小麥非麩質(zhì)致敏原α-淀粉酶抑制劑的表位定位及消減技術(shù)

王 垚，張巧智，王彥波，傅玲琳

（浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江食品質(zhì)量安全工程研究院，浙江 杭州 310018）

當前，全球范圍內(nèi)食物過敏的發(fā)病率逐年上升，食物過敏已經(jīng)成為嚴重的食品安全和公共衛(wèi)生問題。在易導致過敏的食物中，小麥、牛奶、芝麻、雞蛋、堅果、花生、魚和貝類是最常見的8 大類過敏原，能夠引起90%以上的食物過敏反應[1-2]。在歐美、澳大利亞等西方國家，食物過敏在兒童中的患病率約為8%，在成人中的患病率約為2%[3]。在我國，9 歲以下的兒童主要對牛奶、雞蛋和水果蔬菜等過敏，10 歲以上的青年及成人主要對小麥過敏。在各類誘發(fā)過敏的原因中，食物過敏占了77%，其中占比最高的是小麥，占到了37%[4]。

小麥是世界衛(wèi)生組織報道的八大常見過敏食物之一，其引發(fā)的過敏主要是由IgE介導的過敏反應，屬I型超敏反應[5-9]。目前世界衛(wèi)生組織過敏原命名小組委員會已公布的小麥致敏原高達28 種，分別命名為Tri a 12～Tri a 21、Tri a 25～Tri a 40。根據(jù)在不同溶劑（如水、鹽、稀酸/堿和乙醇）中的溶解度不同，可將小麥蛋白分為球蛋白、清蛋白、麥谷蛋白和醇溶蛋白組分，其中小麥麩質(zhì)蛋白由醇溶蛋白和麥谷蛋白組成[10]。

目前，針對小麥致敏原抗原表位的研究主要集中在麩質(zhì)致敏原上，如Battais等[11]鑒定了γ-醇溶蛋白的抗原表位；Tanabe[12]鑒定了醇溶蛋白的表位PQQPF與QQPFP；Matsuo等[13]揭示了高分子質(zhì)量麥谷蛋白的表位QQPGQ與QQSGQGQ等。除麩質(zhì)致敏原外，小麥蛋白中還含有多種非麩質(zhì)致敏原，主要包括非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白、β-淀粉酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶、硫醇還原酶同源物、四聚體α-淀粉酶抑制劑 CM3、二聚體α-淀粉酶抑制0.19、硫氧還原蛋白等[14]。研究發(fā)現(xiàn)，小麥非麩質(zhì)蛋白是過敏性皮炎及面包師哮喘的主要致敏原，與70%～80%患者血清中的IgE有陽性反應[15-16]。此外，Battais等[17]也發(fā)現(xiàn)小麥非麩質(zhì)蛋白是引起法國地區(qū)兒童過敏性皮炎的主要原因。類似地，Pastorello等[18]發(fā)現(xiàn)α-淀粉酶抑制劑CM3是引發(fā)日本地區(qū)人群小麥過敏性皮炎的主要蛋白。

在食物致敏反應進程中，致敏原的抗原特異性基團（即抗原表位，也稱抗原決定簇）通過與特異性抗體IgE識別結(jié)合，激活下游效應細胞（如肥大細胞等）從而引發(fā)過敏反應[19]，因此，致敏原的抗原表位在誘發(fā)食物過敏反應中具有十分重要的作用。表位是致敏反應的物質(zhì)基礎，被定義為氨基酸的短連續(xù)序列[20]，根據(jù)結(jié)構(gòu)的不同，可分為線性表位和構(gòu)象表位。線性表位指由連續(xù)性排列的氨基酸殘基所組成的短肽，并且可以和特定的抗體發(fā)生反應，構(gòu)象表位是由正確折疊的蛋白空間分布上連續(xù)或相鄰的氨基酸組成，分布于肽鏈不同部位或者不同肽鏈上[21-23]。根據(jù)抗體與抗原受體結(jié)合的不同可將表位分成B細胞表位和T細胞表位[24]。

表位定位是致敏原研究的基礎。目前，致敏原表位定位的主要方法有蛋白質(zhì)裂解、重疊肽技術(shù)、肽指紋圖譜連用法、晶體復合物結(jié)構(gòu)分析以及生物信息學分析等。其中，重疊肽技術(shù)[25]是將致敏原的一級結(jié)構(gòu)分成多個連續(xù)重疊的肽段進行合成，并使用特定抗體進一步篩選出能夠產(chǎn)生陽性反應的肽段，但是只適用于線性表位的定位。蛋白質(zhì)裂解與肽指紋圖譜聯(lián)用法是對經(jīng)酶或其他試劑切割后的肽段進一步用抗體去分析定位，這種方法對線性表位區(qū)域的定位不全面，花費較大且耗時較長。晶體復合物結(jié)構(gòu)分析是通過解析致敏原與其抗體產(chǎn)生晶體復合物結(jié)構(gòu)[26]，是較為理想的直觀確定蛋白構(gòu)象表位的方法，但是該方法僅適用于單克隆抗體。近年來隨著科技的進步，生物信息學技術(shù)廣泛應用于抗原表位的定位，它主要根據(jù)目前已知抗原表位區(qū)域的序列以及其結(jié)構(gòu)特點，分析形成抗原表位區(qū)域的特征和規(guī)律，從而推測出目標致敏原中可能形成抗原表位的部位，操作快速且驗證方便，可在短時間內(nèi)對多個致敏原的抗原表位進行預測鑒定。

在致敏原表位定位的基礎上，有必要對其消減方法進行研究。采用消減技術(shù)有效降低小麥蛋白的致敏性有利于提高小麥過敏人群的生活質(zhì)量，目前主要的消減技術(shù)有加熱、微波、高壓、超聲等，但它們對小麥制品的營養(yǎng)物質(zhì)破壞較大[27]。多酚是一類植物源天然成分，本身具有多種健康促進作用[28]，存在于茶、蔬菜、豆類等食物中；研究發(fā)現(xiàn)多酚具有降敏潛力[29]，酚類物質(zhì)通過與致敏原非共價或共價相互作用[30-34]，降低了抗原蛋白的IgE結(jié)合能力并減輕了肥大細胞脫顆粒程度，是一種有前景的致敏原消減手段，然而目前針對多酚與小麥致敏原互作構(gòu)建低敏蛋白體系的研究報道較少。

鑒于此，本研究以小麥非麩質(zhì)致敏原α-淀粉酶抑制劑為研究對象，通過生物信息學工具對其抗原表位進行預測，篩選出潛在致敏原表位，并對表位肽段進行合成，經(jīng)間接競爭酶聯(lián)免疫吸附實驗（indirect competition enzyme-linked immunosorbent assay，ic-ELISA）對候選表位進行驗證，從而得到α-淀粉酶抑制劑的表位，進一步通過茶多酚與α-淀粉酶抑制劑互作構(gòu)建復合物對致敏原進行消減，探究其消減效果及消減機制，以期對小麥非麩質(zhì)致敏原表位的定位及非麩質(zhì)致敏原的消減方法提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

α-淀粉酶抑制劑 美國Sigma公司；小麥過敏血清重慶沃卡威生物技術(shù)有限公司；表沒子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG，純度≥98%）、表沒食子酸兒茶素（epigallocatechin，EGC，純度≥98%）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；HRP標記的山羊抗人IgE 美國Abcam公司；3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）單組分底物溶液北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Milli-Q超純水裝置 美國Millipore公司；MOS-450圓二色譜儀 美國BioLogic公司；LRH-250A培養(yǎng)箱上海科學儀器有限公司；Spectra Max i3x酶標儀 美國Molecular Devices公司；LGJ-12真空冷凍干燥機 北京松原華興科技有限公司；Vortex Mixer V8臺式恒溫振蕩器 太倉實驗有限公司；Legend Micro 21 R離心機美國Thermo Fisher Scientific公司；RF-5301PC熒光分光光度計、UV2600紫外-可見分光光度計 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 抗體血清池

收集5 名小麥過敏患者陽性血清，他們在攝入小麥后均有速發(fā)型超敏反應史，具體信息見表1。通過ic-ELISA證實過敏患者血清與α-淀粉酶抑制劑的強結(jié)合能力。將5 名小麥過敏患者陽性血清進行等體積混合后作為血清池，然后貯存在－80 ℃，待用。

表1 小麥過敏病人陽性血清信息Table 1 Information of sera from patients with wheat allergy included in this study

1.3.2 致敏原氨基酸序列

致敏原α-淀粉酶抑制劑的登錄號從過敏原在線（http://www.allergenonline.org/）獲得，為CAI84642。α-淀粉酶抑制劑的氨基酸序列從美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）獲得。α-淀粉酶抑制劑含有119 個氨基酸。

1.3.3 線性表位預測

1.3.3.1 DNAStar Protean軟件預測抗原表位

使用DNAStar中的Protean程序?qū)Ζ?淀粉酶抑制劑的抗原表位進行預測，其中親水性分析選擇Hoop-Woods、Kyte-Doolittle算法，溶劑可及性分析選擇Emini-Surface Probability算法，抗原指數(shù)分析選擇Jameson-Wolf算法，可塑性分析選擇Karplus-Schultz算法[35-36]。

1.3.3.2 IMED、IEDB線上預測抗原表位

利用IMED（http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl）、IEDB（http://www.iedb.org/）對α-淀粉酶抑制劑的抗原表位進行在線預測[37]。

1.3.4 多肽合成

委托南京金斯瑞生物有限公司采用標準Fmoc固相合成法合成了與預測的潛在表位相對應的多肽。經(jīng)高效液相色譜鑒定，其純度均為95%以上。同時用電噴霧電離-質(zhì)譜儀對合成的多肽進行了分子質(zhì)量鑒定。

1.3.5 ic-ELISA

1.3.5.1 抗原抗體最佳反應質(zhì)量濃度測定

參照Fu Linglin等[38]的方法，并略有改動。通過棋盤法對抗原抗體最佳反應質(zhì)量濃度進行測定，具體步驟為將α-淀粉酶抑制劑用包被緩沖液稀釋至不同質(zhì)量濃度1、5、10 μg/mL，取100 μL稀釋后的樣品加入96 孔酶標板中，每個稀釋質(zhì)量濃度3 個平行，同時設置等體積等質(zhì)量濃度牛血清白蛋白作為陰性對照。將96 孔酶標板于4 ℃放置過夜。之后倒去酶標板中的包被緩沖液，在濾紙上將剩余液體拍干，每孔加入200 μL洗滌液，輕輕搖晃洗滌2 min，重復3 次。洗滌完成后，在酶標板中每孔加入100 μL封閉液，37 ℃條件下封閉2 h。封閉完成后，完成3 次洗滌步驟。在每個實驗樣品的相同稀釋倍數(shù)下每孔依次加入100 μL不同稀釋倍數(shù)的一抗，37 ℃條件下孵育1.5 h。一抗孵育完成后，洗滌3 次，在酶標板中每孔加入100 μL稀釋5 000 倍的二抗，37 ℃條件下孵育1.5 h。二抗孵育完成后，洗滌3 次。在酶標板中每孔加入100 μL TMB底物顯色，包上錫箔紙避光，37 ℃孵育30 min。酶標板顯色后，每孔用移液槍快速加入50 μL終止液，停止顯色反應。最后將酶標板置于酶標儀中，并測定其在450 nm波長下每孔的吸光度。

1.3.5.2 候選表位的驗證

用磷酸鹽緩沖液將合成的抗原表位多肽分別稀釋至0.01、0.1、1、10、100、1 000 μg/mL，對表位多肽進行抑制率的測定，其中一抗是由5 位小麥過敏患者血清組成的血清池，操作方法同1.3.5.1節(jié)，在抗原抗體反應之前，先將各抗原表位與血清池（最佳質(zhì)量濃度兩倍）等體積混合并在37 ℃的培養(yǎng)箱中共孵育1 h，然后取100 μL加入到96 孔酶標板中同包被原反應1.5 h。設置對照組：α-淀粉酶抑制劑與血清池反應液。以對照組的OD450nm作為A0，加入多肽抑制時的OD450nm作為A，則抗體-抗原的結(jié)合率為A/A0，多肽對抗體-抗原結(jié)合的競爭抑制率為1－A/A0。

1.3.6α-淀粉酶抑制劑-茶多酚復合物制備

采用非共價互作的方法，將α-淀粉酶抑制劑稀釋成1 μmol/L并與不同濃度的EGCG、EGC（0、5、10、20、25、30 μmol/L）等體積混合。將蛋白質(zhì)-多酚溶液的混合物分別在37 ℃孵育過夜[39]。

1.3.7α-淀粉酶抑制劑-茶多酚復合物IgE結(jié)合能力的測定

利用ic-ELISA確定EGCG、EGC的添加對α-淀粉酶抑制劑致敏性的影響。方法同1.3.5.1節(jié)，需要注意的是在加入一抗時，血清池與復合物提前在37 ℃下孵育1 h。

1.3.8α-淀粉酶抑制劑-茶多酚復合物的內(nèi)源熒光光譜表征

為評估與EGCG、EGC結(jié)合后對α-淀粉酶抑制劑結(jié)構(gòu)的影響，測定了α-淀粉酶抑制劑-茶多酚互作物的內(nèi)源熒光光譜。α-淀粉酶抑制劑終質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，激發(fā)與發(fā)射狹縫的寬度均設置為2 nm，電壓為400 V，使用280 nm的激發(fā)波長，在305 nm和450 nm波長范圍掃描樣品。測量3 次取平均值。

1.3.9α-淀粉酶抑制劑-茶多酚復合物的圓二色譜表征

圓二色譜法是基于左、右圓偏振光吸收不同而產(chǎn)生的橢圓偏振光。遠紫外區(qū)的圓二色譜可用于分析與茶多酚非共價結(jié)合后α-淀粉酶抑制劑的二級結(jié)構(gòu)、折疊和相互作用改變。圓二色譜中蛋白質(zhì)α-螺旋的特征峰分別在208 nm和222 nm波長處有躍遷[40]。非共價復合物按上述方法制備（1.3.6節(jié)）。復合物中α-淀粉酶抑制劑的終濃度0.2 mg/mL，α-淀粉酶抑制劑與EGCG（EGC）的物質(zhì)的量比分別為1∶0、1∶10、1∶20和1∶30。使用移液器吸取200 μL的復合物樣品，將其置于0.1 cm光學長度的石英比色皿中，在190～260 nm范圍內(nèi)進行掃描。掃描速率為100 nm/min，帶寬設置為1.0 nm。不同二級結(jié)構(gòu)相對含量計算方法如Lang Yuxi等[41]所述，采用CD Pro軟件（Bio-Logic Science Instruments）和SELCON3算法進行。

1.3.10α-淀粉酶抑制劑-茶多酚復合物的紫外光譜表征

紫外吸收光譜是一種用于測定蛋白分子氨基酸側(cè)鏈基團發(fā)色特性的光譜技術(shù)[42]，可用于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)表征，以及蛋白質(zhì)大分子與小分子的相互作用解析等[43]。將α-淀粉酶抑制劑與茶多酚復合物樣品稀釋至適當質(zhì)量濃度，使α-淀粉酶抑制劑的終質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，置于紫外分光光度計中在190～350 nm波長范圍內(nèi)的紫外吸收區(qū)進行掃描，得到紫外吸收光譜，其中磷酸鹽緩沖液作為背景溶劑當作基線進行扣除。

1.3.11α-淀粉酶抑制劑與EGCG、EGC的分子對接

為了闡明EGCG、EGC與α-淀粉酶抑制劑抗原表位及其附近殘基之間的相互作用和結(jié)合能，進一步說明EGCG、EGC對α-淀粉酶抑制劑致敏性的影響，采用AutodockVina 1.2.2，一種計算機蛋白-配體對接軟件[44]模擬α-淀粉酶抑制劑抗原表位與小分子間的相互作用。α-淀粉酶抑制劑的結(jié)構(gòu)由從RCSB PDB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org；PDB號：1HSS）下載，從PubChem化合物數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中獲得了EGCG、EGC的分子結(jié)構(gòu)[45]。首先對蛋白和配體文件進行了準備，將所有蛋白質(zhì)和分子文件都轉(zhuǎn)換為PDBQT格式。PyMOL去除了受體結(jié)構(gòu)中所有水分子，并添加了極性氫原子[46]。網(wǎng)格框居中以覆蓋每個蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域并適應自由分子運動。熱門、窮舉次數(shù)設置為8。使用Discovery studio 2016（Accelrys Software,Inc San Diego,CA,USA）軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每組實驗3 次平行，所有數(shù)據(jù)使用SPSS 16.0進行分析，并以表示。采用單因素方差分析和Duncan多極差檢驗進行統(tǒng)計學處理，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 致敏原線性表位的預測和選擇

2.1.1 DNAStar Protean軟件預測抗原表位

DNAStar Protean軟件對抗原表位的預測主要集中在致敏蛋白氨基酸殘基的理化性質(zhì)。親水性：通常位于蛋白表面的是親水性氨基酸，而疏水性氨基酸被包埋于蛋白內(nèi)部，所以抗體結(jié)合的位點一般都是親水性氨基酸殘基。溶劑可及性：表征抗原氨基酸接觸溶劑分子的可能性。柔韌性：柔韌性較大的氨基酸殘基更易形成抗原表位。二級結(jié)構(gòu)：蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)主要包括α-螺旋、β-折疊、無規(guī)卷曲和轉(zhuǎn)角等，轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲一般分布在蛋白質(zhì)的表面，與抗體更易結(jié)合，容易成為抗原表位。使用DNAStar Protean軟件對α-淀粉酶抑制劑的二級結(jié)構(gòu)、親水性、抗原指數(shù)和溶劑可及性進行分析。如圖1所示，α-淀粉酶抑制劑抗原表位預測存在的范圍為：AA22～28、56～82、102～107、114～119。

圖1 DNAStar對α-淀粉酶抑制劑抗原預測結(jié)果Fig.1 Prediction of the hydrophilicity,flexible regions,antigenic index,and surface probability of α-amylase inhibitor by DNAStar

2.1.2 IMED、IEDB線上預測抗原表位

利用IMED對α-淀粉酶抑制劑的線性表位進行了預測，結(jié)果如圖2A所示。IMED預測可能的線性表位范圍為：AA4～25、27～54、74～101、105～115。同時利用IEDB對致敏原的線性表位進行了預測，結(jié)果如圖2B所示。IEDB主要根據(jù)氨基酸序列的溶劑可及性、抗原指數(shù)以及親水性對抗原表位進行預測，最后選擇得分＞8對預測結(jié)果進行優(yōu)化。α-淀粉酶抑制劑抗原表位預測存在的范圍為：AA5～12、26～31、57～81、96～108。

圖2 IMED（A）及IEDB（B）對α-淀粉酶抑制劑抗原表位的預測Fig.2 Epitope prediction of α-amylase inhibitor by using IMED (A) and IEDB (B) databases

2.1.3α-淀粉酶抑制劑抗原表位綜合預測

綜合DNAstar Protean、IMED、IEDB 3 種方法對α-淀粉酶抑制劑氨基酸序列的預測結(jié)果，篩選柔韌性大、親水性高、溶劑可及性強、可塑性好的肽段作為候選表位[37]。表2展示了不同方法預測可能的抗原表位結(jié)果。

表2 用3 種免疫信息學工具預測α-淀粉酶抑制劑的線性表位位置Table 2 Epitope sites in α-amylase inhibitor predicted by three immunoinformatic tools

根據(jù)表2中不同方法預測的重復區(qū)域，選擇至少兩種方法預測重復的肽段范圍作為α-淀粉酶抑制劑最終候選的線性表位，結(jié)果如表3所示。最后選取6 條肽段進行Fmoc固相合成。

表3 生物信息學方法最終預測的α-淀粉酶抑制劑位點Table 3 Definitive α-amylase inhibitor sites predicted by bioinformatic methods

2.2 抗原抗體最佳質(zhì)量濃度的確定

利用小麥過敏病人的混合血清池對α-淀粉酶抑制劑的致敏性進行鑒定。如圖3A所示，患者血清中α-淀粉酶抑制劑的特異性IgE豐度較高，可以用于后續(xù)的實驗。根據(jù)棋盤法的結(jié)果，確定了抗原抗體的最佳工作質(zhì)量濃度，結(jié)果如圖3B所示，抗原包被的最佳質(zhì)量濃度為10 μg/mL，抗體血清（混合血清）的稀釋倍數(shù)為40 倍。

圖3 小麥過敏病人血清的陽性反應核驗（A）及抗原抗體最佳工作質(zhì)量濃度的確認（B）Fig.3 Serum positive reaction against α-amylase inhibitor (A) and optimal concentrations of coating antigen and antibody (B)

2.3 線性表位的驗證

利用最佳的包被抗原質(zhì)量濃度和混合血清池稀釋倍數(shù)，通過ic-ELISA測定各合成表位多肽對抗原-抗體結(jié)合反應的競爭抑制率。如圖4所示，當多肽質(zhì)量濃度在0.01～1 000 μg/mL范圍內(nèi)，P-1、P-2、P-3、P-A和P-B1這5 條多肽質(zhì)量濃度對數(shù)值和競爭抑制率呈線性關(guān)系，且對抗體血清具有較強的親和力。之后通過對表位多肽競爭抑制率曲線線性回歸，計算出競爭抑制率為50%的IC50值，如表4所示，P-1、P-3、P-B1的IC50較低，說明這3 條多肽對小麥過敏血清的親和力更好，因此從預測的6 條多肽里確定了P-1、P-2、P-3、P-B1為潛在的表位。P-4的抑制率曲線方程不呈線性關(guān)系，P-A的抑制率曲線方程雖然呈線性關(guān)系，但IC50相對較高。P-4競爭抑制率不呈線性關(guān)系的原因推測可能是多肽對小麥過敏血清的親和力過弱[38,47]。

圖4 合成表位多肽對抗原-抗體結(jié)合的抑制率曲線Fig.4 Inhibition rate curve of each synthesized epitope peptide against the antigen-antibody binding

表4 α-淀粉酶抑制劑表位多肽抑制率曲線回歸方程Table 4 Regression equations for inhibition rates of epitope peptides against α-amylase inhibitor

2.4 α-淀粉酶抑制劑-EGCG/EGC復合物的IgE結(jié)合能力

在致敏原表位定位的基礎上，有必要對其消減方法進行研究。已有研究表明，多酚類物質(zhì)可以通過與致敏原蛋白發(fā)生非共價互作，改變致敏原構(gòu)象結(jié)構(gòu)及其抗原表位的可及性從而實現(xiàn)消減致敏性的目的[48]。本研究采用常見的多酚EGCG、EGC對小麥致敏原進行修飾，獲得α-淀粉酶抑制劑-EGCG/EGC互作物，然后對多酚消減α-淀粉酶抑制劑的效果進行評價。

如圖5所示，抑制率較低的樣品，說明該濃度的多酚對α-淀粉酶抑制劑有較好的消減效果。隨著EGCG濃度的增加，EGCG對α-淀粉酶抑制劑的致敏性消減能力逐步提高（圖5A），其原因可能是EGCG通過改變蛋白的結(jié)構(gòu)影響其表位的結(jié)構(gòu)或可及性，從而抑制致敏原對特異性IgE的識別[49-50]。α-淀粉酶抑制劑-EGC復合物的IgE結(jié)合能力也呈相同趨勢（圖5B）。此外，發(fā)現(xiàn)相同濃度下EGC的消減效果較EGCG低，推測其原因可能是EGCG的分子質(zhì)量較EGC大，與蛋白的親和力高，可占據(jù)更多的殘基結(jié)合位點，進而掩蓋更多的IgE表位[51]。另有文獻報道，分子質(zhì)量越大的多酚，越能有效地沉淀蛋白質(zhì)，從而改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，降低致敏性[31]。

圖5 α-淀粉酶抑制劑-EGCG/EGC復合物的IgE結(jié)合能力Fig.5 IgE-binding capacity of α-amylase inhibitor-EGCG/EGC complexes

2.5 α-淀粉酶抑制劑-EGCG/EGC復合物的內(nèi)源熒光光譜表征

內(nèi)源熒光光譜可以評價蛋白與多酚互作后對蛋白微環(huán)境的影響。蛋白質(zhì)中含有色氨酸，當激發(fā)波長為280 nm時會產(chǎn)生熒光，熒光強度改變，說明蛋白質(zhì)中暴露的色氨酸殘基微環(huán)境發(fā)生了變化[52]。多酚添加后對α-淀粉酶抑制劑內(nèi)源熒光光譜的影響如圖6所示。所有樣品中都觀察到了α-淀粉酶抑制劑固有熒光的猝滅效應，且猝滅程度與多酚濃度呈正相關(guān)，說明多酚與α-淀粉酶抑制劑的相互作用影響了后者的熒光基團特性。此外，所有樣品的最大熒光發(fā)射波長均在350 nm附近。α-淀粉酶抑制劑與EGCG/EGC結(jié)合后產(chǎn)生的熒光猝滅現(xiàn)象，推測原因可能是蛋白與多酚互作后改變了前者的構(gòu)象結(jié)構(gòu)，使α-淀粉酶抑制劑中暴露的色氨酸殘基減少。同時也觀察到同濃度的EGCG、EGC與α-淀粉酶抑制劑分別結(jié)合后，EGCG對α-淀粉酶抑制劑的熒光猝滅程度更大，原因可能是EGCG分子質(zhì)量較EGC大，與α-淀粉酶抑制劑形成互作物后，使色氨酸處于更加包埋的狀態(tài)。

圖6 α-淀粉酶抑制劑-EGCG復合物（A）與α-淀粉酶抑制劑-EGC復合物（B）的熒光光譜Fig.6 Fluorescence spectra of α-amylase inhibitor-EGCG complexes (A) and α-amylase inhibitor-EGC complexes (B)

2.6 α-淀粉酶抑制劑-EGCG/EGC復合物的圓二色譜表征

IgE結(jié)合能力發(fā)生改變的原因是抗原表位的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[53]。圓二色譜可用于表征蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。如圖7所示，多酚的加入影響了小麥α-淀粉酶抑制劑的二級結(jié)構(gòu)。對于α-淀粉酶抑制劑-EGCG復合物，隨著EGCG濃度的提高，蛋白無規(guī)卷曲的占比增加，α-螺旋的占比逐漸減小，β-轉(zhuǎn)角占比變化不明顯。而對于α-淀粉酶抑制劑-EGC復合物，其與α-淀粉酶抑制劑-EGCG復合物中蛋白的二級結(jié)構(gòu)變化規(guī)律相似，即隨著EGC濃度的升高，無規(guī)卷曲的占比增加，β-轉(zhuǎn)角占比變化不明顯，但β-折疊占比逐漸減小?？傮w而言，EGC、EGCG與小麥α-淀粉酶抑制劑復合后對后者的二級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定的影響，主要表現(xiàn)在β-折疊、α-螺旋向無規(guī)卷曲轉(zhuǎn)變。Rawel等[54]研究也發(fā)現(xiàn)綠原酸與牛血清白蛋白形成復合物后，蛋白質(zhì)的無規(guī)卷曲占比增加，α-螺旋占比下降。Bohin等[55]發(fā)現(xiàn)無規(guī)卷曲是蛋白質(zhì)中的開放結(jié)構(gòu)，在蛋白質(zhì)和表沒食子兒茶素沒食子酸酯的結(jié)合中起到重要作用。同時，致敏原結(jié)構(gòu)的改變導致其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性下降，進而可能改變抗原表位的結(jié)構(gòu)特性，最終影響抗原結(jié)合能力，改變蛋白致敏性[53]。Liu Fuguo等[49]研究發(fā)現(xiàn)EGCG/綠原酸與乳鐵蛋白結(jié)合后致使后者的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，進而影響了表位結(jié)構(gòu)并降低了蛋白的致敏能力。類似地，Xu Haoxie等[50]發(fā)現(xiàn)牛乳乳清蛋白和雞蛋卵白蛋白均可與綠原酸相互作用，通過改變蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，破壞其構(gòu)象或線性表位的結(jié)構(gòu)/可及性，進而達到消減蛋白致敏性的效果。

圖7 α-淀粉酶抑制劑-EGCG復合物（A）與α-淀粉酶抑制劑-EGC復合物（B）二級結(jié)構(gòu)的相對含量Fig.7 Relative contents of secondary structures in α-amylase inhibitor-EGCG complexes (A) and α-amylase inhibitor-EGC complexes (B)

2.7 α-淀粉酶抑制劑-EGCG/EGC復合物的紫外光譜表征

紫外吸收光譜反映了色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸殘基所處的微環(huán)境變化，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化可以由吸收峰的強度與形狀體現(xiàn)出來。如圖8所示，與α-淀粉酶抑制劑對照相比，隨著EGCG濃度的提高，α-淀粉酶抑制劑-EGCG復合物中蛋白吸收峰的強度持續(xù)降低，峰的強度改變說明了蛋白與小分子的相互作用。而隨著EGC濃度的提高，α-淀粉酶抑制劑-EGC復合物中蛋白的吸收峰強度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，分析原因可能是EGC的加入改變了相鄰蛋白間相互作用，隨著EGC濃度的提高，使得更多的色氨酸和酪氨酸基團暴露到周圍溶劑中，故紫外吸收強度先升高，但EGC濃度過高反而掩蓋了部分色氨酸和酪氨酸基團，從而紫外吸收強度又出現(xiàn)降低[40]。此外，α-淀粉酶抑制劑和EGCG/EGC復合后的蛋白中也觀察到最大吸收波長右移（紅移）的現(xiàn)象，說明多酚與α-淀粉酶抑制劑相互作用使得蛋白質(zhì)疏水氨基酸殘基所處的微環(huán)境發(fā)生改變。

圖8 α-淀粉酶抑制劑-EGCG復合物（A）與α-淀粉酶抑制劑-EGC復合物（B）的紫外吸收光譜Fig.8 UV absorption spectra of α-amylase inhibitor-EGCG complexes (A) and α-amylase inhibitor-EGC complexes (B)

2.8 α-淀粉酶抑制劑與EGCG/EGC的分子對接分析

通過Autodock分子對接軟件進行結(jié)合位點掃描，發(fā)現(xiàn)α-淀粉酶抑制劑可與EGCG/EGC相結(jié)合，然后對α-淀粉酶抑制劑和EGCG/EGC小分子配體進行能量計算，選取蛋白質(zhì)和EGCG/EGC配體的在最低能量下匹配的結(jié)果，從而獲得理論的α-淀粉酶抑制劑-小分子復合物，通過軟件模擬出可能的結(jié)合方式及其位點[44]。其中，α-淀粉酶抑制劑與EGCG結(jié)合的自由能ΔG為－7.46 kJ/mol，與EGC結(jié)合的自由能ΔG為－6.43 kJ/mol，說明α-淀粉酶抑制劑與EGCG的結(jié)合更牢固。類似的，Kanakis等[46]使用分子對接技術(shù)研究了幾種不同兒茶素和β-乳球蛋白的復合，也發(fā)現(xiàn)EGCG與β-乳球蛋白的結(jié)合能力更強。使用Discovery studio 2016軟件對蛋白配體-受體相互作用進行分析，得到分子對接2D與3D圖，如圖9、10所示。3D圖直觀展示了α-淀粉酶抑制劑和EGCG/EGC的結(jié)合位點，2D圖展示了結(jié)合作用力及相互作用的氨基酸殘基。由2D圖可以看出，與EGC相比，EGCG與α-淀粉酶抑制劑氨基酸殘基有更多的作用力，主要通過氫鍵、范德華力進行相互作用。3D圖直觀展現(xiàn)出發(fā)生相互作用的氨基酸殘基具體位置，與EGCG作用的疏水性氨基酸殘基主要有Gly 55、Val 104、Ile 103、Val 105、Ala 107、Ala 124，推測EGCG有可能作用在α-淀粉酶抑制劑的疏水空腔內(nèi)。而與EGC作用的疏水性氨基酸殘基較少，僅有Val 104、Val 105、Gly 55。

圖9 α-淀粉酶抑制劑-EGCG（A）和α-淀粉酶抑制劑-EGC（B）的分子對接2D圖Fig.9 2D diagrams of molecular docking between α-amylase inhibitor and EGCG (A) and EGC (B)

圖10 α-淀粉酶抑制劑-EGCG（A）和α-淀粉酶抑制劑-EGC（B）的分子對接3D圖Fig.10 3D diagram of molecular docking between α-amylase inhibitor and EGCG (A) and EGC (B)

對α-淀粉酶抑制劑-EGCG/EGC的結(jié)合位點與其篩選出的線性表位進行比對，如表5所示，其中抑制率效果較好的P-1、P-3、P-B1三條肽段有較多的結(jié)合位點。Chen等[56]指出阻斷IgE結(jié)合表位序列中的一個氨基酸可能足以破壞IgE抗體序列特異性結(jié)合，同時多酚在IgE表位附近的結(jié)合理論上也會阻礙表位特異性IgE的空間可及性。這進一步證明了消減是多酚與α-淀粉酶抑制劑線性表位及其附近殘基相互作用的結(jié)果。Plundrich等[51]研究發(fā)現(xiàn)苯甲酸可以消減Ara h 2的致敏性，并經(jīng)過分子對接證明了Ara h 2表面共有14 個苯甲酸的潛在結(jié)合位點，苯甲酸通過氫鍵、鹽橋與各種氨基酸相互作用，這也印證了多酚可以削弱表位特異性IgE對表位的線性識別。

表5 α-淀粉酶抑制劑-EGCG/EGC的結(jié)合位點與其線性表位比較Table 5 Comparison of the binding sites of α-amylase inhibitor-EGCG/EGC complexes with their linear epitopes

3 結(jié)論

本研究通過生物信息學預測對α-淀粉酶抑制劑線性表位進行預測，經(jīng)綜合分析后篩選得到6 條候選表位。通過ic-ELISA對候選表位進行驗證，最后得到4 條線性表位。利用多酚與致敏原相互作用消減致敏，采用非共價的方法，制得α-淀粉酶抑制劑-EGCG、α-淀粉酶抑制劑-EGC復合物，利用ic-ELISA對消減效果進行研究，結(jié)果表明EGCG有較好的消減能力，且當α-淀粉酶抑制劑與EGCG物質(zhì)的量比為1∶30時，復合物與IgE結(jié)合水平達到最低水平，結(jié)合能力下降22.7%。進一步通過紫外光譜、熒光光譜、圓二色譜對復合物的結(jié)構(gòu)進行表征，結(jié)果表明當多酚加入后，復合物體系中α-淀粉酶抑制劑的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，具體表現(xiàn)為蛋白疏水氨基酸殘基所處的微環(huán)境發(fā)生改變，蛋白二級結(jié)構(gòu)β-折疊、α-螺旋向無規(guī)卷曲轉(zhuǎn)變。通過Autodock分子對接軟件獲取了最低能量匹配下的復合物，通過與其篩選出的線性表位進行比對，發(fā)現(xiàn)抑制率效果較好的P-1、P-3、P-B1與多酚有較多結(jié)合位點，這進一步證明了消減是多酚與α-淀粉酶抑制劑線性表位及其附近殘基相互作用的結(jié)果。研究結(jié)果可為小麥非麩質(zhì)致敏原表位鑒定、小麥非麩質(zhì)致敏原的消減方法以及制備酚類低敏互作物提供參考依據(jù)。