T-2毒素降解菌株的篩選、鑒定與降解機制分析

馬 妍，孫長坡，王 峻，杜 穩(wěn)，劉虎軍，周文化，趙一凡,*

（1.中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院，湖南 長沙 410004；2.國家糧食和物資儲備局科學研究院，北京 100037）

T-2毒素是由擬枝孢鐮刀菌、枝孢鐮刀菌、三線鐮刀菌等真菌產(chǎn)生的有毒次生代謝物[1]，屬于毒性最強的A類單端孢霉烯族毒素，主要污染燕麥、小麥、大麥、玉米等谷物和動物飼料[2]，隨之進入食物鏈對人畜的健康造成巨大危害。T-2毒素具有肝臟、消化、神經(jīng)、免疫和生殖毒性，可引起動物和人體肝細胞水腫、胃腸道潰瘍、腦膜出血、淋巴細胞壞死、妊娠率降低等癥狀[3-5]。由于T-2毒素的高毒性和污染廣泛性，如何控制與消除T-2毒素的危害受到學者們越來越多的關注。

目前，T-2毒素的脫毒方法主要有物理、化學和生物法，前兩者均能有效去除毒素，但存在損害營養(yǎng)物質(zhì)，引入新雜質(zhì)帶來二次污染的局限性[6-7]；生物法包括利用微生物產(chǎn)酶（或代謝物）降解毒素和吸附毒素兩種方式，具有綠色、安全、專一、高效等優(yōu)點，是近年來真菌毒素脫毒研究的熱點。微生物吸附具有可逆性會導致毒素分子重新釋放，限制其實際應用；微生物產(chǎn)生的酶可將毒素降解為其他低毒或無毒的產(chǎn)物，應用前景廣闊，因此國內(nèi)外學者對T-2毒素降解微生物展開了廣泛研究。向雨珂[8]從土壤中利用96 孔板高通量篩選出6 株T-2毒素脫毒菌株，通過質(zhì)譜對其中1 株氧化微桿菌（Microbacterium oxydans）的代謝產(chǎn)物進行了分析與推導；吳娛[9]以苯基環(huán)氧乙烷為底物篩選到1 株黑曲霉（Aspergillus niger），通過小鼠實驗證明了該菌株分泌的胞外酶能將T-2毒素降解為毒性較低的物質(zhì)；Fuchs[10]和Gao Xiaojuan[11]等從瘤胃液中分離的真桿菌（Eubacteriumsp.）BBSH797使T-2毒素部分降解為HT-2，并且能將T-2毒素的代謝產(chǎn)物（HT-2、T-2三醇、T-2四醇等）轉(zhuǎn)化為其脫環(huán)氧形式，該菌株是目前唯一一株被批量生產(chǎn)的脫毒菌劑?，F(xiàn)有研究主要集中于T-2毒素降解微生物的篩選、降解效果的表征以及降解產(chǎn)物的推導上，對降解機制的分析還有所欠缺，且菌株降解性能不穩(wěn)定、易退化等問題限制了大規(guī)模應用，生物降解T-2毒素的菌種資源仍然較為匱乏。

本研究從小麥樣品中分離篩選對T-2毒素具有降解性能的微生物，并進行菌種鑒定與降解特性研究，利用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-offlight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）儀分析2 株菌單獨和共同降解T-2毒素產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，從而分析其降解機制，以期降低谷物中T-2毒素的含量，為保障糧油食品和飼料質(zhì)量安全奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥樣品來源于安徽淮北、安慶等地區(qū)（2020年）。

甲醇、乙腈（均為色譜級）美國Thermo Fisher公司；T-2毒素、HT-2毒素、T-2三醇、新茄鐮孢菌醇（neosolaniol，NEO）標準品 北京Pribolab科技有限公司。

LB肉湯培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，固體培養(yǎng)基加20 g/L瓊脂；基礎鹽培養(yǎng)基（minimal salt medium，MSM）：硫酸銨0.5 g/L，七水硫酸鎂0.2 g/L，磷酸氫二鈉2.44 g/L，磷酸二氫鉀1.52 g/L，最后加氯化鈣0.05 g/L，pH 6.8；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）：氯化鈉8 g/L，氯化鉀0.2 g/L，十二水磷酸二氫鈉3.63 g/L，磷酸二氫鉀0.24 g/L，pH 7.4。

1.2 儀器與設備

Evolution 300紫外-可見分光光度計 美國Thermo Fisher公司；e2695型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀、2475型熒光檢測器、XBridge C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）美國Waters公司；UPLC-Q-TOF-MS儀 美國Agilent公司；VCX-130超聲波破碎儀 美國Sonics公司；真空離心濃縮儀 美國Labconco公司；C1000 Touch聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 T-2毒素脫毒菌株篩選

初篩：取10 g小麥樣品與20 mL生理鹽水混勻，靜置后取上清液50 μL與MSM（含3 μg/mL T-2毒素）于37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)7 d，HPLC檢測T-2毒素殘留量；具有降解效果的樣品梯度稀釋后涂布到LB固體培養(yǎng)基上，連續(xù)劃線純化至長出單菌落；挑取單菌落接種于MSM（含3 μg/mL T-2毒素），37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng) 5～7 d，HPLC檢測T-2毒素殘留量，脫除率大于90%的樣品進行復篩。

復篩：將初篩菌株單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，于37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)12～24 h，收集菌液于5 000 r/min離心5 min，菌體用MSM培養(yǎng)基洗滌2 次后重懸，菌懸液接種于MSM中（含3 μg/mL T-2毒素），37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)5～7 d，HPLC檢測T-2毒素殘留量。重復進行多次復篩，以驗證菌株對T-2毒素脫除效果的穩(wěn)定性。

1.3.2 T-2毒素脫毒菌株鑒定

形態(tài)鑒定：將獲得的菌株劃線于LB固體平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)12～48 h，觀察菌落形態(tài)；挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h，取適量菌液用草酸銨結晶紫溶液染色，在光學顯微鏡下觀察菌體特征。

分子鑒定：挑取少量單菌落作為16 SrDNA擴增的PCR 模板。引物采用細菌通用引物：27 F（5’-AGAGTTTGATCTGGCTCAG-3’）、1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）。PCR擴增體系（25 μL）：上下游引物各0.5 μL，TaqDNA聚合酶12.5 μL，無菌水11 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性10 min；95 ℃變性60 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，16S rDNA基因序列通過BLAST程序與GenBank中核酸數(shù)據(jù)比對進行同源性分析，采用MEGA7.0軟件中的Neighbor-joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 脫毒曲線測定

參考Zhai Yaoyao等[12]的方法并適當修改。挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)，收集發(fā)酵菌液于5 000 r/min離心5 min，菌體用PBS洗滌2 次后重懸，以初始OD600nm值0.1接種于LB液體培養(yǎng)基中（一組含5 μg/mL T-2毒素，一組無T-2毒素），于37 ℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)。每間隔2 h取樣，測定其OD600nm值并用HPLC檢測T-2毒素殘留量。

1.3.4 吸附作用分析與降解活性物質(zhì)定位

參考Chen Yong等[13]的方法。收集兩份發(fā)酵菌液，一份直接于5 000 r/min離心5 min，另一份121 ℃高壓滅活20 min后再離心，兩組菌體均用新的LB液體培養(yǎng)基重懸，菌懸液分別與5 μg/mL T-2毒素于37 ℃、200 r/min條件下共培養(yǎng)，含T-2毒素的LB液體培養(yǎng)基作為空白對照，HPLC檢測T-2毒素殘留量。

上述活細胞組將T-2毒素完全消除的時間點，收集剩余反應體系于5 000 r/min離心5 min，上清液過0.22 μm無菌濾膜即為胞外上清液；菌體用等體積PBS洗滌2 次后重懸，菌懸液通過超聲破碎儀進行細胞破碎，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，上清液過0.22 μm無菌濾膜為細胞內(nèi)容物；將它們分別與5 μg/mL T-2毒素于37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)2 h，含T-2毒素的PBS作為空白對照，HPLC檢測T-2毒素殘留量。

1.3.5 滅活與抑制劑對細胞內(nèi)容物降解T-2毒素的影響

參考Zhang Jing等[14]的方法。將上述獲得的細胞內(nèi)容物作如下處理：1）與1 mg/mL蛋白酶K、1%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）于55 ℃金屬浴中反應1 h；2）與1 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、1 mmol/L苯甲基磺酰氟（phenyl methane sulfonyl fluoride，PMSF）于37 ℃金屬浴中反應1 h；3）121 ℃高壓滅活30 min。取上述反應液分別與5 μg/mL T-2毒素于37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)2 h，含T-2毒素的PBS作為空白對照，HPLC檢測T-2毒素殘留量。

1.3.6 菌株AFJ-2和AFJ-3降解T-2毒素產(chǎn)物分析

粗酶液制備：收集發(fā)酵菌液于5 000 r/min離心5 min，菌體用PBS洗滌2 次后重懸，超聲波破碎儀對菌懸液進行破碎，12 000 r/min、4 ℃離心10 min，上清液過0.22 μm無菌濾膜得到胞內(nèi)粗酶液。

酶反應：1）AFJ-2和AFJ-3粗酶液分別與T-2毒素共培養(yǎng)；2）AFJ-2和AFJ-3粗酶液1∶1混勻后再與T-2毒素共培養(yǎng)；3）AFJ-2（AFJ-3）粗酶液先與T-2毒素共培養(yǎng)，在T-2毒素完全降解的時間點加入AFJ-3（AFJ-2）粗酶液，同時以加入等體積PBS作為對照。上述反應均以不加酶液含T-2毒素的PBS作為空白對照，T-2毒素終質(zhì)量濃度為10 μg/mL，37 ℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，不同時間取樣，質(zhì)譜檢測T-2毒素含量與產(chǎn)物生成。

1.3.7 T-2毒素檢測

1.3.7.1 HPLC

參照GB 5009.118—2016《食品中T-2毒素的測定》。樣品前處理：待測樣品于12 000 r/min離心10 min，取100 μL上清液，當培養(yǎng)基為MSM或PBS時，加入等體積甲醇混勻，取出100 μL于真空離心濃縮儀中蒸干，衍生，HPLC檢測；當培養(yǎng)基為LB時，加入等體積乙酸乙酯混勻，7 000 r/min離心5 min收集上清液，重復萃取3 次，合并上清液，于真空離心濃縮儀中蒸干，衍生，HPLC檢測。

T-2毒素標準曲線：以T-2毒素質(zhì)量濃度（1～5 μg/mL）為橫坐標，相對應的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得到一元回歸線性方程y=5×106x－120 373，R2=0.999 2，T-2毒素質(zhì)量濃度與峰面積的線性關系良好。T-2毒素降解率計算公式如下：

1.3.7.2 UPLC-Q-TOF-MS

色譜條件：色譜柱為Agilent Poreshell 120 EC-C18柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；流動相A為0.1%甲酸-5 mmol/L甲酸銨，流動相B為甲醇-0.1%甲酸；流動相梯度洗脫程序：0～1 min，0%～90% A、100%～10% B；1～1.5 min，90%～55% A、10%～45% B；1.5～8.5 min，55%～0% A、45%～100% B；8.5～9.5 min，維持0% A、100% B；9.5～10 min，0%～90% A、100%～10% B。流速0.3 mL/min；柱溫30 ℃；上樣量3 μL；Post Run 2 min。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源；正離子掃描；霧化氣壓力40 psi；干燥氣流速5 L/min；干燥氣溫度300 ℃；錐孔電壓65 V；碎裂電壓175 V；帽電壓4 000 V；質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 200（MS）、30～1 000（MS/MS）；采集速率2 spectra/s（MS）、3 spectra/s（MS/MS）；碰撞能量范圍10～40 eV。

樣品前處理：取待測樣品（12 000 r/min離心10 min上清液）100 μL加等體積甲醇混勻，質(zhì)譜檢測。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 T-2毒素脫毒菌株篩選

從50 份小麥樣品中篩選出30 份對T-2毒素具有脫毒效果的樣品，分離純化得到48 種單菌落，其中10 株菌對T-2毒素的脫除率大于90%，對其進行多輪復篩后，獲得2 株脫毒效率高且穩(wěn)定的菌株AFJ-2和AFJ-3，復篩結果如表1所示。

表1 T-2毒素脫毒菌株復篩結果Table 1 Secondary screening results of T-2 toxin-degrading strains

2.2 T-2毒素脫毒菌株鑒定

菌株AFJ-2和AFJ-3經(jīng)16S rDNA初步鑒為短小桿菌屬（Curtobacteriumsp.）和芽孢桿菌屬（Bacillussp.）菌株。菌株AFJ-2在LB上呈較小的黃色圓形，菌落不透明，邊緣不整齊，顯微鏡下呈現(xiàn)短桿狀，單個或成對排列；菌株AFJ-3在LB上呈光滑的乳白色圓形，形狀較大，菌落不透明，邊緣光滑，顯微鏡下呈現(xiàn)粗大桿狀，單個或短鏈排列。AFJ-2和AFJ-3的形態(tài)學和系統(tǒng)發(fā)育特征如圖1所示。

圖1 菌株AFJ-2和AFJ-3的形態(tài)學和系統(tǒng)發(fā)育特征Fig.1 Morphological and phylogenetic characteristics of strains AFJ-2 and AFJ-3

2.3 菌株AFJ-2和AFJ-3對T-2毒素的降解特性

2.3.1 脫毒曲線

以初始OD600nm=0.1將菌株AFJ-2和AFJ-3接種至含（無）T-2毒素的LB培養(yǎng)基中，觀察2 株菌的生長狀況、T-2毒素的脫毒過程以及T-2毒素對菌株生長的抑制效果。如圖2所示，菌株AFJ-2和AFJ-3分別在2～12 h和6～14 h內(nèi)呈對數(shù)生長，T-2毒素質(zhì)量濃度隨著菌體密度快速增加而迅速減少，分別在7 h和12 h將5 μg/mL T-2毒素完全消耗，因此2 株菌對T-2毒素的脫除效率較高，而在12 h和14 h菌株生長才進入穩(wěn)定期，說明菌株優(yōu)先利用T-2毒素作為碳源以供生長需要。AFJ-2的生長未受T-2毒素毒性作用的影響，但AFJ-3的生長受到明顯抑制，故其脫毒效率低于AFJ-2。T-2毒素可通過抑制微生物細胞蛋白質(zhì)、RNA和DNA的合成，從而影響菌體生長繁殖[15]。

圖2 菌株AFJ-2（A）和AFJ-3（B）脫毒曲線Fig.2 Time courses of T-2 toxin degradation by strains AFJ-2 (A) and AFJ-3 (B)

2.3.2 菌株AFJ-2和AFJ-3對T-2毒素的吸附作用

將2 株菌菌體的活細胞與滅活細胞與T-2毒素共培養(yǎng)，觀察其對T-2毒素的降解與吸附能力。由圖3可知，當菌株AFJ-2和AFJ-3的活細胞與T-2毒素反應時，T-2毒素質(zhì)量濃度隨著培養(yǎng)時間延長逐漸降低，分別在2 h和12 h內(nèi)將T-2毒素從5 μg/mL降至0.16 μg/mL和0.11 μg/mL，而滅活細胞對T-2毒素不產(chǎn)生任何作用。因此2 株菌對T-2毒素的脫除均屬于生物降解，且不存在吸附作用。

圖3 菌株AFJ-2（A）和AFJ-3（B）對T-2毒素的吸附Fig.3 Adsorption efficiency of T-2 toxin by strains AFJ-2 (A) and AFJ-3 (B)

2.3.3 T-2毒素降解活性物質(zhì)定位

為了進一步確定2 株菌降解T-2毒素的活性物質(zhì)位于胞內(nèi)或胞外，將胞外上清液和細胞內(nèi)容物與T-2毒素反應2 h后檢測T-2毒素含量，結果如圖4所示，菌株AFJ-2和AFJ-3的胞外上清液對T-2毒素幾乎不降解，而細胞內(nèi)容物在2 h內(nèi)分別使T-2毒素質(zhì)量濃度從5 μg/mL減少至0.24 μg/mL和1.16 μg/mL，反應效率極高。因此，2 株菌降解T-2毒素的活性物質(zhì)均位于胞內(nèi)，并且很可能是一種或多種酶。

圖4 菌株AFJ-2（A）和AFJ-3（B）降解活性物質(zhì)定位Fig.4 Localization of T-2 toxin-degrading substance in strains AFJ-2 (A) and AFJ-3 (B)

2.3.4 滅活與抑制劑對細胞內(nèi)容物降解T-2毒素的影響

滅活、蛋白酶K、SDS和PMSF均能破壞蛋白質(zhì)的結構使酶變性失活，通過上述處理后的細胞內(nèi)容物與T-2毒素反應2 h后，測定其含量并計算降解率，結果如圖5所示，2 株菌的細胞內(nèi)容物對T-2毒素的降解均受到顯著抑制（P＜0.05），由此證明的確是酶發(fā)揮了作用，且PMSF的顯著抑制效果說明T-2毒素降解酶系統(tǒng)中含有絲氨酸基團[16]。而EDTA僅表現(xiàn)出輕微抑制效果，可能是濃度偏低或反應時間較短的原因，已有研究[17-19]使用的EDTA濃度均超過10 mmol/L，向雨珂等[20]使用1 mmol/L EDTA處理胞外上清液，需反應24 h才觀察到上清液對T-2毒素降解的抑制作用。

圖5 滅活與抑制劑對AFJ-2（A）和AFJ-3（B）細胞內(nèi)容物降解T-2毒素的影響Fig.5 Effect of inactivators and inhibitors on the degradation of T-2 toxin by cellular contents of AFJ-2 (A) and AFJ-3 (B)

2.4 T-2毒素降解產(chǎn)物分析

2.4.1 菌株AFJ-2降解T-2毒素產(chǎn)物分析

采用UPLC-Q-TOF-MS分析菌株AFJ-2降解T-2毒素的產(chǎn)物，總離子流圖如圖6A～D所示，T-2毒素（保留時間（retention time，tr）=7.1 min）隨時間遞增而減少，4 h即被完全降解，未知峰a（tr=6.5 min）先大量增加后略微減少，未知峰b（tr=5.8 min）在反應后期緩慢增加，因此二者均為T-2毒素轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物。

圖6 菌株AFJ-2降解T-2毒素產(chǎn)物分析Fig.6 Analysis of degradation products of T-2 toxin by strain AFJ-2

利用軟件Mass Hunter搜索所有可能化合物，與軟件PCDL中T-2毒素常見代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫進行比對。產(chǎn)物a、b的匹配結果為HT-2（C22H32O8）、T-2三醇（C20H30O7），m/z分別為447.204 4[＋Na]、405.189 0[＋Na]，與T-2毒素（489.215 1[＋Na]）依次相差42，等于一個乙?；鵞—COCH3]的相對分子質(zhì)量，且化學結構與T-2毒素依次在C-4和C-15位相差一個乙?；鶊F。

采用40 eV的碰撞能量，對產(chǎn)物a、b與HT-2、T-2三醇標準品溶液進行二級質(zhì)譜分析，結果如圖6E～H所示，二級質(zhì)譜圖中tr、碎片離子的分布和相對豐度三者基本吻合，可以確定產(chǎn)物a、b分別是HT-2、T-2三醇。

2.4.2 菌株AFJ-3降解T-2毒素產(chǎn)物分析

采用UPLC-Q-TOF-MS分析菌株AFJ-3降解T-2毒素的產(chǎn)物，如圖7A～D所示，T-2毒素（tr=7.0 min）在12 h被完全降解，而此時觀察到未知峰c（tr=4.0 min）大量增加。通過軟件Mass Hunter和PCDL分析，產(chǎn)物c的匹配結果為NEO（C19H26O8），m/z為405.152 8[＋Na]，與T-2毒素相差84，等于一個異戊?；鵞—CH3CCH3CH2CO]的相對分子質(zhì)量，化學結構與T-2毒素在C-8位相差一個異戊酰基。通過對產(chǎn)物c和NEO標準品溶液的二級質(zhì)譜圖分析，可以確定產(chǎn)物c是NEO，結果見圖7E、F。

圖7 菌株AFJ-3降解T-2毒素產(chǎn)物分析Fig.7 Analysis of degradation products of T-2 toxin by strain AFJ-2

2.4.3 菌株AFJ-2和AFJ-3共同降解T-2毒素產(chǎn)物分析

菌株AFJ-2和AFJ-3粗酶液混合后與T-2毒素反應，利用Mass Hunter分析產(chǎn)物變化規(guī)律，通過m/z提取總離子流圖中各產(chǎn)物峰并積分可獲得其峰面積，用來代表降解產(chǎn)物的相對含量，結果如圖8A所示。2 株菌單獨作用的產(chǎn)物HT-2、T-2三醇和NEO都存在，單獨作用下HT-2和NEO大量生成后維持不變（數(shù)據(jù)未顯示），而共同作用時它們大量生成后均存在下降趨勢。同時，發(fā)現(xiàn)新的產(chǎn)物X隨時間延長大量增加，因此產(chǎn)物X可能是HT-2和NEO繼續(xù)發(fā)生轉(zhuǎn)化生成的產(chǎn)物。通過軟件分析產(chǎn)物X匹配結果為4-脫乙酰-NEO或8-乙酰-T-2四醇或15-脫乙酰-NEO，3 種物質(zhì)為同分異構體，僅側(cè)鏈烷基的位置不同。

圖8 菌株AFJ-2和AFJ-3共同降解T-2毒素產(chǎn)物分析Fig.8 Analysis of co-degradation products of T-2 toxin by strains AJ-2 and AFJ-3

通過不同時間先后加入AFJ-2和AFJ-3粗酶液分析產(chǎn)物X。如圖8B所示，在AFJ-2將T-2毒素完全降解的時間點（圖中虛線處）加入AFJ-3的粗酶液，HT-2開始呈現(xiàn)下降趨勢，也出現(xiàn)了產(chǎn)物X隨時間緩慢大量增加，因此認為產(chǎn)物X是HT-2減少轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物。同理可得，如圖8C所示，AFJ-3將T-2毒素完全降解時加入AFJ-2粗酶液，NEO開始減少，產(chǎn)物X緩慢大量增加，因此產(chǎn)物X也是NEO減少轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物。

根據(jù)上述實驗結果推斷，如圖9所示，AFJ-2能夠以AFJ-3降解T-2毒素產(chǎn)生的NEO為底物，使其脫去C-4乙?；兂僧a(chǎn)物X；AFJ-3能夠以AFJ-2降解T-2毒素產(chǎn)生的HT-2為底物，使其脫去C-8異戊?；兂僧a(chǎn)物X；結合降解位點和化學結構推測產(chǎn)物X為4-脫乙酰-NEO。據(jù)文獻報道，HT-2、T-2三醇和NEO的毒性均低于T-2毒素，毒性大小依次為T-2＞HT-2＞T-2三醇＞NEO[21-23]。至今未有4-脫乙酰-NEO毒性作用的詳細報道，根據(jù)其烷基側(cè)鏈僅剩一個乙?；鶊F推測，4-脫乙酰-NEO的毒性低于上述3 種產(chǎn)物。

圖9 菌株AFJ-2和AFJ-3對T-2毒素的降解機制Fig.9 Degradation mechanism of T-2 toxin by strains AFJ-2 and AFJ-3

3 討論與結論

作為毒性最強的單端孢霉烯族毒素、T-2毒素可導致亞致死性或致死性中毒，嚴重威脅人類和動物的生命健康。相較于傳統(tǒng)的物理、化學脫毒法，生物法具有高效、專一、安全的特點，篩選降解微生物是控制T-2毒素污染的一項有效措施。早在20世紀80年代，Ueno等[24]從土壤中發(fā)現(xiàn)了短小桿菌114-2能將T-2毒素轉(zhuǎn)化為HT-2和T-2三醇；本研究中菌株AFJ-2的降解途徑與Uneo的研究結果一致，并進一步結合芽孢桿菌AFJ-3共同降解T-2毒素，獲得了新的產(chǎn)物4-脫乙酰NEO，同時這也是首次明確芽孢桿菌屬菌株降解T-2毒素的代謝產(chǎn)物。迄今為止，國內(nèi)外報道了多種微生物能夠降解T-2毒素，而AFJ-2和AFJ-3在降解性能方面表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢：Hassan等[25]在草莓醬中發(fā)現(xiàn)巨大芽孢桿菌344-1在44 h內(nèi)僅去除78%的T-2毒素（0.6 μg/mL）；施琦[26]從自然環(huán)境中篩選的彎曲假單胞菌和尼泊爾葡萄球菌，72 h對5 ng/mL T-2毒素的降解率分別為90.9%和85.5%；黑曲霉7 d內(nèi)對5 μg/mL T-2毒素的降解率僅為69.8%[9]。本研究中AFJ-2和AFJ-3分別在7 h和12 h內(nèi)能夠去除99.9%的T-2毒素（5 μg/mL），降解效率均高于上述菌株，具有很大的應用潛力。

降解產(chǎn)物的安全性是決定降解菌株實際應用價值的重要指標之一。本研究中降解產(chǎn)物HT-2、T-2三醇、NEO和4-脫乙酰NEO均由T-2毒素水解側(cè)鏈烷基酯鍵產(chǎn)生，而側(cè)鏈烷基的數(shù)量與位置與T-2毒素的毒性息息相關[27-29]。C-4位取代基可抑制多肽鏈的延伸和終止[30]，研究表明，T-2毒素會優(yōu)先脫去C-4乙?；a(chǎn)生HT-2，但HT-2與T-2毒素毒性相差不大[31-32]；當C-15和C-4位均存在較大基團時，會抑制蛋白質(zhì)合成的起始階段，且C-4至C-15之間的大環(huán)（烴鏈）本身也具有毒性作用[27,30]，因此T-2毒素轉(zhuǎn)化為T-2三醇后毒性降低99.64%[33]；C-8位異戊?；挠H脂性使T-2毒素更易滲透到生物體，當C-8異戊?；蝗〈蒒EO時，對小鼠淋巴瘤細胞的毒性顯著降低了91%[27,30]。由上述研究可知，本研究中代謝產(chǎn)物的毒性均低于T-2毒素。通過降解位點推測出共代謝產(chǎn)物4-脫乙酰-NEO，由于目前市場上無標準品出售，未能通過二級質(zhì)譜分析對它進行鑒定，根據(jù)側(cè)鏈基團缺失的數(shù)量與位置推測其毒性低于另外3 種產(chǎn)物，但它的毒性機制尚不清晰。

多項研究表明，T-2毒素的水解過程主要由羧酸酯酶參與。大鼠肝微粒體中T-2毒素被代謝為HT-2，由特定酶抑制劑鑒定出是絲氨酸羧基酯酶的作用[34]，這與本研究中利用抑制劑PMSF得出T-2毒素降解酶中含有絲氨酸基團的結論一致；Johnsen[35]和Lin Nini[36]等同樣采用酶抑制劑的方法，證明了人類血細胞和肝微粒體中的羧酸酯酶對T-2毒素具有水解作用；Lattanzio等[37-38]從玉米中純化出具有酯酶活性的蛋白部分，該蛋白提取物能在90 min內(nèi)將5 μg T-2毒素完全轉(zhuǎn)化為HT-2。酶法降解真菌毒素具有顯著的優(yōu)勢，但T-2毒素降解酶的鑒定至今未取得突破。根據(jù)本研究中的產(chǎn)物類型可知，菌株AFJ-2和AFJ-3產(chǎn)生的T-2毒素降解酶屬于羧酸酯酶類，后續(xù)可借助分子生物學、蛋白質(zhì)組學等手段，對該降解酶進行分離純化。

本研究從小麥樣品中分離獲得2 株T-2毒素高效降解菌株AFJ-2和AFJ-3，由16S rDNA初步鑒定為短小桿菌屬和芽孢桿菌屬菌株。AFJ-2和AFJ-3分別能在7 h和12 h內(nèi)將5 μg/mL T-2毒素完全降解；明確了2 株菌對T-2毒素的降解來源于細胞內(nèi)產(chǎn)生的酶，不存在吸附作用；滅活與抑制劑（蛋白酶K、SDS和PMSF）處理會顯著抑制胞內(nèi)酶對T-2毒素的降解效果。菌株AFJ-2和AFJ-3分別將T-2毒素降解為低毒產(chǎn)物HT-2、T-2三醇和NEO，推測它們共同降解T-2毒素能產(chǎn)生新的產(chǎn)物4-脫乙酰-NEO，且AFJ-3能以HT-2為底物（AFJ-2能以NEO為底物）生成4-脫乙酰-NEO。本研究獲得的微生物資源對T-2毒素的污染防控與酶制劑的開發(fā)應用具有重要意義。