文字幕大全免费视频| 咕卡用的链子| 免费高清在线观看日韩| 大片免费播放器 马上看| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 国产精品影院久久| 99香蕉大伊视频| 欧美日韩av久久| 丝袜美腿诱惑在线| 欧美乱码精品一区二区三区| 啦啦啦 在线观看视频| 最新美女视频免费是黄的| 免费少妇av软件| aaaaa片日本免费| 动漫黄色视频在线观看| 久久性视频一级片| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲av国产av综合av卡| 亚洲色图av天堂| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 日日夜夜操网爽| 亚洲,欧美精品.| 亚洲avbb在线观看| av欧美777| 久久久久视频综合| 波多野结衣av一区二区av| 精品一区二区三区四区五区乱码| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产福利在线免费观看视频| 色老头精品视频在线观看| 亚洲av电影在线进入| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 免费在线观看日本一区| 99re6热这里在线精品视频| 黑人猛操日本美女一级片| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 后天国语完整版免费观看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 在线看a的网站| 国产在视频线精品| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产成+人综合+亚洲专区| 国产一区二区激情短视频| 国产精品一区二区免费欧美| 99re6热这里在线精品视频| 久久午夜综合久久蜜桃| 免费在线观看完整版高清| 男女高潮啪啪啪动态图| 欧美午夜高清在线| 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲男人天堂网一区| 国产精品一区二区在线不卡| 久久中文看片网| 伦理电影免费视频| kizo精华| 制服人妻中文乱码| 一进一出好大好爽视频| 丰满迷人的少妇在线观看| 一进一出好大好爽视频| 丰满迷人的少妇在线观看| 欧美午夜高清在线| 黑人欧美特级aaaaaa片| 十八禁网站免费在线| 久久久久久久久免费视频了| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 91大片在线观看| 热99久久久久精品小说推荐| 91大片在线观看| 久久天堂一区二区三区四区| 两个人看的免费小视频| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 久久热在线av| 十八禁网站网址无遮挡| 一级毛片精品| 精品久久久久久久毛片微露脸| 真人做人爱边吃奶动态| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 老熟女久久久| 午夜老司机福利片| 乱人伦中国视频| 亚洲国产av新网站| 色在线成人网| 大片电影免费在线观看免费| tube8黄色片| 成年女人毛片免费观看观看9 | 另类亚洲欧美激情| 国产一区二区 视频在线| 日韩欧美三级三区| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 老汉色av国产亚洲站长工具| 日日爽夜夜爽网站| 成人亚洲精品一区在线观看| 丰满少妇做爰视频| 国产亚洲精品久久久久5区| 美国免费a级毛片| 免费观看人在逋| 国产在视频线精品| 亚洲一码二码三码区别大吗| 亚洲专区国产一区二区| 久久九九热精品免费| 在线观看www视频免费| 一区二区三区精品91| 亚洲三区欧美一区| 免费观看a级毛片全部| 国产高清视频在线播放一区| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 丝瓜视频免费看黄片| 日本vs欧美在线观看视频| 精品亚洲成a人片在线观看| 十分钟在线观看高清视频www| av天堂在线播放| 国产一区二区在线观看av| 99国产极品粉嫩在线观看| 日本vs欧美在线观看视频| 在线观看人妻少妇| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 亚洲熟女毛片儿| 91国产中文字幕| 日韩中文字幕欧美一区二区| 久久久国产成人免费| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 欧美+亚洲+日韩+国产| 精品国产一区二区久久| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| www.精华液| 少妇被粗大的猛进出69影院| 午夜免费鲁丝| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 亚洲色图综合在线观看| 老司机影院毛片| 欧美乱色亚洲激情| 欧美在线一区亚洲| 在线观看免费视频日本深夜| 久久午夜亚洲精品久久| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 很黄的视频免费| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产久久久一区二区三区| 色综合亚洲欧美另类图片| 久久久久久久久免费视频了| 九九热线精品视视频播放| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 国产精品 国内视频| 热99在线观看视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| svipshipincom国产片| 97超视频在线观看视频| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 久久中文字幕人妻熟女| 国产精品国产高清国产av| 亚洲精品久久国产高清桃花| av在线蜜桃| 国内精品久久久久久久电影| 午夜影院日韩av| 校园春色视频在线观看| 国产精品,欧美在线| 淫妇啪啪啪对白视频| 久久精品综合一区二区三区| 黄色成人免费大全| 黄片大片在线免费观看| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 久久久国产成人精品二区| 亚洲美女视频黄频| 国产成人av激情在线播放| 亚洲无线在线观看| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 亚洲一区二区三区色噜噜| 久久这里只有精品19| 91av网一区二区| 日本在线视频免费播放| 床上黄色一级片| 欧美日韩国产亚洲二区| 天天躁日日操中文字幕| 成人av一区二区三区在线看| 久久久国产成人精品二区| 草草在线视频免费看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲中文av在线| 国产伦在线观看视频一区| 99久久无色码亚洲精品果冻| 国产99白浆流出| 老司机午夜十八禁免费视频| 亚洲美女视频黄频| 国产激情欧美一区二区| 亚洲七黄色美女视频| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 久久午夜亚洲精品久久| 男女午夜视频在线观看| 高清在线国产一区| 欧美一区二区国产精品久久精品| 岛国在线观看网站| 毛片女人毛片| 亚洲美女黄片视频| 亚洲天堂国产精品一区在线| a级毛片a级免费在线| 国产精品国产高清国产av| 青草久久国产| 人人妻人人澡欧美一区二区| 久久久久精品国产欧美久久久| 九色成人免费人妻av| 老司机深夜福利视频在线观看| 一边摸一边抽搐一进一小说| www.自偷自拍.com| 人妻久久中文字幕网| 亚洲,欧美精品.| 亚洲午夜理论影院| 男女视频在线观看网站免费| 成人av一区二区三区在线看| 91麻豆av在线| 国产成年人精品一区二区| 91九色精品人成在线观看| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产爱豆传媒在线观看| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲av成人av| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 禁无遮挡网站| 午夜福利18| 天堂影院成人在线观看| 最近视频中文字幕2019在线8| 黄色日韩在线| 无人区码免费观看不卡| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 欧美最黄视频在线播放免费| 最近最新中文字幕大全免费视频| 欧美三级亚洲精品| 性欧美人与动物交配| 国产精品一及| 久久久久免费精品人妻一区二区| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产精品影院久久| 国产人伦9x9x在线观看| 国产精品精品国产色婷婷| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 99热6这里只有精品| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国产1区2区3区精品| 色播亚洲综合网| ponron亚洲| 婷婷丁香在线五月| 亚洲熟妇熟女久久| 手机成人av网站| 最近在线观看免费完整版| 亚洲自拍偷在线| 国产精品一区二区免费欧美| 国产精品爽爽va在线观看网站| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 可以在线观看的亚洲视频| av欧美777| 国产伦精品一区二区三区四那| 色播亚洲综合网| 日韩人妻高清精品专区| 亚洲国产精品久久男人天堂| or卡值多少钱| 亚洲成人免费电影在线观看| 又爽又黄无遮挡网站| 亚洲18禁久久av| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 精品一区二区三区视频在线 | 99久久无色码亚洲精品果冻| 好男人电影高清在线观看| 国产精品永久免费网站| 中文字幕熟女人妻在线| 全区人妻精品视频| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 亚洲av美国av| 国内精品一区二区在线观看| 国产真实乱freesex| 久久亚洲精品不卡| 成人精品一区二区免费| 日本 欧美在线| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 黄频高清免费视频| 国产高清视频在线播放一区| 日韩欧美在线二视频| 中文字幕熟女人妻在线| 亚洲电影在线观看av| 久久久久国产一级毛片高清牌| 九色成人免费人妻av| 婷婷精品国产亚洲av| 99久久精品国产亚洲精品| 精品乱码久久久久久99久播| 亚洲国产欧美网| 午夜福利视频1000在线观看| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产av麻豆久久久久久久| 18美女黄网站色大片免费观看| 国产三级在线视频| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 日韩精品青青久久久久久| 最新美女视频免费是黄的| 日本a在线网址| 日韩欧美 国产精品| 国产精品永久免费网站| 精品国产乱码久久久久久男人| 亚洲一区二区三区色噜噜| 国产精品久久电影中文字幕| 嫩草影院精品99| 日韩中文字幕欧美一区二区| 中出人妻视频一区二区| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 在线观看免费视频日本深夜| 久久草成人影院| 成年女人永久免费观看视频| 国产视频一区二区在线看| 久久草成人影院| 久久久久久久午夜电影| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 色av中文字幕| 久久久精品欧美日韩精品| 国产一区二区三区视频了| 欧美中文综合在线视频| 叶爱在线成人免费视频播放| 12—13女人毛片做爰片一| 在线播放国产精品三级| 搡老妇女老女人老熟妇| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 男女那种视频在线观看| 欧美成人性av电影在线观看| 日韩欧美国产一区二区入口| 淫妇啪啪啪对白视频| 亚洲精华国产精华精|