基于代謝組學(xué)分析鐵觀音烏龍茶包揉過(guò)程中代謝物動(dòng)態(tài)變化

佐明興，閆 瑞，封子旋，高 婷，鄭玉成，侯炳豪，葉乃興，陳倩潔，毛宇源,*，高水練,*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)安溪茶學(xué)院，福建 泉州 362406）

烏龍茶屬半發(fā)酵茶，主產(chǎn)于我國(guó)閩南、閩北、廣東及臺(tái)灣等地[1]。其中鐵觀音是閩南烏龍茶的典型代表，其制成的成品茶滋味醇厚回甘，香氣馥郁悠長(zhǎng)，具有獨(dú)特的“蘭花香、觀音韻”[2]。

烏龍茶品質(zhì)特征主要受品種、產(chǎn)地以及加工工藝的影響，其中加工工藝尤為重要[3-4]。包揉是閩南烏龍茶加工的特殊工藝，包揉過(guò)程中伴隨著反復(fù)揉搓擠壓的機(jī)械力，發(fā)生熱化學(xué)反應(yīng)和濕熱作用等促進(jìn)非揮發(fā)性與揮發(fā)性代謝物轉(zhuǎn)化，進(jìn)而影響茶葉的色、香、味[5-7]。郭玉瓊等[8]研究表明，包揉使茶葉細(xì)胞破碎，茶汁擠出，增加了茶葉耐泡度，由于濕熱作用，各活性物質(zhì)間的非酶促反應(yīng)增加，參與香氣形成的游離氨基酸含量減少；劉偉等[9]研究發(fā)現(xiàn)包揉工藝毛茶中具有較多醇類，呈花果香和清甜香的橙花基丙酮和己酸-3-己烯酯相對(duì)含量高于壓揉毛茶；郝志龍等[10]研究表明采用“全速包”造型工藝的茶葉容重、葉溫、含水率、黃酮總量和游離氨基酸含量顯著低于“速包＋平板”造型工藝；張妍等[11]基于力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)搓揉力與壓力和純壓力兩種模型的茶葉生化成分含量在加工過(guò)程中呈下降趨勢(shì)，其中搓揉力與壓力模型的成品茶香氣成分如羅勒烯和芳樟醇相對(duì)含量較高，感官品質(zhì)表現(xiàn)優(yōu)于純壓力模型。近年來(lái)，代謝組學(xué)技術(shù)研究廣泛涉及烏龍茶加工和成品茶精制等方面，更深層次地分析了烏龍茶萎凋[12-13]和做青[14-16]等加工過(guò)程中關(guān)鍵差異代謝物變化規(guī)律及代謝途徑[17-18]。

然而，關(guān)于對(duì)烏龍茶包揉工藝的研究更多關(guān)注于包揉對(duì)感官品質(zhì)的影響或常規(guī)的生化檢測(cè)，但對(duì)包揉過(guò)程中不同階段茶葉非揮發(fā)性與揮發(fā)性次生代謝物的研究鮮有報(bào)道。本研究以鐵觀音為研究對(duì)象，利用廣泛靶向代謝組學(xué)及揮發(fā)性代謝組學(xué)技術(shù)，對(duì)鐵觀音包揉過(guò)程中的揮發(fā)性與非揮發(fā)性代謝物進(jìn)行探究，并分析差異代謝物及其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，以期為閩南烏龍茶在包揉過(guò)程中的品質(zhì)形成機(jī)制提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮葉于2021年4月26日采自福建省安溪縣龍涓鄉(xiāng)舉源村舉源茶葉合作社（24°59’N；117°47’E），采摘標(biāo)準(zhǔn)為一芽三四葉，品種為鐵觀音。

甲醇、乙腈（均為色譜純）默克化工技術(shù)（上海）有限公司；標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）云南西力生物技術(shù)股份有限公司、美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5424R 2 Eppendorf離心機(jī) 艾本德中國(guó)有限公司；MM 400研磨機(jī) 德國(guó)Retsch公司；Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A超高效液相色譜儀 日本島津公司；Applied Biosystems 6500QTRAP三重四極桿質(zhì)譜儀美國(guó)賽默飛世爾科技公司；SB-C18色譜柱 美國(guó)安捷倫公司；6CYQT-90 型搖青機(jī)、6CWS-110型滾筒式液化氣殺青機(jī)、6CR-55型茶葉揉捻機(jī)、ML-6CSBG-19型速包機(jī)、6CW-60型解塊篩末機(jī)、6CWB-80型平板包揉機(jī)、6CH-54型電熱烘干箱 福建省安溪長(zhǎng)安茶葉機(jī)械廠。

1.3 方法

1.3.1 茶樣制備

參照Z(yǔ)heng Yucheng等[19]的閩南烏龍茶加工工藝參數(shù)進(jìn)行加工：鮮葉→萎凋→做青→殺青→揉捻→包揉（初包揉→復(fù)包揉→再包揉）→烘干→毛茶。鐵觀音鮮葉經(jīng)統(tǒng)一萎凋、做青、殺青、揉捻而成的揉捻葉（RN）作為處理茶樣。

1.3.1.1 鮮葉采摘與萎凋

選用安溪縣國(guó)家級(jí)茶樹(shù)良種鐵觀音鮮葉為實(shí)驗(yàn)材料，采摘標(biāo)準(zhǔn)小開(kāi)面一芽三四葉，按照閩南烏龍茶加工工藝進(jìn)行室外萎凋，曬青18 min至頂葉微軟下垂，室內(nèi)萎凋90 min。

1.3.1.2 做青（搖青-晾青3 次）

搖青機(jī)每桶投葉量25 kg，調(diào)速25 r/min，第1次搖3 min，主要促進(jìn)晾青葉“還陽(yáng)”，為搖青走水做準(zhǔn)備，晾青90 min，葉色暗綠轉(zhuǎn)淡，青氣退，略帶青香進(jìn)行下一次搖青。第2次搖5 min，搖青程度略重于第1次，以損傷葉緣細(xì)胞，促進(jìn)“走水”，晾青180 min，微有紅邊，待青氣退，略有香氣進(jìn)行下一次搖青。第3次搖18 min，做青葉發(fā)酵充分，葉片部分呈現(xiàn)“三紅七綠”狀態(tài)，晾青8 h，青氣退，花香顯。

1.3.1.3 殺青

炒青溫度270 ℃，炒青時(shí)間4 min，炒青適度時(shí)，葉色轉(zhuǎn)暗，手握茶青葉略有黏稠感。

1.3.1.4 揉捻

將殺青葉放入揉捻機(jī)趁熱揉4 min，條索初步形成，茶汁擠出。

1.3.1.5 包揉

采用速包機(jī)將揉捻葉（R N）包成球狀，用時(shí)60 s/次，之后于平板包揉機(jī)壓揉3 min，然后松包散熱解塊，速包、平揉、解塊反復(fù)3 次，形成初包揉葉（CQ），隨后利用烘干機(jī)進(jìn)行初烘，初烘溫度170 ℃、時(shí)間3 min，速包、平揉、解塊反復(fù)3 次后，形成復(fù)包揉葉（BY），接著置于烘干機(jī)復(fù)烘，復(fù)烘溫度80 ℃、時(shí)間8 min，然后進(jìn)行再包揉，即速包、平揉、解塊反復(fù)3 次，形成再包揉葉（BL）。

分別對(duì)加工過(guò)程中RN、CQ、BY、BL進(jìn)行取樣（圖1），每個(gè)樣品200 g，設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，液氮固樣后放置―80 ℃冰箱中保存待測(cè)。

圖1 不同包揉階段的茶葉樣品Fig.1 Tea samples at different wrapping-twisting stages

1.3.1.6 干燥

烘干機(jī)溫度80 ℃烘至茶梗易折斷，烘干毛茶攤晾后裝袋置于低溫避光環(huán)境下儲(chǔ)藏。

1.3.2 鐵觀音包揉過(guò)程中非揮發(fā)性代謝物分析

1.3.2.1 樣品前處理

對(duì)鐵觀音加工過(guò)程中的4 個(gè)樣品進(jìn)行真空冷凍干燥并磨至粉末狀；稱取100 mg的樣本粉末，溶解于1.2 mL 70%甲醇溶液中并置于4 ℃冰箱過(guò)夜；離心（12 000 r/min、10min）吸取上清液后過(guò)濾樣品，并保存到進(jìn)樣瓶中，用于超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）分析。

1.3.2.2 UPLC-MS/MS分析

UPLC條件：色譜柱為Agilent SB-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相A為超純水（加入0.1%甲酸），流動(dòng)相B為乙腈（加入0.1%甲酸）；洗脫梯度：0.00 min，95% A、5% B；0.00～9.00 min，95%～5% A、5%～95% B；9.00～10.00 min，5% A、95% B；10.00～11.10 min，5%～95% A、95%～5% B；11.10～14 min，95% A、5% B；流速為0.35 mL/min；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為4 μL。

MS 條件：線性離子阱和三重四極桿（triple quadrupole，QQQ）掃描是在三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀（Q TRAP），AB4500 Q TRAP UPLC/MS/MS系統(tǒng)上獲得的，渦輪噴霧離子源；離子源溫度550 ℃；離子噴霧電壓5 500 V（正離子模式）/―4 500 V（負(fù)離子模式）；離子源氣體I（GSI）、氣體II（GSII）和氣簾氣分別設(shè)置為50、60 psi和25 psi，碰撞誘導(dǎo)電離參數(shù)設(shè)置為高。在QQQ和線性離子阱模式下分別用10 μmol/L與100 μmol/L的聚丙二醇溶液進(jìn)行儀器調(diào)諧和質(zhì)量校準(zhǔn)。QQQ掃描用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，并將碰撞氣體（氮?dú)猓┰O(shè)置為中等。

質(zhì)控樣本：質(zhì)控（quality control，QC）樣本由4 組樣本的提取物等量混合制備而成，并采用與分析樣本相同的方法處理和檢測(cè)，重復(fù)3 次。在儀器檢測(cè)的過(guò)程中，每10 個(gè)檢測(cè)分析樣本中插入1 個(gè)QC樣本，以達(dá)到監(jiān)測(cè)整個(gè)分析過(guò)程的重復(fù)性。

1.3.3 鐵觀音包揉過(guò)程中揮發(fā)性代謝物分析

1.3.3.1 樣品前處理

從―80 ℃冰箱取出鐵觀音樣品進(jìn)行液氮研磨后，渦旋混合均勻，稱取大約1.00 g樣品，加入到含有10 μL（50 μg/mL）正丁醇內(nèi)標(biāo)溶液和飽和氯化鈉溶液的15 mL頂空瓶中，每個(gè)樣品進(jìn)行3 次重復(fù)。頂空固相微萃?。╤eadspace-solid phase microextraction，HS-SPME）條件：頂空瓶于100 ℃的恒溫條件下振蕩5 min后，120 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭插入樣品頂空瓶，頂空萃取15 min，于250 ℃解吸5 min，然后進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分離鑒定。萃取頭在Fiber Conditioning Station中的250 ℃溫度條件老化5 min。新萃取頭在萃取前在Fiber Conditioning Station中老化2 h。

1.3.3.2 GC-MS采集條件

GC條件：DB-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm，Agilent J&W Scientific,Folsom,CA,USA），載氣為高純氦氣（純度＞99.999%），恒流流速1.2 mL/min，進(jìn)樣口溫度250 ℃，不分流進(jìn)樣，溶劑延遲3.5 min。程序升溫：40 ℃保持3.5 min，以10 ℃/min升至100 ℃，再以7 ℃/min升至180 ℃，最后以25 ℃/min升至280 ℃，保持5 min。

MS條件：電子電離源，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，接口溫度280 ℃，電子能量70 eV，掃描方式為全掃描模式，質(zhì)量掃描范圍m/z50～500。

1.3.4 氣味活度值（odor activity value，OAV）分析

參照Guo Xiangyang等[20]方法進(jìn)行OAV計(jì)算。

式中：Ci為每種揮發(fā)性化合物含量/（μg/kg）；Ti為香氣閾值/（μg/kg）。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

參照Wang Pengjie等[4]的方法，基于碎片模式，保留時(shí)間、m/z與武漢邁特維爾生物科技有限公司自建MWDB V2.0數(shù)據(jù)庫(kù)及公共數(shù)據(jù)庫(kù)的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)非揮發(fā)性代謝物進(jìn)行定性，代謝物定量利用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式分析。獲得不同樣本的代謝物質(zhì)譜后，對(duì)物質(zhì)質(zhì)譜峰的峰面積進(jìn)行積分，同時(shí)對(duì)不同樣品中同一代謝物的質(zhì)譜峰進(jìn)行積分校正，利用軟件Analvst 1.6.3處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)；非揮發(fā)性代謝物每個(gè)色譜峰的峰面積表示相應(yīng)物質(zhì)的相對(duì)含量。

參照邵淑賢等[21]的方法，基于MWGC數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)揮發(fā)性代謝物進(jìn)行質(zhì)譜定性，篩選保留質(zhì)譜匹配度＞80%的揮發(fā)性代謝物，定量通過(guò)與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比較，得到香氣成分的含量，即：揮發(fā)性成分的含量/（μg/kg）＝（香氣成分物質(zhì)峰面積×內(nèi)標(biāo)物含量）/內(nèi)標(biāo)物峰面積?；谶~維云平臺(tái)進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）、聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA），并結(jié)合變量投影重要性（variables important in the projection，VIP）值＞1.0，差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）≥1.2或FC≤0.83且P＜0.05篩選非揮發(fā)性差異代謝物[22]。使用Office Excel 2019軟件制作餅圖，使用Graphpad Prism 8.0.2軟件制作柱狀圖，使用SPSS 26.0進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵觀音包揉過(guò)程中非揮發(fā)性代謝物組成分析

如圖2A所示，共鑒定出12 類973 種非揮發(fā)性代謝物，包括類黃酮241 種、酚酸167 種、脂質(zhì)138 種、有機(jī)酸69 種、氨基酸及其衍生物70 種、生物堿69 種、核苷酸及其衍生物55 種、木脂素和香豆素36 種、鞣質(zhì)29 種、萜類10 種、糖及醇類54 種和其他類35 種。

圖2 鐵觀音包揉過(guò)程中非揮發(fā)性代謝物分析Fig.2 Analysis of non-volatile metabolites in Tieguanyin oolong tea during wrapping-twisting

由圖2B可知，PC1和PC2的方差貢獻(xiàn)率分別為23.51%和28.54%，可解釋各非揮發(fā)性代謝物52.05%的總變異。從圖2B可以看出，除RN與CQ分布距離較近外，在包揉加工過(guò)程中BY和BL均能較好地區(qū)分開(kāi)來(lái)，說(shuō)明包揉過(guò)程中的代謝物含量及組成主要在BY和BL兩個(gè)階段變化明顯。PCA結(jié)果基本能夠反映出包揉過(guò)程中4 組樣品之間的代謝物差異。隨后對(duì)各樣本代謝物的相對(duì)含量進(jìn)行HCA，發(fā)現(xiàn)聚類熱圖中不同包揉階段樣本的非揮發(fā)性代謝物存在明顯差異（圖2C），這與PCA的結(jié)果一致。

為了解包揉過(guò)程中非揮發(fā)性代謝物整體的變化規(guī)律，對(duì)其相對(duì)含量進(jìn)行聚類（圖2D），12 類非揮發(fā)性代謝物總量呈現(xiàn)如下變化趨勢(shì)：RN＞CQ＞BY＞BL。與RN相比，包揉過(guò)程中非揮發(fā)性代謝物在BL階段變化明顯，類黃酮、氨基酸及其衍生物、糖及醇類含量下降，而木脂素類和香豆素類、生物堿類、酚酸類、核苷酸及其衍生物、有機(jī)酸類、脂質(zhì)含量上升。

2.2 鐵觀音包揉過(guò)程中非揮發(fā)性差異代謝物篩選

為進(jìn)一步了解包揉工藝對(duì)非揮發(fā)性代謝物的影響，對(duì)不同包揉階段的差異代謝物進(jìn)行篩選。如圖3A所示，在RN vs CQ、CQ vs BY和BY vs BL的3 個(gè)比較組中分別篩選出差異代謝物201 種（105 種上調(diào)，96 種下調(diào)）、269 種（116 種上調(diào)，153 種下調(diào)）和258 種（154 種上調(diào)，104 種下調(diào)）。不同包揉階段的差異代謝物種類存在差別，且上下調(diào)數(shù)量不同，隨著包揉加工的進(jìn)行，類黃酮、糖及醇類主要呈下調(diào)趨勢(shì)，脂質(zhì)呈上調(diào)趨勢(shì)（圖3B）。另外，在包揉過(guò)程中有差異代謝物46 種，包括草酸、丙二酸、沒(méi)食子兒茶素、香草酸乙酯、山柰酚-3-O-(2”-沒(méi)食子酰)葡萄糖苷、槲皮素-3-O-(6”-O-沒(méi)食子酰)半乳糖苷和茶黃素-3-沒(méi)食子酸酯等（圖3C）。

圖3 鐵觀音包揉階段非揮發(fā)性差異代謝物的篩選Fig.3 Screening of differential non-volatile metabolites in Tieguanyin oolong tea during wrapping-rolling stages

2.3 鐵觀音包揉過(guò)程中非揮發(fā)性差異代謝物變化規(guī)律

在3 個(gè)比較組中共鑒定出差異代謝物468 種，包括黃酮107 種、酚酸80 種、脂質(zhì)72 種、生物堿33 種、氨基酸及其衍生物31 種、核苷酸及其衍生物30 種、有機(jī)酸26 種、糖及醇類24 種、鞣質(zhì)20 種、木脂素和香豆素18 種、萜類3 種和其他類24 種。為研究不同樣品組間差異代謝物的變化趨勢(shì)，將全部差異代謝物的相對(duì)含量進(jìn)行Z-score標(biāo)準(zhǔn)化，隨后進(jìn)行K均值（K-Means）HCA（圖4），結(jié)果顯示，包揉過(guò)程中的差異代謝物主要分為8 種變化趨勢(shì)，其中趨勢(shì)3和6中的114 個(gè)差異代謝物在包揉過(guò)程中總體呈上調(diào)模式；趨勢(shì)1和5中的113 個(gè)差異代謝物在包揉過(guò)程中總體呈下調(diào)模式；趨勢(shì)7中的差異代謝物主要在BL階段下調(diào)，且最終含量低于RN。

圖4 所有差異代謝物的K均值HCA圖Fig.4 K-means cluster analysis of all differential metabolites

包揉過(guò)程中，各活性物質(zhì)間的相互協(xié)調(diào)對(duì)鐵觀音特征風(fēng)味品質(zhì)的形成起到重要作用。為進(jìn)一步分析包揉過(guò)程中的非揮發(fā)性特征差異代謝物，本研究將上述5 種存在明顯變化趨勢(shì)的代謝物進(jìn)行可視化，并對(duì)其進(jìn)一步討論。

2.3.1 鐵觀音包揉過(guò)程中呈下降趨勢(shì)的非揮發(fā)性特征差異代謝物分析

類黃酮為茶葉中的關(guān)鍵次生代謝產(chǎn)物，與烏龍茶滋味的形成密切相關(guān)，是苦澀味形成的主要原因[23]。由圖5可知，類黃酮在包揉過(guò)程中呈下降趨勢(shì)，主要在BY和BL階段變化顯著，這與張妍等[11]研究結(jié)果一致。在茶葉中，黃酮醇糖苷類主要以O(shè)-糖苷的形式存在，在苷元的C-3位具有糖苷部分（如槲皮素、山柰酚和楊梅素），其含量越低，則茶湯滋味愈加醇和，反之則苦澀[24]。本研究中，山柰酚-3-O-阿拉伯糖苷、山柰酚-3-O-(6”-丙二酰)半乳糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷和山柰酚-3-O-葡萄糖鼠李糖苷等黃酮醇糖苷類在包揉過(guò)程中呈下降趨勢(shì)；此外，沒(méi)食子兒茶素、芹菜素-8-C-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-新橙皮糖苷等呈先上升后下降趨勢(shì)。研究表明，山柰酚-3-O-葡萄糖苷和山柰酚-3-O-半乳糖苷為茶葉澀味成分且閾值極低，對(duì)影響茶湯口感有重要作用[25]；黃酮類受到高溫、氧化、物理機(jī)械等作用而發(fā)生反應(yīng)，兒茶素和黃酮醇苷的含量降低，使茶湯愈加醇和[26]。本研究中大多數(shù)黃酮醇糖苷類化合物含量下降，可能是包揉過(guò)程中的高溫濕熱作用和高強(qiáng)度的揉搓擠壓力促進(jìn)其發(fā)生非酶促氧化、熱解和聚合轉(zhuǎn)化等反應(yīng)，苷類配基脫去，轉(zhuǎn)化為黃酮或黃酮醇，有助于減輕茶湯苦澀感。此外，異阿魏酸和咖啡酸在包揉結(jié)束后含量達(dá)到最低值，茶葉中的咖啡酸含量越高其茶湯苦味和澀味越明顯[27]，因此包揉過(guò)程中其茶葉苦澀味降低還可能與酚酸類含量降低有關(guān)。

隨著包揉加工的進(jìn)行，氨基酸及其衍生物（L-谷氨酸）和糖及醇類（如D-蔗糖、D-潘糖、D-麥芽四糖、蔗果四糖等）呈持續(xù)下降趨勢(shì)，L-亮氨酸、L-酪氨酸和水蘇糖則呈先上升后下降趨勢(shì)。谷氨酸與茶湯鮮味呈正相關(guān)，茶湯的甜味強(qiáng)度和糖類物質(zhì)、甜味氨基酸呈顯著正相關(guān)[28-29]；因此包揉過(guò)程中氨基酸及其衍生物和糖及醇類含量的下降可能影響茶湯滋味的鮮爽度和甜度。包揉加工的過(guò)程中茶葉伴隨著兩次高溫烘焙，茶葉在高溫作用下易發(fā)生Strecker降解和美拉德反應(yīng)使糖及氨基酸轉(zhuǎn)化為香氣等物質(zhì)[30]，氨基酸及糖類物質(zhì)含量下降可能與包揉過(guò)程高溫烘焙轉(zhuǎn)化為香氣等物質(zhì)有關(guān)。

2.3.2 鐵觀音包揉過(guò)程呈上升趨勢(shì)非揮發(fā)性特征差異代謝物分析

由圖6可知，槲皮素-7-O-葡萄糖苷和山柰酚在包揉過(guò)程中含量增加，隨著包揉加工的進(jìn)行山柰酚含量增加，而山柰酚糖苷類化合物含量下降，這也進(jìn)一步證實(shí)了包揉過(guò)程中存在黃酮醇糖苷類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。茶葉中的酚酸按其結(jié)構(gòu)性質(zhì)可分為苯甲酸和羥基肉桂酸的衍生物，對(duì)茶湯滋味和香氣均存在影響[27]；包揉過(guò)程中的香草酸甲酯和4-O-咖啡?？鼘幩岷吭黾?。香草酸甲酯是葡萄酒中對(duì)其香氣貢獻(xiàn)度較大的揮發(fā)性香味成分[31]，可能對(duì)鐵觀音的特征風(fēng)味品質(zhì)形成具有貢獻(xiàn)，而4-O-咖啡酰奎寧酸是咖啡酸的衍生物，包揉過(guò)程中咖啡酸含量下降伴隨著4-O-咖啡酰奎寧酸含量的增加，說(shuō)明包揉過(guò)程中的差異代謝物處于動(dòng)態(tài)變化，有利于改善鐵觀音的滋味。

圖6 包揉過(guò)程中呈上升趨勢(shì)的特征差異代謝物熱圖Fig.6 Heatmaps of characteristic differential metabolites showing an upward trend during the wrapping-rolling process

脂質(zhì)是一種重要的生物活性物質(zhì)，其獨(dú)特而豐富的風(fēng)味和香氣是高品質(zhì)烏龍茶不可或缺的[32]。隨著包揉加工的進(jìn)行，游離脂肪酸（棕櫚油酸、亞麻酸甲酯、11-十八碳烯酸和月桂酸）、甘油酯（2-α-亞麻酸甘油酯和1-α-亞麻酸甘油酯）、溶血磷脂酰乙醇胺18:0、溶血磷脂酰膽堿20:1等主要呈上升趨勢(shì)。棕櫚油酸是脂肪酸揮發(fā)物前體物質(zhì)，易轉(zhuǎn)化為庚醛、壬醛和庚醇[33]。磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺在加熱條件下還可誘導(dǎo)脂質(zhì)降解，形成羰基代謝物[34]。

包揉過(guò)程中的茶葉發(fā)生葉組織晶格位移、組織細(xì)胞排列不整齊的現(xiàn)象，茶汁外溢，受到力和高溫濕熱共同作用[11]。本研究中，包揉葉在CQ階段主要以機(jī)械產(chǎn)生的揉搓擠壓力為主，在BY和BL階段的茶葉樣品同時(shí)受高溫烘焙和機(jī)械作用力影響，因此脂質(zhì)類化合物相較于RN變化顯著。高溫改變?nèi)~綠體中類囊體的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，導(dǎo)致磷脂酰乙醇胺的含量降低，而甘油酯（甘油三酯和甘油二酯）含量增加[35]。游離脂肪酸、甘油酯和溶血磷脂類化合物含量增加可能與包揉過(guò)程中的高溫烘焙和機(jī)械力作用有關(guān)。Guo Li等[36]研究表明鐵觀音的脂肪酸含量在造型階段增加，而在干燥過(guò)程中顯著下降。Feng Zhihui等[37]研究認(rèn)為茶葉加工過(guò)程中部分脂肪酸易轉(zhuǎn)化為脂肪酸揮發(fā)物，在后期干燥過(guò)程轉(zhuǎn)化為醇、酯、醛和酮等。由此可知，鐵觀音包揉過(guò)程中的脂質(zhì)類化合物含量增加還可為后期干燥過(guò)程中脂肪酸類揮發(fā)性成分的轉(zhuǎn)化提供有利條件。

2.4 鐵觀音包揉過(guò)程中揮發(fā)性代謝物組成分析

對(duì)鐵觀音不同包揉階段的4 個(gè)加工樣品進(jìn)行揮發(fā)性代謝組學(xué)研究，如表1所示，共篩選鑒定出47 種揮發(fā)性成分，包括酯類20 種、萜烯類13 種、醇類7 種、酮類2 種、醛類2 種和其他類3 種。基于47 種揮發(fā)性成分的峰面積進(jìn)行PCA，如圖7A所示，PC1和PC2分別為74.67%和13.31%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為87.98%，圖中4 個(gè)樣品組間有較好地區(qū)分，說(shuō)明在包揉過(guò)程中其代謝物含量與組成發(fā)生明顯變化。PCA結(jié)果能夠較好反映出包揉過(guò)程中4 組樣品之間的揮發(fā)性代謝物差異。隨后進(jìn)行HCA，圖7B中的各樣本組內(nèi)重復(fù)性好，組間有較好地區(qū)分，說(shuō)明在不同包揉階段的香氣特征差異明顯，這與PCA結(jié)果一致。

表1 包揉過(guò)程中的揮發(fā)性成分及含量Table 1 Contents of volatile components during wrapping-twisting process

烏龍茶包揉過(guò)程中其香氣特征主要受萜烯類、醇類、酯類和酮類等香氣組分含量的影響[11]，不同包揉階段的各揮發(fā)性組分種類相同，其含量為萜烯類＞醇類＞酯類＞其他類＞酮類＞醛類，且隨著包揉加工的進(jìn)行，各組分相對(duì)含量總體呈下降趨勢(shì)（圖7C）。

通過(guò)對(duì)表1中各揮發(fā)性成分分析發(fā)現(xiàn)，隨著包揉加工的進(jìn)行，具有脂肪香或青草味等不愉悅氣味的β-紅沒(méi)藥烯、庚醛、(E)-2-己烯基己酸酯和順-3-己烯基異丁酸酯等含量呈下降趨勢(shì)。具有花香、果香或奶香的揮發(fā)性成分含量則呈兩種變化趨勢(shì)。

研究表明，包揉成品茶中醇類化合物含量較高[9]，包揉過(guò)后，茶葉香氣的總量下降，芳樟醇及其氧化物、順式茉莉酮和α-法尼烯等相對(duì)含量減少[41]，這與本研究結(jié)果一致。烏龍茶在生產(chǎn)過(guò)程中由多重壓力導(dǎo)致特征香氣形成，包揉過(guò)程中的機(jī)械力作用促使細(xì)胞破碎，在濕熱作用下促使葉綠素降解，兒茶素自動(dòng)氧化等，影響茶葉香氣[10,42]，其中烘焙處理會(huì)導(dǎo)致鐵觀音香氣組分發(fā)生明顯變化[42]。大多數(shù)揮發(fā)性成分含量在包揉過(guò)程中下降，可能是包揉產(chǎn)生高強(qiáng)度的機(jī)械力作用使細(xì)胞破碎，茶汁擠出，同時(shí)兩次高溫烘焙處理增加了葉表溫度，包揉過(guò)程中的物質(zhì)間相互接觸，濕熱和非酶性氧化等作用促使揮發(fā)性代謝物發(fā)生熱降解、熱聚合等反應(yīng)，導(dǎo)致其含量降低。由此可知，在包揉過(guò)程中的機(jī)械力作用和烘焙處理可能是影響茶葉揮發(fā)性成分含量變化的重要因素。α-法尼烯、芳樟醇、茉莉內(nèi)酯和順式茉莉酮等是組成烏龍茶的特征香氣成分，在加工過(guò)程中其含量下降，但仍對(duì)烏龍茶具有重要貢獻(xiàn)[44]。因此本研究中大多數(shù)花香類化合物相對(duì)含量的下降并不能代表對(duì)鐵觀音總體香氣特征的貢獻(xiàn)度，本實(shí)驗(yàn)將結(jié)合香氣閾值對(duì)其進(jìn)一步探討。

2.5 鐵觀音包揉過(guò)程中的特征香氣分析

OAV是結(jié)合揮發(fā)性化合物的濃度和香氣閾值來(lái)評(píng)價(jià)各揮發(fā)性成分對(duì)其樣品風(fēng)味貢獻(xiàn)大小的一種方法，OAV＞1被認(rèn)為對(duì)茶葉的整體香氣特征具有貢獻(xiàn)，其OAV＞10則貢獻(xiàn)顯著[20]。如表2所示，共篩選鑒定出14 種OAV＞1的香氣成分，包括苯甲酸己酯、水楊酸甲酯、茉莉酸甲酯、茉莉內(nèi)酯、羅勒烯、(E)-β-羅勒烯、α-法尼烯、月桂烯、芳樟醇氧化物II、芳樟醇氧化物I、芳樟醇、順式茉莉酮、香葉基丙酮和庚醛。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)有6 種OAV＞10的揮發(fā)性成分，其中OAV＞100的為芳樟醇，10＜OAV≤100的為α-法尼烯、順式茉莉酮、茉莉酸甲酯、茉莉內(nèi)酯和羅勒烯。

表2 包揉過(guò)程中揮發(fā)性成分的OAVTable 2 OAV of volatile components during wrapping-twisting process

Zheng Yucheng等[19]研究表明具有花香的芳樟醇（OAV＝50.6）是鐵觀音的特征香氣成分，在加工過(guò)程中呈現(xiàn)較高的OAV。Feng Zhihui等[46]研究表明茉莉酸甲酯（OAV＝15）是安溪鐵觀音中似蘭花香的主要香氣成分之一，其氣味強(qiáng)度與茶葉中茉莉酸甲酯的濃度直接相關(guān)。茉莉內(nèi)酯有助于鐵觀音茶湯呈現(xiàn)奶香和甜美花香[47]。榮波等[48]研究發(fā)現(xiàn)茉莉內(nèi)酯和順式茉莉酮是鐵觀音的關(guān)鍵香氣成分，其中具有花香和甜香的順式茉莉酮OAV＞10?？梢园l(fā)現(xiàn)，在14 種OAV＞1的揮發(fā)性成分中，除具有青草味的庚醛和冬青油香的水楊酸甲酯外，其他12 種揮發(fā)性成分可能對(duì)不同包揉階段的鐵觀音呈花香、果香和奶香的特征具有貢獻(xiàn)，以芳樟醇、α-法尼烯、順式茉莉酮、茉莉酸甲酯、茉莉內(nèi)酯和羅勒烯對(duì)不同包揉階段的鐵觀音具有濃郁的花香、果香和奶香特征的貢獻(xiàn)顯著。值得注意的是，包揉使一些具有脂肪香、青草味和花香、果香化合物含量下降的同時(shí)改變了香氣成分的組成，部分具有不良風(fēng)味的揮發(fā)性成分散失，促使花香更顯露，起到純化香氣的作用，盡管鐵觀音中的關(guān)鍵呈香成分的含量在包揉過(guò)程中主要呈下降趨勢(shì)（表1），包揉結(jié)束后其OAV仍然大于1，其對(duì)鐵觀音在包揉過(guò)程中形成的特征風(fēng)味仍具有貢獻(xiàn)。

3 結(jié)論

采用廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)和HS-SPME-GC-MS技術(shù)檢測(cè)鐵觀音包揉過(guò)程中非揮發(fā)性及揮發(fā)性代謝物。非揮發(fā)性代謝組學(xué)分析表明：在不同包揉階段共鑒定出12 類973 種非揮發(fā)性代謝物，隨著包揉加工的進(jìn)行，類黃酮、氨基酸及其衍生物、糖及醇類呈下降趨勢(shì)，脂質(zhì)類代謝物呈上升趨勢(shì)，其中具有明顯苦澀味的山柰酚-3-O-葡萄糖苷和咖啡酸在包揉結(jié)束后含量下降，有助于減輕茶湯苦澀，使滋味更醇和，棕櫚油酸、1-α-亞麻酸甘油酯含量增加可為后期干燥過(guò)程中特征香氣成分的轉(zhuǎn)化提供有利條件。揮發(fā)性代謝組學(xué)分析表明：不同包揉階段共鑒定出6 類47 種揮發(fā)性成分，揮發(fā)性組分相對(duì)含量總體下降。具有脂肪香或青草味等不愉悅氣味的β-紅沒(méi)藥烯、庚醛、(E)-2-己烯基己酸酯和順-3-己烯基異丁酸酯等的含量呈下降趨勢(shì)，呈花香、果香的茉莉酸甲酯、苯甲酸芐酯、香葉基丙酮和3,7-二甲基-1,5,7-辛三烯-3-醇等的含量呈上升趨勢(shì)，使鐵觀音茶葉花果香更顯幽雅。本研究基于代謝組學(xué)技術(shù)了解包揉過(guò)程中的非揮發(fā)性和揮發(fā)性特征差異代謝物變化規(guī)律，為后期烏龍茶包揉品質(zhì)形成機(jī)制研究提供一定理論參考。